肖娟1 张志伟2 张先锋1（通讯作者）
1.南华大学附属第二医院耳鼻喉科 湖南衡阳 421001；2.南华大学医学院肿瘤研究所 湖南衡阳 421001
【摘 要】目的 探讨LMP1促进鼻咽癌干细胞SP18增殖的作用机制。方法 采用平皿克隆与软琼脂集落形成实验观察LMP1促进SP18细胞增殖中的作用；Western-blot检测NF-кB P65蛋白的表达。结果 1、LMP1羧基端TRADD位点突变后促进SP18细胞增殖的能力降低（p<0.01）；2、SP18-LMP1TRADD细胞中NF-кB P65蛋白表达水平比SP18-LMP1细胞降低。结论 LMP1通过NF-кB途径促进鼻咽癌干细胞SP18的增殖。
【关键词】鼻咽癌干细胞；LMP1；细胞增殖
鼻咽癌是我国南方地区常见的恶性肿瘤之一，尤其是广东、湖南等地区。EB病毒感染与鼻咽癌发生有关[1]。潜伏性膜蛋白1（latent membrane protein 1，LMP1）是EB病毒编码的重要致瘤蛋白之一[2]，包括三个羧基端功能活化区（carboxy terminal activating region，CTAR）[3，4]。LMP1第二个功能活性区具有肿瘤坏死因子受体相关死亡区（TRADD）结合位点，该位点为LMP1羧基端重要的功能活性位点[4，6]。LMP1在鼻咽癌干细胞中的作用及调控机制仍不十分清楚。
材料与方法
1.细胞与质粒 鼻咽癌干细胞SP18由中山大学肿瘤防治中心惠赠，细胞用含5％小牛血清的RPMI1640培养基常规培养。pLNSX-LMP1和pLNSX-LMP1TRADD（LMP1羧基端TRADD位点突变体），逆病毒质粒由中南大学肿瘤研究所惠赠[4，6]。
2. 建立SP18-LMP1和SP18-LMP1TRADD细胞 将收集的逆病毒RV-LMP1和RV-LMP1TRADD感染SP18细胞37 ℃ 2次，经800?g/ml G418筛选2周后，汇合克隆扩大培养，通过免疫荧光检测SP18细胞中LMP1和LMP1TRADD蛋白的表达，建立SP18-LMP1和SP18-LMP1TRADD细胞。
3.免疫荧光观察LMP1的表达 制备SP18-LMP1和SP18-LMP1TRADD细胞爬片，固定、洗片与干燥后，用LMP1一抗37℃孵育1 h，洗片，FITC标记的二抗37℃孵育1 h，洗片，置于荧光显微镜下观察SP18-LMP1和SP18-LMP1TRADD细胞中荧光强度并拍照。
4. 平皿克隆形成实验 接种SP18-LMP1和SP18-LMP1TRADD细胞于24孔板中（每孔300个），静置培养2周后，甲醇固定，用0.4 %结晶紫染色，计数形成的克隆数，大于50个细胞者为细胞克隆，计算克隆形成率（%）＝（形成克隆数/接种细胞数）×100%。
5. 软琼脂集落形成实验 制备0.6%的底层琼脂，冷却后，制备0.3%顶层琼脂，（每孔2×103个细胞），设SP18-LMP1和SP18-LMP1TRADD细胞组，每组3个平行孔，静置培养2周后，计数形成的细胞集落数，大于50个细胞者为细胞集落，计算集落形成率（%）=（形成集落数/接种细胞数）×100%。
6. Western-blot 分别细胞，提取总蛋白，测定蛋白浓度，进行10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（每泳道30?g蛋白），分离蛋白，经转膜、封闭，一抗（1：1000）37 ℃孵育PVDF膜1 h，洗涤，二抗（1：2000）37 ℃孵育PVDF膜1 h，洗涤、发光、曝光、显影与定影。
7. 统计学分析 采用SPSS16.0软件进行分析，数据以 ±ｓ表示，所有数据通过T-test法检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。
结 果
1. 免疫荧光观察LMP1的表达 采用免疫荧光检测SP18细胞中LMP1和LMP1TRADD蛋白的表达，结果显示LMP1和LMP1TRADD蛋白表达于SP18细胞浆与膜（图1）。
＃SP18-LMP1 vs. SP18-LMP1TRADD，p<0.05
3. Western-blot检测SP18细胞中NF-кB P65蛋白的表达 结果显示，SP18-LMP1细胞中NF-кB P65蛋白的表达较高于SP18-LMP1TRADD细胞（图2），说明LMP1羧基端TRADD位点缺失后SP18细胞中NF-кB蛋白表达降低，提示LMP1能经羧基端TRADD位点诱导NF-кB P65蛋白表达。
讨 论
鼻咽癌的发病与EB病毒感染密切相关，EB病毒常呈现潜伏感染，其编码多种潜伏性蛋白，其中LMP1为EB病毒编码的重要致瘤蛋白之一[2-4]。在致瘤过程中，LMP1羧基端胞浆区的三个活性区发挥重要作用，其中位于LMP1羧基端胞浆区末端的351～386aa，能与肿瘤坏死因子受体相关死亡区（TRADD）蛋白相结合，参与介导NF-?B的活化[5，6]。本研究发现，将TRADD位点缺失的LMP1导入SP18细胞后，其促进细胞增殖能力较LMP1降低，提示TRADD位点在LMP1促SP18细胞增殖过程中发挥重要的作用，是LMP1的重要功能活性位点。
核因子-κB（Nuclear factor-κB，NF-κB）是细胞内重要且保守的转录因子，参与细胞内的转录调节功能，具有p65和p50两个亚基，细胞内NF-κB以同源或异源性二聚体形式存在[7]。本研究发现，SP18-LMP1细胞中NF-κB（p65）表达较SP18-LMP1TRADD细胞增加，说明羧基端TRADD位点缺失后，LMP1诱导SP18细胞中NF-кB蛋白表达能力降低，提示TRADD位点可能是LMP1诱导SP18细胞中NF-кB蛋白的表达重要区域。NF-κB蛋白是细胞内重要的转录因子，LMP1导入细胞具有诱导细胞呈现恶性表型的功能，我们推测LMP1通过影响NF-κB的表达，调节细胞内NF-κB信号途径，参与鼻咽癌干细胞增殖的作用，至于如何调控仍有待深入研究。
参考文献：
[1]Chen ZT，Liang ZG，Zhu XD. A Review：Proteomics in Nasopharyngeal Carcinoma [J]. Int J Mol Sci. 2015，16（7）：15497-530.
[2]肖娟，张志伟，伍石华等. LMP1 羧基端活化区3对鼻咽癌干细胞SP18 迁移与侵袭的影响[J]. 生物化学与生物物理进展，2015，42（1）：65-72.
[3]赵强，张志伟，刘重元等. LMP1调节鼻咽上皮与鼻咽癌组织中P27与RPLP0蛋白的表达[J]. 中国病理生理杂志，2012，28（10）：1830-1834.
[4]张志伟，刘洁琼，余艳辉等. EB病毒LMP1促鼻咽上皮细胞增殖的蛋白分子鉴定[J]. 中国病理生理杂志，2010，26（2）：287-292.
[5]张志伟，张琼，余艳辉等. EB病毒LMP1-CTAR3对NP69细胞增殖和蛋白表达的影响[J]. 生物化学与生物物理进展，2009，36（5）：580-586.
[6]张志伟，贺智敏，周敏等.NF-κB 介导的EB 病毒潜伏性膜蛋白1 在Rat-1 细胞转化和成瘤中的作用[J]. 癌症，2007，26（2）：118-122.
[7]Herrington FD，Carmody RJ，Goodyear CS. Modulation of NF-κB Signaling as a Therapeutic Target in Autoimmunity [J]. J Biomol Screen. 2016，21（3）：223-242.
基金项目：湖南省科技厅项目（No.2013SK3118；2014SK3081）；湖南省高校创新平台基金（No.10K052；12K094；13K083）；湖南省卫生厅项目（B2014-163；B2013-048）
论文作者:肖娟1,张志伟2,张先锋1（通讯作者）
论文发表刊物:《航空军医》2016年第12期
论文发表时间:2016/7/21
标签：细胞论文; 蛋白论文; 鼻咽癌论文; 羧基论文; 干细胞论文; 位点论文; 病毒论文; 《航空军医》2016年第12期论文;