李建荣[1]2001年在《传染性法氏囊病病毒基因免疫的研究》文中研究表明传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的急性接触性传染病，是危害世界养禽业的主要传染病之一。IBDV主要侵害雏鸡的中枢免疫器官—法氏囊，导致免疫抑制。用弱毒苗和灭活苗免疫鸡群是目前防治IBD的主要方法，但随着IBDV变异株与超强毒株的出现，免疫失败常有发生。本文对IBDV基因免疫进行研究，期望为IBD的防治提供新的途径。 从浙江省杭州、嵊州，宁波等地暴发疑似传染性法氏囊病的鸡群中采集法氏囊病料(编号分别为ZJ2000、ZJ991、ZJ992)，分离病毒，经琼脂免疫扩散试验、动物回归试验、鸡胚回归试验和电镜观察等证实所分离的3株野毒是传染性法氏囊病病毒。 分别以传染性法氏囊病病毒ZJ2000株(野毒株)和JD1株(弱毒株)基因组dsRNA为模板，采用Long-accurate RT-PCR(LA-PCR)一步法扩增并克隆了两株病毒的基因组A节段全长cDNA。序列测定结果表明，两株病毒的基因组A节段全长共3259个核苷酸，包括5’、3’端的非编码区(NCR)和两个部分重迭的开放阅读框(ORF1和ORF2)。两株病毒的5’-NCR和3’-NCR与所有参比毒株一样高度保守，二级结构预测表明存在一个倒置“π”型的茎环发夹结构；ORF2编码145个氨基酸的VP5，与其他毒株的同源性达98.6％-100％，与K310、Cu-1、P2、CEF94等毒株完全相同；ORF1编码1012个氨基酸的多聚蛋白(VP2／VP4／VP3)，与Cu-1、P2、CEF94等毒株高度同源，并具有253H、279N、284T、330G等弱毒株或能直接细胞适应的强毒株的特征性氨基酸。JD1株在决定其抗原性的大小两个亲水区内高度保守，而ZJ2000株第二个小亲水区内280位氨基酸由S替代了N、290位L替代了M，这两个突变可能与ZJ2000株的抗原漂移和毒力变异有关。虽然JD1株和ZJ2000株序列高度同源，VP2内七肽区完全相同，但毒力表型完全不同，提示VP2七肽区并非是决定毒力的唯一因素。VP4蛋白酶活性位点附近540R的突变以及VP2-VP4剪切位点511R的突变，可能影响了多聚蛋白前体的剪切和加工使ZJ2000株的毒力增强。分子系统进化树分析表明，ZJ2000株和JD1株与Cu-1、P2、CEF94、Harbin等毒株的关系最近，而与欧洲、香港、日本的超强毒株和美国的变异株相对较远。 将IBDV-ZJ2000株和JD1株的多聚蛋白(VP2／VP4／VP3)基因和主要宿主保护性抗原(VP2)基因分别克隆入两种不同的真核表达载体pCI和pcDNA3，构建成两个毒株的 浙江大学博士学位论文：传染性祛氏囊病病毒基因免疫的b）f3t 摘要 ZJ2000株的pCIN 经纯化后，Lipofectin介导下转染Vero细胞，分别提取细胞 总DNA和总pA，DIG标记探针均可检测到阳性杂交信号。FITC标记的羊抗鸡IgG进行 间接免疫荧光试验可检测到特异性的黄绿色荧光。ELISA检测多聚蛋白的表达动力学表明转 染后72h表达的蛋白活性最强。结果表明pCIVPZ／VP4／VP3不仅重组到Vero细胞中，而且 得到了转录表达，表达的蛋白具有兔疫反应性。 以免疫刺激复合物（ISCOM）为佐剂分别制备ZJ2000和们 株的PCI－VPZ／VP4／VP3、 pCDNA3－VPZ／VP4／VP3、pCI－VPZ、pCDNA3－VPZ等8种DNA疫苗，接种14日龄非免疫来 杭鸡，28日龄二兔，二免后14天，攻击标准强毒株BC6／85，进行免疫原性筛选。结果表明： 编码多聚蛋白的表达载体能诱导较高水平的中和抗体并能提供对强毒的免疫保护；编码VPZ 基因的DNA疫苗仅能诱导很低水平的中和抗体，几乎不能提供免疫保护；以pCI为表达载 体的免疫效果优于 pCDNA3：源于 ZJ2000株基因构建成的 DNA疫苗诱导的免疫反应优于 JD 株。肌肉、皮内、肌肉皮内联合、静脉、腹腔、口服和点眼等7种途径均能不同程度诱导免 疫效果，其中以肌肉皮内联合免疫法效果最好，肌肉、皮内免疫次之，而口服、点眼途径最 差。低剂量的＊＊A疫苗＊50阴）不能产生足够的免疫力，20o叱的剂量为＊＊A疫苗的最 佳免疫剂量。以上结果说明IBDV多聚蛋白DNA疫苗具有良好的免疫原性，其最佳免疫方 案是：使用ZJ2000株的pCI－VPZ／VP4／VP3质粒，以ISCOM为佐剂制备DNA疫苗，最佳的 免疫剂量为 200pg／鸡，最佳的免疫途径为肌肉和皮下联合免疫法。 比较了DNA疫苗和两种常用的弱毒苗（B87、D78）的安全性和免疫效力。结果表明 DNA疫苗对雏鸡安全可靠，但弱毒苗对雏鸡有一定的毒力。虽然DNA疫苗产生中和抗体的 潜伏期相对较长、效价相对较低，但对强毒株BC6／85的攻击保护率与两种常用的弱毒苗 （B87、D78）相当，可能的原因是DNA疫苗同时诱导了鸡体的体液免疫和细胞免疫功能， 而且ISCOM增强了DNA疫苗免疫效果。DNA疫苗对BC6／85、ZJ2000、ZJ991等3株强毒 株具有良好的免疫保护效果，平均保护率达83．33％；弱毒苗B87虽对BC6／85株具有良好的 保护，但对ZJ991株、ZJ2000株的攻击不理想，平均保护率仅达60％。上述结果说明IBDV DNA疫苗不仅安全可靠，并且对不同强毒株具有良好的交叉保护效果。
李建荣, 于涟, 黄耀伟, 梁雪芽, 孟松树[2]2002年在《ISCOM介导的传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因免疫的研究》文中认为将传染性法氏囊病病毒(IBDV)ZJ2000株的多聚蛋白(VP2/VP4/VP3)基因插入pCI质粒的CMV启动子下游.构建了真核表达质粒pCI-VP2/VP4/VP3.在lipofectin介导下转染Vero细胞进行了多聚蛋白的瞬时表达。以免疫刺激复合物(ISCOM)为佐剂制备DNA疫苗.进行不同免疫剂量间、不同免疫途径间、一次免疫和二次免疫间的效果对比试验。结果表明:以肌肉和皮下联合免疫法效果最好.而口服和点眼等途径未能诱导足够的免疫反应;大于200μg的剂量DNA疫苗才能产生良好的免疫力;二次免疫的效果明显优于一次免疫。与常规的弱毒苗B87和D78相比.DNA疫苗产生中和抗体的潜伏期长、效价相对较低.对强毒攻击的保护率相当。本试验还证实ISCOM具有明显提高DNA疫苗免疫效果的作用。DNA疫苗能诱导产生保护性反应为今后IBD疫苗的研究开创了一条新的途径。
马金荣[3]2012年在《传染性法氏囊病病毒VP2与C3d串联基因重组表达质粒的构建及其免疫功能分析》文中研究指明传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease, IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)引起的起的鸡的一种高度接触性传染病,以侵害雏鸡法氏囊损伤为主要特征的传染病。鸡孵出后3-6周,法氏囊发育成熟,此时是IBDV的易感期。鸡感染IBDV后,机体出现免疫抑制,IBDV在法氏囊的B淋巴细胞中繁殖同时损伤B淋巴细胞,导致疫苗免疫接种失败和继发感染的发生,造成动物死亡。预防该病最有效的方法是接种疫苗,但是毒株的变异和强毒株的出现造成免疫失败。目前,针对IBD的疫苗有活疫苗和灭活疫苗,前者因不同IBDV毒株之间潜在着基因重配的可能,使其存在着较大的生物安全问题,给该病的防控带来隐患；而灭活疫苗有制备困难以及免疫效果低下等问题。因此,此病仍然流行,对养鸡业造成严重的经济损失。为此,当前禽病防控工作中亟待解决的重要课题为研制新型IBDV基因工程疫苗,提高免疫效力。本研究内容包括以下叁个部分：试验1：传染性法氏囊病病毒VP2与C3d串联基因重组表达质粒的构建及其在真核细胞中的表达为了提高传染性法氏囊病病毒(IBDV) VP2基因核酸疫苗的免疫效力,根据已发表的鸡源C3d序列,设计在5’端添加连接肽(Gly4Ser)2序列的C3d基因,合成并克隆到pUC57载体中。用同尾酶BglⅡ和BamHⅠ构建含有1-3拷贝C3d的重组表达质粒pcDNA-C3d、pcDNA-2C3d、pcDNA-3C3d,将IBDV VP2基因定向插入到1-3拷贝C3d基因的3’端,获得含VP2与1-3拷贝C3d串联基因的重组真核表达质粒pcDNA-VP2-C3d、pcDNA-VP2-2C3d、pcDNA-VP2-3C3d。将3种质粒用脂质体法转染BHK21细胞,间接免疫荧光试验(IFA)检测,均具有特异性荧光,用蛋白免疫印迹(Western blot)分析,pcDNA-VP2-C3d转染后出现一条分子量约84ku的蛋白带,与VP2-C3d重组蛋白的分子量理论值相符合；pcDNA-VP2-2C3d转染后出现一条分子量约124ku的蛋白带,与VP2-2C3d重组蛋白的分子量理论值相符合；pcDNA-VP2-3C3d转染后出现一条分子量约162ku的蛋白带；与VP2-3C3d重组蛋白的分子量理论值相符合,表明VP2与含有不同拷贝C3d的重组表达质粒均能够并在真核细胞中正确表达,为研制以鸡补体C3d为分子佐剂的免疫增强型IBD VP2基因核酸疫苗奠定了基础。试验2：分子佐剂C3d对鸡传染性法氏囊病病毒VP2核酸疫苗的免疫功能的影响为了研究不同拷贝分子佐剂c3d对IBD VP2基因免疫功能的影响,本实验将pcDNA-VP2、pcDNA-VP2-C3d、pcDNA-VP2-2C3d、pcDNA-VP2-3C3d与空载体分别免疫SPF鸡,14日龄首免,免疫两次,间隔两周,二免后14d用IBDV标准强毒株Bc6/85攻击。二免后14d,ELISA方法测其抗体效价,pcDNA-VP2-3C3d、 pcDNA-VP2-2C3d诱导的抗体水平显着高于pcDNA-VP2组；中和试验检测抗IBDV血清中和效价,pcDNA-VP2-3C3d组效价显着高于pcDNA-VP2组,pcDNA-VP2-C3d、pcDNA-VP2-2C3d组效价高于pcDNA-VP2组差异不显着；硫氰酸盐洗脱法检测抗体亲和力水平,pcDNA-VP2-3C3d的抗体亲和力指数为高于pcDNA-VP2、pcDNA-VP2-C3d、pcDNA-VP2-2C3d诱导的抗体亲和力；MTT法检测淋巴细胞增殖水平,pcDNA-VP2-3C3d诱导的刺激指数显着高于pcDNA-VP2组,pcDNA-VP2-C3d、pcDNA-VP2-2C3d诱导的刺激指数高于pcDNA-VP2组,但差异不显着(p<0.05)。攻毒后4,5d出现死亡,攻毒空质粒及空白对照鸡全部发病死亡。pcDNA-VP2-3C3d、pcDNA-VP2-2C3d、pcDNA-VP2-C3d、pcDNA-VP2组的免疫保护率分别为70.0%,63.33%,56.67%,46.67%。pcDNA-VP2-3C3d、pcDNA-VP2-3C3d组的免疫保护率显着高于pcDNA-VP2组,pcDNA-VP2-2C3d、pcDNA-VP2-C3d组的免疫保护率均高于pcDNA-VP2组差异不显着(p<0.05)。结果说明,分子佐剂C3d提高了VP2基因疫苗诱导的抗体水平,加速了抗体亲和力成熟,促进细胞免疫的增强,并可部分抵抗IBDV强毒BC6/85的攻击。1～3拷贝的c3d均可不同程度地增加VP2基因核酸疫苗的免疫效果,其中3拷贝分子佐剂C3d的免疫增强能力最显着。试验3：聚乙烯亚胺介导的pcDNA-VP2-3C3d重组真核表达质粒免疫效果聚乙烯亚胺(polyethylenimine, PEI)是一种新型阳离子多聚物基因释放载体,可结合浓缩DNA,通过粘附内吞,进入细胞,使携带的质粒表达。为了进一步提高pcDNA-VP2-3C3d的免疫效果,pcDNA-VP2-3C3d与PEI分别按4、6、8、10的NH4+/PO3-比州/P)混合,命名为VP2-3C3d-4、VP2-3C3d-6、VP2-3C3d-8、VP2-3C3d-10免疫组,分别免疫SPF鸡,免疫两次。二免后14d用IBDV标准强毒株BC6/85攻击。ELISA方法测其抗体效价,二免后14d,VP2-3C3d-4免疫组的特异性抗IBDV水平与pcDNA-VP2-3C3d组相同；N/P值为6和8的免疫组的抗体效价显着高于pcDNA-VP2-3C3d组；N/P值为10的抗体效价低于pcDNA-VP2-3C3d组(p<0.05)。中和试验检测中和效价,结果与ELISA方法测得结果一致。二免后14d用IBDV标准强毒株BC6/85攻击,VP2-3C3d-4、VP2-3C3d-6、VP2-3C3d-8、 VP2-3C3d-10、pcDNA-VP2-3C3d组存活率分别达到66.67%、90.00%、93.33%、60.00%、77.33%,VP2-3C3d-6、VP2-3C3d-8组存活率显着高于pcDNA-VP2-3C3d组(p<0.05)。攻毒空质粒及空白对照组攻毒后鸡全部发病死亡。结果表明PEI能提高pcDNA-VP2-3C3d的免疫效力。
秦爱建, 刘红梅, 许小琴[4]2005年在《免疫增强剂对鸡传染性法氏囊病基因免疫的增强作用》文中进行了进一步梳理传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)引起的鸡和火鸡的一种高度接触性传染病。近年来,由于IBDV超强毒株和变异株的流行,导致病毒致病力的改变及宿主对疫苗应答的改变,使得传统的疫苗难以控制其流行。基因疫苗由于兼有重组亚单位苗的安全性和减毒活疫苗诱导全方位免疫应答能力,在病毒感染性疾病中有广阔的应用前景。本研究利用从江苏某地分离的经生物学试验证实为IBDV超强毒株的JS株为模板,利用RT-PCR方法扩增出宿主保护性抗原VP2基因,并进行了序列分析,将VP2基因克隆人真核表达载体pcDNA3.1/zeo(+),构建成功真核表达质粒pcD-VP2。利用pcD-VP2质粒进行动物免疫实验,初免后14日血清抗体检测结果经SPSS统计软件数据分析显示:中等毒力活疫苗组和免疫增强剂CpG—Rgl+pcD-VP2组能刺激机体产生特异性抗体,抗体水平与对照组差异极显着,免疫增强剂组与单pcD-VP2组间亦存在显着性差异,而单pcD—VP2组和生理盐水对照组及pcDNA3.1空转质粒组相互间没有显着差异,证明免疫增强剂可以明显增强VP2基因诱导鸡产生特异性抗体水平和速度。二免后14日血清抗体检测结果经SPSS统计软件数据分析显示,免疫增强剂CpG-Rgl+pcD-VP2组、中等毒力活疫苗组和pcD-VP2组均能诱导机体产生特异抗体,与空白对照组存在显着性差异,但免疫增强剂CpG-Rgl+pcD-VP2组诱导产生的抗体水平显着高于中等毒力活疫苗组和单pcD-VP2组,中等毒力活疫苗组和单pcD-VP2组诱导机体产生的抗体水平没有差异。IBDV超强毒病毒JS株攻毒实验结果表明,pcD-VP2质粒免疫组的强毒攻击保护率达到67%,加免疫增强剂CpG—Rgl佐剂组的保护率与中等毒力活疫苗免疫的保护率相等,都高达到92%,与生理盐水组和pcDNA3.1空转质粒组差异极显着,这些结果证明VP2基因免疫能提供机体产生免疫保护作用,特别是在免疫增强剂的应用后,基因免疫的保护效果达到很高水平,且抗体水平较活疫苗组产生快,因此,结合免疫增强剂来开发基因工程疫苗将是今后的发展趋势。
李龙[5]2006年在《传染性法氏囊病病毒VP5缺失减毒株的构建》文中指出传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的急性接触性传染病,是危害世界养禽业的主要传染病之一。IBDV主要侵害3-8周龄雏鸡的中枢免疫器官法氏囊,破坏带有sIgM的B淋巴细胞,引起脾脏、胸腺及外周血液淋巴细胞的凋亡,导致以淋巴细胞衰竭坏死为主要特征的免疫缺陷性和免疫抑制性疾病。 通过易感动物雏鸡,构建了一株传染性法氏囊病病毒基因组节段杂合病毒。应用PCR定点突变方法,在IBDV野毒株ZJ2000株A节段2366-2371nt引入沉默突变NaeI后,克隆入真核表达载体pCI,获得pCI-AKZJ2000,分别制备pCI-AKZJ2000、以及含有细胞致弱疫苗株HZ2株A和B节段全长的真核表达载体pCI-AKHZ2和pCI-mBHZ2的超纯质粒。不同组合的上述质粒(pCI-AKZJ2000/pCI-mBHZ2和pCI-AKHZ2/pCI-mBHZ2),在脂质体介导下,肌肉途径分别注射雏鸡。通过血清抗体、病毒抗原和病毒粒子检测、鸡胚传代试验、以及分子遗传标记鉴定,表明从鸡体内拯救出了杂合病毒rAKZJ/HZ和重组病毒Xihu2002株。本试验为IBDV的反向遗传系统提供了一个新策略,尤其是对于不能适应细胞的IBDV强毒株的拯救。结果还提示IBDV基因组B节段序列对病毒毒力具有重要作用,为研究VP1蛋白在病毒复制和致病中的作用提供了思路。 制备了兔抗IBDV VP5多克隆抗体。利用RT-PCR技术从IBDV地方分离株TL2004株感染鸡胚尿囊液中扩增到VP5基因,进而构建了T7启动子控制下的N端GST-Tag融合表达质粒pGEX-VP5。序列测定表明VP5基因全长438bp,编码一个由145个氨基酸组成的VP5蛋白。将pGEX-VP5转化大肠杆菌BL21,在IPTG的诱导下高效表达了GST-VP5融合蛋白(44kD)。通过包涵体纯化的方法,获得的较高纯度的融合蛋白,免疫新西兰兔,Western blot和ELISA分析表明,制备的融合蛋白抗血清效价在1:12800以上,并具有良好的免疫反应性,为进一步研究VP5在IBDV复制与致病中的作用,以及IBDV VP5基因缺失病毒打下了良好的基础。 在上述基础上,进而探索了VP5基因序列及编码蛋白对IBDV复制的影响。通过PCR定点突变方法,将IBDV HZ2株A节段ORF A2(VP5)起始密码子
刘红梅[6]2005年在《鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的表达及其重组马立克氏病毒的构建》文中指出鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的鸡和火鸡的一种高度接触性传染病。该病主要侵害3～12周龄的雏鸡与青年鸡,破坏法氏囊中的B淋巴细胞,导致不同程度的免疫抑制,从而使病鸡增加对并发和继发性病毒和细菌感染的易感性。近年来,由于IBDV超强毒株和变异株的流行,导致病毒致病力的改变及宿主对疫苗应答的改变,使得传统的疫苗已不能控制其流行,因此,发展更为有效、安全的新型疫苗已成为迫切需要。以MDV疫苗作载体构建活病毒载体疫苗是近年来禽病毒基因工程研究中比较活跃的领域。多年的生产实践证实了MDV CV1988疫苗的安全性、有效性。因此,本研究选用CVI988疫苗作载体,插入IBDV VP2保护性抗原基因,筛选重组病毒,并对其免疫特性进行了研究。 1 IBDV JS株VP2基因真核表达载体的构建及其免疫特性 应用RT-PCR方法从IBDV JS株中扩增出VP2基因,并克隆入pGEM-T easy载体。序列测定分析结果表明,IBDV JS株的VP2基因与国际标准强毒株编码的氨基酸序列具有极高的同源性(96.2-99.2%)。系统进化树分析表明,JS株和香港HK46、日本OKYM、英国UK661等毒株的关系最近。随后将VP2基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1/zeo(+),构建成功真核表达质粒pcDNA3.1-VP2,用pcDNA3.1-VP2体外转染COS-1细胞,结果证明VP2基因能在COS-1细胞中表达。利用pcDNA3.1-VP2质粒进行基因免疫,结果发现雏鸡二免后14天可在体内检测到特异性抗VP2抗体,对100LD_(50)的IBDV JS超强毒攻击的保护率为67%,这一结果提示VP2基因具有良好的免疫原性,可以作为研制IBDV基因工程疫苗的目的基因。 2 MDV CVI988转移载体的构建 根据Ⅰ型MDV强毒GA株基因序列,设计叁对引物,用PCR方法扩增出CVI988/Rispens株的TK区、US10区及其侧翼序列,分别克隆入pGEM-T easy载体中,测序表明所克隆的基因片段与Ⅰ型MDV强毒GA株基因序列完全一致。然
祁小乐[7]2007年在《鸡传染性法氏囊病病毒反向遗传操作系统的建立及基因功能研究》文中提出鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease，IBD)是由鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus，IBDV)引起的一种主要危害3-6周龄雏鸡的急性、高度接触性传染病。该病于1957年首发于美国Gumboro地区，50年米，一直威胁着养禽业的发展。免疫抑制、抗原变异，特别是超强毒株(vvIBDV)的出现，使得该病的防控形势更加严峻。国际兽疫局(the Office Internationnal des Epizooties，OIE)将IBD列为“影响社会经济的重要疾病”。关于IBDV的变异以及毒力和细胞嗜性的分子基础，一直是科研工作者研究的重点之一。本课题组的前期研究将超强毒Gx株(vvIBDV)经SPF鸡胚传5代、CEF上传20代驯化致弱为减毒株Gt。Gx株致鸡死亡率高达60％以上且不适应CEF细胞培养，Gt株对鸡无明显毒力且能在CEF上增殖，传代致弱过程中的F9代毒对鸡的毒力显着降低而且适应CEF细胞培养。本研究建立了IBDV基因组长距离高保真PCR方法(LA-PCR)，利用此方法克隆了IBDV减毒株Gt的全基因组以及超强毒Gx传代致弱过程中的F9代毒的VP2并对其进行了测序。序列分析发现，与Gx株比较，F9代毒VP2有2个氨基酸突变(Q253H和A284T)，Gt株VP2在此基础上又有10个氨基酸突变。另外，Gx株与Gt株在VP3和VP4上各有4个、6个氨基酸差异。本研究的目的是构建高效IBDV反向遗传操作系统，研究VP2、VP3、VP4等基因的序列差异与IBDV细胞嗜性、复制和毒力的关系。目前用于IBDV研究的体外转录、基于T7RNA聚合酶的体内转录、RNA聚合酶Ⅱ体内转录等反向遗传操作系统在病毒拯救效率和操作简便性等方面仍然存在着一些问题。本研究以全新的思路成功构建了RNA polymeraseⅡ介导的IBDV高效反向遗传操作系统。分别在Gt株基因组两端引入了锤头状核酶结构(Hammerhead ribozyme，HamRz)和丁肝病毒核酶结构(Hepatitis delta ribozyme，HdvRz)，并将其克隆在真核表达载体pCAGGS的CMV增强子和β肌动蛋白启动子下游，构建IBDV感染性克隆pCAGGmGtAHRT和pCAGGmGtBHRT，经Plasmid Midi Kit(QlAGEN)纯化后，在Lipofectamine~(TM) 2000(Invitrogen)的介导下，直接转染DFI细胞，72h后取上清继续在CEF上传代。RT-PCR、间接免疫荧光、电镜等均检测到了拯救的IBDV，且存在分子标签。拯救毒在CEF上能产生特有的砂砾状CPE，且与亲本毒Gt有一致的复制动力学曲线。该系统高效、简便、稳定，具有良好的细胞普适性，能在DFI、Vero/E6、Vero/P12等多种细胞上高效拯救出病毒。IBDV高效反向遗传操作系统的建立为深入研究IBDV的基因功能奠定了基础，也为其它双RNA病毒的反向遗传操作提供借鉴。采用融合PCR(fusion PCR)的方法对Gx、F9、Gt等叁个毒株的VP2基因进行了相互替换，利用所建立的反向遗传操作系统，拯救出了叁个VP2基因嵌合病毒rGx-F9VP2、rGx-GtVP2、rGt-F9VP2。通过复制动力学试验和SPF鸡攻毒试验，证明：VP2的253和284位氨基酸决定IBDV细胞嗜性，Q253H和A284T可使vvIBDV适应CEF培养，并且具有明显的减毒作用；VP2的A222P、I242V、I256V、D279N、I294L、S299N、S330R等七个氨基酸变化可促进IBDV在CEF上的复制，这七个位点也与IBDV的毒力相关。另外，将vvIBDV Gx株的VP3/3’NCR、VP4/VP3/3’NCR、VP4替换Gt株的相应区域，利用上述反向遗传操作系统，拯救出叁个嵌合病毒rGt-GxVP3/3’NCR、rGt-GxVP4/VP3/3’NCR、rGt-GxVP4。通过病毒复制动力学试验和对SPF鸡攻毒试验，证明VP3与IBDV在CEF上的复制相关(其中P981L可能有正向促进作用)；VP3不影响IBDV的毒力；VP4不影响IBDV的毒力以及在CEF上的复制，对VP3亦无协同作用。本研究用全新的思路成功构建了RNA polymeraseⅡ介导的IBDV反向遗传操作系统，并对IBDV VP2、VP3、VP4的功能作了研究，对全面了解IBDV的结构与功能，明确IBDV变异的分子基础，揭示IBDV致病与免疫的分子机制，探索IBDV分子致弱方法，研发适合于流行毒株的新型疫苗具有重要意义。
李银聚[8]2005年在《河南省传染性法氏囊病分子流行病学调查及其防制》文中进行了进一步梳理针对近年来鸡传染性法氏囊病(IBD)的流行日益复杂，免疫失败经常发生的现状，为做好本地区传染性法氏囊病的防制工作，对2002～2004年间河南省15个地区鸡群传染性法氏囊病的流行情况及分子流行病学进行了调查，并针对性的提出了防制措施。 1．河南省传染性法氏囊病流行情况调查 对2002～2004年间河南省15个地区鸡群传染性法氏囊病的流行情况进行了调查。发现传染性法氏囊病的发病季节有全年化趋势，但每年仍以6～9月份为发病高峰期；发病鸡的日龄范围扩大；病变以法氏囊呈胶冻样水肿和肾脏尿酸盐沉积为主要特征，二者出现率分别占67.2％和73.11％；其它病变多不典型；发病鸡群中免疫鸡群占78.17％，二次发病鸡群约占16.98％；宿主和易感家禽的范围扩大。对出现上述情况的原因进行了初步的分析。 2．河南省传染性法氏囊病分子流行病学调查 为探究IBD流行呈现新特点的原因，对2002～2004年间收集的河南省15个地区具有代表性的39株IBDV病料进行了分离鉴定、VP2基因的克隆和序列分析。结果发现，有30株地方流行株属于IBDV超强毒株，但各毒株间也有一定的差异；有9个分离株，既不符合超强毒的特征，也不完全符合弱毒株的特征，是基因已经发生变异的弱毒株。同一鸡群再次发病可能是由同一毒株引起的，但基因已经发生了一定的变化。在系统发育进化树上，分离于各地区的IBDV毒株呈分散分布，但也呈现部分的地区特点。 3．IBDV超强毒和弱毒株VP2基因同义密码子使用的偏爱性研究 对河南省2002～2004年间收集并鉴定的30株IBDV超强毒株和9株弱毒株VP2基因cDNA序列进行了比较分析，研究了IBDV超强毒株和弱毒株的VP2高变区基因不同位点同义密码子的使用情况，发现超强毒和弱毒株除特征性氨基酸变化外，许多位点的氨基酸在同义密码子的使用上也有明显的偏爱性。这预示着同义密码子的使用与VP2基因表达及其表达产物的空间结构有一定的关系，进而可能影响到IBDV的
熊忠贤[9]2013年在《传染性法氏囊病病毒流行株的基因分型及代表株全基因组的序列测定》文中研究指明鸡传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease, IBD）是由鸡传染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Disease Virus, IBDV）引起雏鸡的急性、高度接触性、溶淋巴细胞性的传染病。IBDV可引起免疫抑制，使鸡群对其它疾病易感性增加，对疫苗（如新城疫、禽流感等）接种的免疫应答能力也下降，给养鸡业带来了很大的经济损失。从IBDV基因组双链的分子变化对流行的IBDV分离株进行跟踪研究，将有助于我们全面掌握病毒的分子进化规律，指导临床上IBD的疫苗选用，同时将为新型疫苗的研制提供依据。研究首先根据GenBank公布的IBDV全基因组序列（CEF94）设计出两对引物用于扩增B节段的VP1-b（767bp）片段，通过RT-PCR技术对2000~2012年期间分离到的91株IBDV野毒株进行了VP1-b的扩增。实验从序列的氨基酸和核苷酸同源性、遗传系统进化树等角度对序列进行分析，并与本课题组之前对分离株的基于A片段的VP2高变区（vVP2）的序列分析结果进行比较。结果，所有分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别为85.9~100%和89~100%。但91个分离株与超强毒参考株的同源性高低不一，为87.1-99.2%，020180等42株与弱毒株同源性较高，为96.1-100%；在遗传进化树中，91个分离株被分为4个大分支，没有一个分离株与vvIBDV同群，遗传进化分析结果与同源性分析结果一致，表明，我国近12年来流行的IBDV在VP1片段上存在遗传多样性。VP1-b序列与vVP2的序列比较中，仅020180等13株分离株基于VP1-b和基于vVP2的分析结果一致，其余78株均为不同形式的基因重排病毒，根据VP1-b和vVP2的来源不同，BH11等24株分离株的VP1-b为弱毒株，vVP2为超强毒株；JS7等26株分离株的VP1-b与参考株002-73类似，vVP2为超强毒株；NN1172等18株分离株的VP1-b与参考株HLJ-0504类似，vVP2为超强毒株；GD10111等5株分离株的VP1-b为弱毒株， vVP2为中等偏强毒株；YL052的VP1-b与参考株002-73类似，vVP2为中等偏强毒株；NN1005等4株分离株的VP1-b不能分型，vVP2为超强毒株。依据重排与否以及重排类型将91株分离株相应的分为7个不同的基因型。研究表明，我国南方部分省区近12年来流行的IBDV以不同形式的基因重排病毒为主，并以Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ为主要的流行形式。其次，根据对91株IBDV分离株的vVP2和VP1-b序列进行的基因分型结果，筛选出NN040124、NN1005、BH11、JS7、NN1005、YL052和NN1172等7株不同基因型的代表株，通过分段扩增和测序获得了7个代表株和1个疫苗株的A节段（64bp-3171bp）和B节段（12bp-2805bp）。氨基酸的序列分析中，分离株BH11、JS7、NN1005和NN1172在A节段中具有与参考超强毒株类似的特征性氨基酸位点；而分离株NN040124、YL052和GD10111在A节段中既具有与参考超强毒株类似的特征性氨基酸位点，又具有与参考弱毒株类似的特征性氨基酸位点，但毒株之间与参考株的类似程度在具体位点上有差异；此外，7个分离株均具有数量不一的、参考株（包括vvIBDV、致弱毒株和经典株）没有的特异性氨基酸位点序列，但这些位点均不在A节段和B节段的功能区上，表明，目前流行的IBDV仍然处于不断的进化中。基于A节段和B节段的同源性分析和遗传进化分析比较表明，BH11等7个分离株均为节段重排病毒，结果与基于VP1-b和vVP2的分析结果基本一致，但在具体的重排方式上，NN040124的A节段更接近于vvIBDV，但其中的vVP2则属于中等偏强毒力株；分离株YL052和JS7的B节段不属于参考用的任何毒株，而其VP1-b则属于002-73来源，推测，这些毒株的A和B节段的分析结果与基于部分片段的结果不完全一致，很可能是由于片段内发生了同源重组。本研究首次从IBDV基因组双节段部分序列，即A-vVP2和B-VP1-b出发以及代表株的全基因组序列分析的角度，对12年来我国南方部分省区流行的IBDV毒株进行了全面的分子流行病学分析，获得了有关IBDV流行株发生分子变化的重要的分子流行病学数据，将为临床上IBD的有效防制，特别是新型疫苗的研制提供重要的依据。
谢荣辉[10]2003年在《萧山鸡白细胞介素2基因免疫的免疫增强作用研究》文中研究说明鸡白细胞介素2是由 T 淋巴细胞产生的一类细胞因子，能激活 T 细胞，促进B细胞分化及分泌抗体，增强单核细胞以及 NK 细胞的杀伤活性，在机体的免疫反应中具有重要的作用，是一类天然的免疫增强剂。本课题对鸡白细胞介素2(IL-2)原核表达、真核表达及其增强传染性法氏囊病病毒(IBDV)DNA疫苗免疫效果进行了研究。 将萧山鸡白细胞介素2基因克隆入原核表达载体pET-28b，获得了重组表达载体pET-28b-IL-2，将此重组表达质粒转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导表达鸡IL-2。重组质粒的酶切、PCR鉴定、SDS-PAGE以及MTT法活性检测试验证实萧山鸡IL-2在大肠杆菌中得到了正确、高效的表达。用萧山鸡IL-2所制备的多克隆抗体，进行ELISA和Western blotting试验表明所表达的萧山鸡IL—2具有良好的免疫原性及免疫反应性。 将萧山鸡白细胞介素2基因克隆入真核表达载体pCI的CMV启动子的下游，构建真核表达质粒pCI-IL-2。高压电击法将重组质粒转化入dam和phoP基因双突变的减毒鼠伤寒沙门氏菌ZJ111株(ZJ111／pCI-IL-2)，并直接转染Vero细胞，提取细胞总DNA，DIG标记探针可检测到阳性杂交信号。用FITC标记的羊抗兔IgG进行间接免疫荧光试验，可检测到特异性黄绿色荧光。SDS-PAGE和Western blot可检测到18.5KD和14.5KD的蛋白条带。结果表明减毒沙门氏菌zJ111能将重组质粒pCI-IL-2携带进入Vero细胞内表达具有免疫反应性的鸡IL-2。 减毒鼠伤寒沙门氏菌ZJ111／pCI-IL-2和ZJ111／pCI菌株安全性试验，结果表明：ZJ111／pCI-IL-2和zJ111／pCI菌株只有在10~9cfu高剂量口服后引起少数试验小鼠(2／15)的死亡，10~7cfu和10~8cfu口服剂量组的试验小鼠均安全，将zJ111／pCI-IL-2以10~9cfu的剂量接种14日龄的非免疫鸡，未见任何不良反应，也不影响鸡只的增重，脾脏、肝脏中的沙门氏菌二次免疫后3周已被鸡的免疫系统所清除，粪便中的沙门氏菌也逐渐减少。表明利用减毒鼠伤寒沙门氏菌ZJ111菌株作为载体传递质粒DNA具有良好的安全性。PCR鉴定和酶切鉴定表明ZJ111／pCI-IL-2菌株在体内外均具有良好的稳定性。 将ZJ111／pCI-IL-2菌株分别以10~7cfu、1O~8cfu、10~9cfu不同的剂量口服与200μg pCI-VP2／VP4／VP3质粒联合接种14日龄的非免疫鸡，2周后进行二免，浙江大学硕士学位论文二免后17天攻击工BDv强毒BC6/85。动物攻毒保护试验结果表明:ZJI 11/pCI扛L一2菌株与pC工一vPZ/vP4/vP3质粒联合免疫能显着增强IBDv多聚蛋白DNA疫苗对强毒攻击的保护。其中zjz rl/pel一IL一2菌株10月efu、10，efu的剂量与200卜gpCI一VpZ/Vp4/Vp3联合免疫组的保护率均为81%，ZJI 11/pCI一IL一2菌株10丁efu与200林9 pCI一VpZ/Vp4/Vp3联合免疫组的保护率(75%)，均高于200林9 pCI一VpZ/VP4/VP3免疫的保护率62.5%。表明每只鸡口服10gefu ZJlll/pCI一儿一2菌是对IBDV多聚蛋白DNA疫苗发挥免疫增强作用的最佳剂量。而且工BDV多聚蛋白DNA疫苗诱导抗体的动态曲线和鸡胸腺、脾脏T淋巴细胞及法氏囊B淋巴细胞增殖反应均得到了一致的结果。此外试验结果表明以减毒沙门氏菌ZJin菌株为载体的鸡IL一2基因免疫增强剂的免疫增强效果明显高于裸质粒IL一2基因免疫增强剂。 本研究对萧山鸡工L一2基因成功地进行了原核表达及真核表达，制备了多克隆抗体。在国内外首次研制了以减毒沙门氏菌为载体的萧山鸡工L一2基因免疫增强剂，所制备的免疫增强剂与IBDV多聚蛋白DNA疫苗联合应用能显着提高DNA疫苗的免疫效果。以减毒沙门氏菌为载体制备萧山鸡工L一2基因免疫增强剂具有省时、方便、价廉、易于群体免疫等优点，为研制低成本、实用化禽类DNA疫苗天然免疫增强剂的提供了一条新途径。
参考文献：
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[4]. 免疫增强剂对鸡传染性法氏囊病基因免疫的增强作用[C]. 秦爱建, 刘红梅, 许小琴. 2005全国第二届核酸疫苗研讨会论文集. 2005
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[6]. 鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的表达及其重组马立克氏病毒的构建[D]. 刘红梅. 扬州大学. 2005
[7]. 鸡传染性法氏囊病病毒反向遗传操作系统的建立及基因功能研究[D]. 祁小乐. 中国农业科学院. 2007
[8]. 河南省传染性法氏囊病分子流行病学调查及其防制[D]. 李银聚. 南京农业大学. 2005
[9]. 传染性法氏囊病病毒流行株的基因分型及代表株全基因组的序列测定[D]. 熊忠贤. 广西民族大学. 2013
[10]. 萧山鸡白细胞介素2基因免疫的免疫增强作用研究[D]. 谢荣辉. 浙江大学. 2003
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