1.广州市疾病预防控制中心 广东广州 510440；2.深圳市易瑞生物技术有限公司 广东深圳 518101；
3.广州市微生物研究所 广东广州 510663
摘要：[目的]建立肠炎沙门氏菌荧光纳米颗粒免疫层析法。[方法]首先制成肠炎沙门氏菌单抗-荧光纳米颗粒偶联物，以双抗体夹心模式制备沙门氏菌免疫层析试纸条。利用微型手持荧光检测仪读出质控线和检测线上的荧光信号，并利用荧光强度来半定量检测肠炎沙门氏菌。[结果]用所制备的试纸条对5属9种58株中的14株肠炎沙门氏菌的检测结果呈阳性，其它非肠炎沙门氏菌菌株检测结果呈阴性，试纸条灵敏度为2.4×104CFU/mL。用肠炎沙门氏菌免疫层析试纸条和标准法检测58份样品，两种方法的总符合率为86.2%。[结论]肠炎沙门氏菌荧光纳米颗粒检测试纸条为沙门氏菌的快速检测提供了极好的检测方法，具有广阔的应用前景。
关键词：偶联物；荧光纳米颗粒；肠炎沙门氏菌；免疫层析试纸条
【Abstract】Objective：To establish a rapid method for the detection of Bacillus Enteritidis.Method：Fluorescent nanoparticles were covalently conjugated with monoclonal antibodies against salmonella and were employed in the development of lateral flow strip assay.The sensitivity，specificity and semi-quantitative of the lateral flow strip were evaluated.Results：The lateral flow strip assay correctly identified 14 enteritidis strains of 58 bacillus，while the other non-enteritidis strains were negative.The sensitivity of the dipstick was 2.4×104CFU/mL.This method was compared with standard method and the agreement rates are 86.2%.Conclusion：This lateral flow strip assay is sensitive，simple，rapid method without the need of special apparatus，so it can be used wildly in the future.
【Key words】Conjugate；Nanoparticles；Bacillus Enteritidis；Lateral Flow Strip
沙门氏菌（Salmonella）是一类重要的食源性致病菌。目前，沙门氏菌血清型约有2500多种[1]，它可以引发胃肠炎、伤寒、败血症等多种疾病[2-3]。2007年，美国原料花生受到沙门氏菌污染，导致美国44个州发生沙门氏菌疫情，造成637人染病，至少9人死亡。
目前针对肠炎沙门氏菌检测的方法主要是两大类：一是传统培养鉴定法，二是快速检测法。传统培养鉴定法具有结果准确可靠，不需要复杂仪器等特点，但由于其检测周期长、过程繁琐、试剂繁多等缺陷，已远不能满足现代快速检测的需要。基于免疫学、生物医学、分子生物学方法原理的各种快速检测法具有快速优点，但由于其需要昂贵的设备、需带回专业实验室检测等缺陷，无法满足现场检测的需要。针对以上方法的部分不足，本研究利用磁性荧光纳米颗粒，修饰后连接食源性致病菌特异性抗体，研制食源性致病菌快速检测试纸条。
胶体金免疫层析技术具有简便快速、费用低、易于操作等特点[4]，因此在诊断领域得到广泛应用。目前，也有用胶体金免疫层析试纸条检测沙门氏菌的报道，但是受胶体金的信号强度影响，胶体金免疫层析法的灵敏性不够理想，容易导致假阴性的发生。荧光纳米颗粒内含有大量荧光报告分子，荧光信号强而稳定，不受溶剂的影响，具有极强的抗光漂白能力。本研究用荧光纳米颗粒取代传统的胶体金颗粒作为标记物，建立了肠炎沙门氏菌的免疫层析检测法。
1 材料与试剂
1.1 试剂
荧光纳米颗粒由广州市疾病预防控制中心和深圳市易瑞生物技术有限公司联合自制[7]；菌种均为广州市疾病预防控制中心保存标准菌株及环境分离菌株；肠炎沙门氏菌单克隆抗体由深圳市易瑞生物技术有限公司提供，羊抗鼠IgG购自华美生物公司；硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜购自美国Millipore公司；培养基购自北京陆桥。各试剂均为分析纯。
1.2 仪器
便携式时间分辨荧光检测仪由广州市疾病预防控制中心和深圳市易瑞生物技术有限公司共同研制。
2 方法与步骤
2.1荧光纳米颗粒的制备
2.1.1荧光纳米颗粒（量子点）的制备
将一定量的NaBH4加入装有少量水的小圆底烧瓶中，完全溶解后加入Se粉。磁力振荡，于4 ℃恒温反应2 h制备NaHSe。称取2.2835 g CdCl2·2.5H2O固体溶于适量水中，定容至100 mL，配得0.1 mol/L CdCl2标准溶液。
往200mL圆底烧瓶中加入60mL去离子水，通氮气除氧后加入一定量的CdCl2标准溶液，再加入一定体积的巯基乙酸，用氨水、氢氧化钠（1mol/L）调节反应体系的pH值，继续通入氮气保护，加入一定体积的NaHSe溶液，加热回流2～8小时，得到量子点溶液。
2.1.2 荧光纳米颗粒（量子点）标记
取15μL量子点（1mg/mL）加入15μL EDC（1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚铵盐酸盐）及15μL NHS（均由20mM PB 6.0配成10 mg/mL）再加入105μL 20mM PB6.0，震荡混匀，室温静止30 min。时间到后加入150μL异丙醇混匀，4 ℃ 14，000 rpm离心20 min，弃上清。加入300μL 20mM PB8.0，超声打碎，并加入30μL 1 mg/mL肠炎沙门氏菌单克隆抗体，混匀静止2h，加入300μL 10% BSA封闭30min，4℃14，000 rpm离心20min，加入300μL 复溶液（10mM PB 8.0+2%海藻糖）超声打散，置于4 ℃保存备用。
2.1.3 白色微孔制备
用100mM Tris-HCl pH8.0，2%海藻糖，1%BSA，0.5% Tween，0.1%叠氮钠作为反应液。将反应液与标记好的荧光纳米颗粒按照5：1混匀，混匀后按每孔60μL加入到96孔酶标板内，置于-80℃超低温冰箱预冻4h以上，冻结实后再置于冷冻干燥机内冻干，加帽后置于4℃干燥间保存备用。
2.2 荧光试纸条的制备
2.2.1 检测线的制备
以肠炎沙门氏菌单抗为硝酸纤维素膜上的检测线。将肠炎沙门氏菌单抗用含有2%的海藻糖的PB 7.4稀释成2.0mg/mL，将稀释好的抗体用喷膜仪以1μL/cm的量，喷涂与硝酸纤维素膜上。将喷好的膜置于37℃恒温干燥箱内，烘烤30min.取出后放于干燥间备用。
2.2.2 质控线的制备
以羊抗鼠IgG包被的硝酸纤维素膜作为质控线，将羊抗鼠IgG用含有1 %的蔗糖的PBS（PH 7.4）稀释成1.0 mg/mL，将稀释好的二抗用喷膜仪以1 μL /cm的量，喷涂与硝酸纤维素膜上，将喷好的膜置于37℃恒温干燥箱内。烘烤30 min，取出后放于干燥间备用。
2.2.3试纸条的组装
试纸条由PVC衬板、样品垫、硝酸纤维素膜和吸收垫组成。依次将硝酸纤维素膜，样品垫，结合垫贴于PVC衬板上（样品垫与硝酸纤维素膜重叠约3mm，吸收垫与硝酸纤维膜重叠约4mm）粘贴好后切成4.4mm宽的试纸条，将制备好的试纸条置于密封袋中，加干燥剂，密封，4℃保存。
2.3 检测原理和结果判定
取100μL样品稀释液（PBS pH7.4）加入白色微孔内，再取100μL待测培养液加入白色微孔内，上下混匀5～6次，插入试纸条并计时10min。时间到后用便携式时间分辨荧光检测仪读出判定结果或借助紫外灯肉眼判断。若培养液中含有目标菌，则目标菌将与白色微孔内的荧光纳米颗粒-抗体偶联物结合，并朝着吸收垫方向移动，当移动至检测线时将被检测线上的单抗所捕获，在紫外灯下可以看到明亮的检测线；未被捕获的纳米颗粒-抗体或者纳米颗粒-抗体-目标菌继续朝着吸收垫方向移动，当移动至质控线时，偶联物上的抗体将被质控线上的羊抗鼠IgG所捕获，在紫外灯下可见明亮的质控线。如果质控线没有出现，则检测结果无效；如果有质控线无检测线，则结果为阴性。
2.4 菌株的培养
2.4.1.取样均质[依照 GB/T 22429—2008]
无菌操作取25 g（mL）样品到均质袋中，并向其中加入225 mLBPW，充分均质。36 ℃±1 ℃培养8 h～18 h.
2.4.2 增菌培养
将混匀的微生物培养液，轻轻摇动后移取 1 mL，转种于 10 mL TTB 内，于42 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h。同时，另取 1 mL，转种于 10 mL SC 内，于 36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。放置到36±1 ℃环境中，连续培养24±1 h，得待检样品液。移取1mL 增菌液到灭活EP管中，于沸水中加热15 min，剩余的增菌液于4 ℃保存，以便用于阳性确认。
2.5 特异性试验
用本研究制备的试纸条分别检测0.5麦氏单位的菌液，以评价试纸条的特异性。
2.6 灵敏性试验及半定量检测
将纯培养的肠炎沙门氏菌标准菌株制成0.5麦氏单位的菌液，将此菌液用PBS10倍稀释至100CFU/mL梯度，分别取103CFU/mL和104 CFU/mL梯度的100 μL菌液各涂布两个营养琼脂平板，37 ℃培养过夜后进行平板计数推算原菌液的准确浓度。
取经传统方法预检肠炎沙门氏菌阴性的鸡肉10g加入到90mL EC肉汤，于组织捣碎机中匀浆约60s，制成鸡肉匀浆。取9mL鸡肉匀浆接入1mL已知浓度的标准菌株，混匀作为食品样品原样，之后以鸡肉匀浆为稀释液10倍倍比稀释原样至100。各取100 μL，用所制备的免疫层析试纸条进行检测，每个梯度平行检测8次。
3实验结果与分析
3.1 沙门氏菌试纸条的特异性
对5属9种58株菌进行检测。检测结果见图1和表1，54株沙门氏菌中14株肠炎沙门氏菌免疫层析检测结果均为阳性，其余菌株的检测结果均为阴性。特异性实验结果说明所建立的检测沙门氏菌免疫层析检测方法具有良好的特异性。
注：左为阴性，右为阳性。
3.2 肠炎沙门氏菌试纸条的灵敏性
用试纸条检测肠炎沙门氏菌浓度为2.4×103CFU/mL与空白的样品，便携式时间分辨荧光检测仪或肉眼观察，均没有检测线出现。当肠炎沙门氏菌浓度为2.4×104CFU/mL时，有检测线出现，但亮度很微弱。随着肠炎沙门氏菌浓度的不断升高，检测线的亮度也不断增大，当浓度达到9.5×109CFU/mL以上时，检测线的亮度不再增强。因此，该肠炎沙门氏菌免疫层析试纸条的灵敏性为2.4×104CFU/mL。检测线不出现，提示肠炎沙门氏菌浓度低于2.4×104CFU/mL；有检测线出现，提示肠炎沙门氏菌浓度高于2.4×104 CFU/mL。
3.3 应用试验
分别用本项目建立的肠炎沙门氏菌免疫层析法和标准法（SN/T 1059.7-2010 进出口食品中沙门氏菌检测方法 实时荧光PCR法）检测58份样本（涉及肉、奶、水产品），其中20份样品用肠炎沙门氏菌标准菌株菌液进行接种，接种浓度为2.0×103CFU/500g。称取上述人工污染样品进行增菌，随后分别做免疫层析检测和标准法检测。
检测结果见表2。标准法准确检测出了所有20份阳性样品；免疫层析法检出了其中16份阳性样品，另外还有4份阳性。两种方法的总符合率为86.2 %。
4讨论
目前，虽然已经有一些用免疫层析试纸条检测微生物的报道[8，9]，但是灵敏性都不够理想，标记物的信号强度弱是一个很重要的原因。免疫层析试纸条一般只做定性检测，若要做定量或者半定量检测则需借助仪器来实现。为了克服这种缺陷，本研究采用独特的量子点荧光纳米颗粒取代传统的胶体金颗粒，制备成免疫层析试纸条，运用 “反应杯+试纸条”的检测模式进行检测，样品中的肠炎沙门氏菌抗体首先与反应杯中的量子点纳米荧光颗粒上的抗体进行充分反应，然后再通过层析与试纸条上的抗原偶联物进行竞争反应，灵敏性得到提高。同时采用量子点纳米荧光颗粒作为标记物，进一步提高了检测的信号强度，使得灵敏性得到进一步提高。采用本课题研制的时间分辨荧光读数仪进行扫描检测，则可以减少人为因素的影响，使得检测的灵敏性再次得到提高。本研究所制备的沙门氏菌免疫层析试纸条的肉眼检测灵敏性为2.4×104CFU/mL，比文献报道的胶体金免疫层析试纸条灵敏性高一个数量级。
目前国内外应用较为广泛的快速检测方法如显色培养基、 PetrifilmTM 测试片、API 生化鉴定试剂盒、VITEK 全自动微生物鉴定系统等均需要对样品做增菌处理，还需进行分离纯化等步骤；而检测较为快速且具灵敏性的ELISA、PCR等检测方法由于检测成本高，需配备特定的检测仪器，不能作为现场检测的方法。本研究用具有极强发光性能的用荧光纳米颗粒作为标记物，取代常用的胶体金颗粒，制备了荧光免疫层析试纸条，该项技术为食源性致病微生物的快速定量检测提供一个新的现场检测技术。单抗的使用保证了方法的特异性。用所制备的肠炎沙门氏菌免疫层析试纸条对5属9种58株菌进行检测，其中14种肠炎沙门菌免疫层析检测结果均为阳性，其它非肠炎沙门氏菌菌株检测结果均为阴性。
用本研究制备的肠炎沙门氏菌免疫层析试纸条检测58份样品，以标准法为准，肠炎沙门氏菌免疫层析试纸条的特异性、灵敏性、总符合率分别为89.47 %、80.0 %、86.2 %，该结果初步说明该试纸条适合在实际样品检测中应用。
肠炎沙门氏菌荧光纳米颗粒检测试纸条的研制成功，为肠炎沙门氏菌的快速检测提供了一个极好的检测方法，便于野外检测的开展，也为我国食源性疾病的控制提供很好的技术保障，为公共安全作出贡献。
参考文献：
[1]POPOFF M Y，BOCKENMUHL J，GHEESLING L L.Supplement 2002（no.46）to the Kauffmann-White scheme[J].Research in Microbiol，2004，155（7）：568-570.
[2]SWITT M，SOYER Y，WARNICK L D，et al.Emergence，distribution，and molecular and phenotypic of Salmonella enterica serotype 4，5，12[J].Foodborne Pathogens and Disease，2009，6（4）：407-415.
[3]SANCHES-VARGAS F M，ABU-EL-HAIJA M A，GOMEZDUARTE O G.Salmonella infections：an update on epidemiology，management，and prevention[J].Travel Medicine and Infectious Disease，2011，9：263-277.
[4]任娟.胶体金免疫层析技术研究现状与进展[J].新疆畜牧业，2011（12）：22-24.
[5]夏诗琪，徐超莲，刘道峰等.胶体金免疫层析法联检食品中5种典型沙门氏菌模型的建立和优化[J].食品科学，2014.35（22）：154-158.
[6]王中民，李君文，王新为等.胶体金免疫层析法快速检测沙门氏菌[J].微生物学免疫学进展，2004.32（4）：36-38.
[7]Ye，Z.，et al.，Preparation，characterization，and time-resolved fluorometric application of silica-coated terbium（III）fluorescent nanoparticles.Anal Chem，2004.76（3）：513-518.
[8]Jung，B.Y.，S.C.Jung，and C.H.Kweon，Development of a rapid immunochromatographic strip for detection of Escherichia coli O157.J Food Prot，2005.68（10）：2140-2143.
[9]Bautista，D.A.，et al.，Evaluation of an immunochromatography strip assay for the detection of Salmonella sp.from poultry.J Vet Diagn Invest，2002.14（5）：427-430.
作者简介：何晖（1970—），主任技师，主要研究方向是微生物检验
基金项目：深圳市食品安全快速检测技术工程中心（GCZX20140509163151273）
基金项目：广东省省级科技计划项目（2013B040402001）
论文作者:何晖,王炳志,万群雄,毕思远,付辉,刘华章,钟瑜
论文发表刊物:《健康世界》2016年2期供稿
论文发表时间:2016/4/12
标签：沙门氏菌论文; 层析论文; 试纸论文; 肠炎论文; 荧光论文; 免疫论文; 颗粒论文; 《健康世界》2016年2期供稿论文;