丁雪梅, 张克英, 陈代文[1]2005年在《胆囊收缩素主动免疫产蛋鸡的营养生理效应研究》文中研究表明用胆囊收缩素(CCK)主动免疫产蛋鸡,研究产蛋鸡血清和卵黄中CCK特异性抗体的产生规律及不同CCK免疫剂量对产蛋鸡生产性能和胰腺、胆囊发育及内分泌激素的影响。结果显示:用CCK 8 主动免疫产蛋鸡,可以提高血清和卵黄CCK抗体水平,降低血液中CCK水平;CCK抗体的产生量在第1 次加强免疫后即可接近高峰,第2、第3次加强免疫可维持较高的抗体水平。CCK主动免疫产蛋鸡后,对蛋鸡胰腺、胆囊发育、胰蛋白含量以及蛋鸡体内的生长激素、胰岛素和瘦素水平均没有显着影响,同时对蛋鸡采食量和料蛋比等生产性能也没有显着影响。用CCK主动免疫产蛋鸡,在不影响蛋鸡正常生理功能的同时,可以获得含特异性CCK抗体的卵黄。
丁雪梅[2]2003年在《胆囊收缩素主动免疫产蛋鸡的营养生理效应研究》文中研究说明本试验用胆囊收缩素(CCK)作抗原，主动免疫产蛋鸡，研究产蛋鸡血清和卵黄中CCK特异性抗体的产生规律；不同CCK免疫剂量对产蛋鸡生产性能和胰腺、胆囊发育及内分泌激素的影响；探讨含CCK抗体的卵黄粉对肉鸡生产性能的影响，目的在于确定CCK主动免疫对产蛋鸡营养生理的效应。试验采用单因子试验设计，共3个处理，以注射100μg HSA组为对照，设二个CCK-8免疫剂量组(100μg/只和200μg/只)。每个处理4个重复，每个重复1只鸡。在试验第1天初次免疫后，每隔21天加强免疫1次，试验期间共进行叁次加强免疫。试验期间考察产蛋鸡的采食量、产蛋数、蛋重，在初免前和每次加免后一周采集血清，测定CCK抗体效价、胰酶活性和内分泌激素，在血清抗体效价为1：16(琼脂扩散检测)时收集鸡蛋，测定卵黄CCK抗体效价和分离卵黄冷冻干燥成为卵黄粉；在试验结束时进行代谢试验和屠宰试验，测定饲料养分利用率、产蛋鸡胰腺和胆囊重量等。同时，选用160只1日龄艾维因肉鸡研究了饲粮中添加100mg/kg含CCK抗体的卵黄粉对肉鸡生产性能的影响。 结果为：用胆囊收缩素(CCK-8)主动免疫产蛋鸡可以提高血清和卵黄CCK抗体水平，降低血液中CCK水平；CCK抗体的产生量在第一次加强免疫后即可接近高峰，第二、第叁次加强免疫可维持较高的抗体水平；CCK主动免疫产蛋鸡后，对蛋鸡胰腺、胆囊发育、胰蛋白含量以及蛋鸡体内的生长激素、胰岛素和瘦素水平均没有显着影响，同时对蛋鸡采食量和料蛋比等生产性能也没有显着影响；在肉鸡饲料中添加含有CCK抗体的卵黄粉(100mg/kg)，可显着提高1-42日龄肉鸡的日增重和饲料转化率。结果表明，用CCK主动免疫产蛋鸡，在不影响蛋鸡正常生理功能的同时，可以获得含特异性CCK抗体的卵黄，该卵黄能显着提高肉鸡的生产性能。
丁雪梅, 张克英, 李静, 谭雪梅, 陈代文[3]2004年在《胆囊收缩素主动免疫对产蛋鸡营养生理效应的影响》文中进行了进一步梳理本试验以人血清白蛋白(HSA)为载体连接胆囊收缩素(CCK-8)制备CCK-8抗原,主动免疫产蛋鸡,研究产蛋鸡血清和卵黄中CCK-8特异性抗体的产生规律;不同CCK-8免疫剂量对产蛋鸡生产性能、养分利用率和胰腺、胆囊发育以及主动免疫对产蛋鸡内分泌激素的影响,目的在于探讨CCK-8主动免疫对产蛋鸡营养生理效应的影响。试验采用单因子试验设计,共分3个处理,处理1、2为试验组,分别按100μg/只和200μg/只CCK-8制备抗原免疫产蛋鸡;处理3为对照组,直接免疫100 μgHSA,每
袁中彪[4]2004年在《胆囊收缩素主动免疫对猪的营养生理效应及其机制的研究》文中研究指明CCK是由小肠近端Ⅰ细胞和中枢神经细胞分泌的一种脑肠肽，具有刺激胰酶分泌和胆囊收缩、降低胃排空、调节小肠运动、促进胰岛中胰岛素和生长抑素释放的作用，同时CCK也是动物体内的一种饱感因子，参与调节动物的采食。动物体内CCK的分子形式较多，其中CCK_8具有CCK的全部生物学功能。本研究通过考察CCK_8主动免疫对猪生产性能、营养物质消化率、内分泌激素、胰腺的发育、胰酶活性及基因表达的影响来认识CCK主动免疫的营养生理效应及其可能机制。研究共包括二个试验。 试验一 CCK_8主动免疫对猪的生产性能及CCK基因表达的影响 试验选用体重为27.55±3.15kg的杜洛克×长白猪×约克夏(DLY)叁元杂交阉猪10头，随机分为2组，每组5个重复，每个重复1头猪。试验组用370μgCCK_8与人血清白蛋白(hSA)的交联物(CCK_8-hSA)分别在试验第1、29、43和57天进行免疫，对照组用等量人血清白蛋白免疫。试验期为77天。整个试验期间，试猪自由采食和饮水。在试验的第71天，从前腔静脉采血，测定血清CCK_8的含量和CCK抗体滴度。试验结束时屠宰所有试验猪，迅速取出垂体和空肠前段，经液氮速冻后，-70℃下保存，测定CCKmRNA的含量。 结果显示： ①370μgCCK_8主动免疫后，与对照组相比，试验猪全期日增重和采食量分别提高了14.29％(P=0.23)和9.34％(P=0.34)； ②370μgCCK_8主动免疫后，试验猪血清中CCK_8含量与对照组相比降低了19.77％(P＜0.15)，抗体滴度则升高了67.63％(P＜0.01)； ③试验猪的空肠和垂体中CCKmRNA的含量显着低于对照组(P＜0.05)。 结果表明，370μgCCK_8主动免疫能提高猪血清中CCK抗体滴度、抑制猪空肠和垂体中CCK基因的表达，从而降低血清中CCK_8的浓度，趋于提高猪的采食量和生长速度。 试验二 不同水平CCK_8主动免疫对猪生产性能、胰腺功能、CCK及受体基因表达的影响试验选用体重为27.66±1.71kg的DLY叁元杂交阉猪15头，随机分为3个处理，每个处理5个重复，每个重复1头猪。处理1、2和3的猪分别用由0μg、250μg和500μgCCK_8与人血清白蛋白交联后形成的抗原进行免疫，免疫的时间分别为试验第1、29、43和59天。试验期为74天。整个试验期间，试验猪自由采食和饮水。在试验的第1、15、29、胆囊收缩素主动免疫对猪的营养生理效应及其机制的研究书、59和73天，从前腔静脉采血，测定血清中CCK抗体滴度，或测定血清中CCKS、胰岛素和瘦素的含量。试验结束时屠宰所有试验猪，迅速取出胰腺，纵向分为两部分，一部分用4%的甲醛溶液固定，用于胰腺的组织学检查，另一部分胰腺与取出垂体和空肠样品经液氮速冻后，于一70℃保存，侧定胰酶的活性及CCKmRNA和CCK一A受体爪RNA的含量。 结果显示: ①ccK主动免疫对猪生产性能的影响存在着剂量效应关系，250雌CcKS主动免疫能显着提高猪的全期采食量和日增重，与对照组相比分别提高了H.76%(P<0.05)和14.62%(P<0 .05):而500林gCCK主动免疫有降低猪采食量和日增重的趋势; ②ccK主动免疫显着降低血清中胰岛素、瘦素和CcK。的浓度。250陀CC城主动免疫后，猪第73天的血清中胰岛素、瘦素和cCK:的含量与o林gCC丸组相比分别降低了21.39%(p<0·05)·30.58%(p<0.05)和29.00%(p<0.05):500协gCCK:主动免疫使其分别降低了23.57%(P<0.05)、29.48%(P<0.05)和37.72%(P<0.05)。 ③CcK主动免疫能显着提高胰淀粉酶和胰脂肪酶的比活力‘250协g和500陀CCKs主动免疫与对照相比，胰淀粉酶和胰脂肪酶的比活力分别提高了7.15%(P<0 .05)、1 15.15%(P<0.05)和12.90%(P<0.05)、94.70%(p<0.05);500卜gCCKs主动免疫显着提高胰蛋白酶的比活力，与对照组和250林gCCKs组相比分别提高了85.97%(p<0.05)和35.97%(P<0.05)。 ④250腿CCKS主动免疫对胰腺组织学结构无显着影响。500件gCCK:主动免疫引起胰腺组织病变，主要表现为胰腺组织空泡变性、细胞增生坏死、胰腺充血、出血以及酶原颗粒减少。 ⑤CCK主动免疫后显着降低猪空肠、垂体和胰腺中CCK基因和CCK一A受体基因的表达。与对照相比，250林gCCK:主动免疫使猪空肠、垂体和胰腺中CCK基因和CCK受体基因的mRNA含量分别降低了37.02%(P<0.05)、30.02%(p<0.05)、22.400，0(P<0.05)和25.300，0(P<0.05)、26.06%(P<0.05)、20.43%(P<0.05);500协gCeK:主动免疫则使它们分别降低了44 .97%(p<0 .05)、一8.67%(p<0.05)、24.09%(p<0.05)和22.72%(P<0.05)、10.48%(P<0.05)、16.49%(P<0.05)O 结果表明，250协gCCK:主动免疫显着提高猪生产性能，其机制是CCK主动免疫产生的特异性抗体中和了部分内源性CCK，同时通过抑制CCK基因和CCK受体墓因的表达降低了内源CCK的分泌量，减弱了CCK信号传导作用，从而部分解除了CCK对采食的抑制作用。250陀CCKs主动免疫对胰腺发育和养分消化率无显着影响。500阵CCK四川农业大学博士学位论文主动免疫可进一步提高抗体滴度和抑制基因表达，但有降低猪生产性能的趋势。这表明不同程度的CCK:主动免疫对猪生产性能的影响存在差异，免疫过度可能会损伤猪胰腺的健康。 上述两个试验结果表明，CCK主动免疫可?
苟钟勇[5]2008年在《猪胆囊收缩素基因的克隆表达及其调节猪采食量的生物学功能研究》文中认为胆囊收缩素(CCK)是一种被广泛研究的食欲饱感因子。化学合成的CCK-8无论是硫酸化还是非硫酸化形式都很昂贵,本课题的目的是研究采用基因工程技术外源表达猪的CCK-33多串联体重组蛋白的抗原性及提高猪采食量的生物学功能。本研究应用基因工程技术构建了优化后的猪CCK-33基因九串联体的重组质粒并在大肠杆菌中表达了CCK-33九串联体(Z9CCK)重组蛋白,证明了Z9CCK重组蛋白的抗原性,用Z9CCK重组蛋白诱导产蛋鸡产生卵黄抗体来制备抗Z9CCK卵黄抗体。用Z9CCK重组蛋白主动免疫生长肥育猪,对Z9CCK调节猪的采食量和体增重的效果以及Z9CCK主动免疫对猪血清激素及其它成分的影响进行了研究。结果如下:1.以质粒pRESET B为克隆载体,大肠杆菌DH5α为克隆宿主菌,克隆了pRSET B-Z9CCK重组质粒;以原核表达载体pRESET B为表达载体,BL21(DE3)为表达宿主菌,表达了Z9CCK重组蛋白。根据NCBI上已发表的猪CCK-33基因序列和参照大肠杆菌密码子使用数据库(Codon usage database,网址:www.kazusa.or.jp/codon),设计合成了大肠杆菌表达系统偏爱的猪CCK-33基因优化序列。将合成的猪CCK-33优化序列通过PCR扩增、酶切、连接、转化克隆至pRSET B质粒上,分别获得不带终止子和带终止子CCK-33基因单体pRSETB-1CCK的重组质粒。在此基础上利用限制性内切酶BamHⅠ和BglⅡ是同尾酶的原理,经多次克隆最终成功构建了带终止子的pRSET B-Z3CCK、pRSETB-Z5CCK、pRSET B-Z7CCK、pRSET B-Z9CCK重组质粒。对构建好的CCK-33多串联体基因测序,结果与理论设计的完全吻合。将经过测序鉴定为阳性克隆的CCK-33七、九串联体转化到大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中,用IPTG诱导表达,目的蛋白主要以包涵体的形式存在,表达出的七、九串联体目的蛋白分别占菌体总蛋白的28%和35.6%左右。对Z9CCK重组蛋白表达条件的优化发现:IPTG诱导4h为最佳诱导时间,Z9CCK重组蛋白表达对IPTG浓度不敏感。由此表明:原核表达可以提供大量的CCK蛋白,用较低浓度的IPTG(终浓度为0.2mmol/L)诱导Z9CCK重组蛋白表达而不影响它的表达量,降低了成本。2.用“Bepipred Linear Epitope Prediction”方法预测了Z9CCK重组蛋白的抗原性,用Western-blot方法和间接ELISA试验证明了Z9CCK重组蛋白的抗原性。利用网址:http://www.immuneepitope.org/tools/bcell/tutorial.jsp上介绍的“BepipredLinear Epitope Prediction”方法对Z9CCK重组蛋白进行抗原性预测,发现每一个CCK-33单体分子具有两个抗体识别的抗原表位(1-6:PKAPSGR;16-24:SLDPSHRIS),一个Z9CCK重组蛋白分子具有18个线性抗原表位,初步验证了Z9CCK重组蛋白具有良好的抗原性。以兔抗CCK-8阳性抗血清为一抗,以山羊抗兔抗体为二抗,用Western-blot方法检测显示Z9CCK重组蛋白能与兔抗CCK-8抗体特异性结合,表明Z9CCK重组蛋白具有CCK-8的抗原性。以化学合成的CCK-8与牛血清白蛋白(BSA)的交联物作为包被抗原,用提纯的Z9CCK重组蛋白主动免疫产蛋鸡获得的抗Z9CCK抗体为一抗,以鼠抗鸡IgY为二抗,用间接ELISA试验表明抗Z9CCK抗体能与化学合成的CCK-8发生抗体、抗原特异性结合反应,同样证明了Z9CCK重组蛋白具有CCK-8的抗原性。因此,Z9CCK重组蛋白具有良好的抗原性,且具有CCK-8的抗原性。3.用提纯的Z9CCK重组蛋白主动免疫产蛋鸡,监测了鸡蛋中抗Z9CCK抗体的效价变化,并制备了抗Z9CCK卵黄抗体。将Z9CCK重组蛋白油乳苗主动免疫28周龄海蓝褐蛋鸡750只,左右胸肌各注射0.5mL/次(500μg Z9CCK/mL),免疫程序为试验期第1d初次免疫和第15、29d各加强免疫1次。以提纯的Z9CCK重组蛋白作包被抗原,鸡蛋样品倍比稀释后作为一抗,鼠抗鸡IgY为二抗,用间接ELISA检测鸡蛋中的抗Z9CCK抗体效价。结果发现:在2免1周后鸡蛋中CCK抗体水平便明显升高,平均效价可达2000以上,且此抗体水平可以维持到2免22周。当CCK抗体效价达到高峰73516.69时,收集鸡蛋进行喷雾干燥加工成粉,间接ELISA检测卵黄粉样品中的CCK抗体平均效价为22627.42。ELISA试验还证明Z9CCK重组蛋白具有CCK-8的抗原性。因此,Z9CCK重组蛋白可以作为CCK卵黄抗体生产的候选抗原。4.将提纯的Z9CCK重组蛋白主动免疫生长肥育猪,通过生长肥育猪的饲养试验研究Z9CCK重组蛋白对猪的采食量和体增重的调节效果。选择63±3d长新品系生长肥育猪72头,按体重相对一致的原则随机分成2组,每组9个重复,每个重复4头猪,共36头/组。试验组免疫Z9CCK重组蛋白油乳苗2mL(500μgZ9CCK/mL),左右颈部肌肉各注射1mL;对照组免疫生理盐水,左右颈部肌肉各1mL。免疫程序为试验期第1d进行初次免疫,第29、57d各加强免疫一次。试验结果表明:(1)Z9CCK主动免疫在生长肥育猪体内能有效地产生CCK抗体,用化学合成的CCK-8作包被抗原,间接ELISA试验证明CCK抗体能与CCK-8特异性结合;在第29d,从试验组猪血清中检测到了CCK抗体,第43d达到高峰。(2)试验期1-4周,试验组和对照组采食量和日增重都没有显着差异;5-6周,试验组采食量和日增重与对照组相比又提高的趋势,分别比对照组提高了3.72%(P=0.10)和5.89%(P=0.07);7-8周试验组采食量和日增重分别比对照组提高了5.02%(P=0.31)和6.38%(P=0.34);9-10周试验组采食量比对照组提高了7.22%(P=0.09),日增重比对照组提高了3.80%,差异不显着。全期试验组采食量比对照组提高了2.23%(P=0.23),日增重比对照组提高了2.03%,差异不显着。由此表明:Z9CCK重组蛋白主动免疫能提高生长肥育猪的采食量和日增重。5.用Z9CCK重组蛋白主动免疫生长肥育猪,通过对猪采食前、采食中、采食后血液的动态采集,研究Z9CCK主动免疫对血清激素及其它成分的影响。Z9CCK主动免疫生长肥育猪饲养试验(见上一节)结束后,试验组和对照组各选4头健康、体重一致的猪,耳静脉安装留置针,对其实施采食前0min、开始采食后15min、30min、1h、2h连续动态采血,用相关试剂盒测定血浆中CCK、胰岛素、血糖的浓度。试验结果表明:开始采食后1h,试验组血液中CCK比对照组低4.73%(P=0.13);开始采食后15min,试验组猪体内胰岛素浓度显着低于对照组(P＜0.05),比对照组低31.62%;开始采食后1h,试验组猪比对照组血糖浓度高17.35%(P=0.19)。由此表明:Z9CCK重组蛋白主动免疫生长肥育猪对猪血液中CCK、胰岛素、血糖具有调节作用,为进一步阐释CCK调节动物采食量的生理机制提供理论基础。综上所述,得出如下结论:应用基因工程技术在大肠杆菌表达系统中可以成功表达猪CCK-33多串联体重组蛋白,表达出的Z9CCK重组蛋白占菌体总蛋白的35.6%左右。经试验证明Z9CCK重组蛋白具有良好的抗原性,且具有CCK-8的抗原性。用Z9CCK重组蛋白作为抗原主动免疫产蛋鸡可以有效地诱发蛋鸡产生CCK抗体,CCK抗体可以有效地沉积到鸡蛋中去,将效价高峰期的鸡蛋收集起来进行喷雾干燥加工可以制备较高效价的CCK卵黄粉,Z9CCK可以作为CCK卵黄抗体生产的候选抗原。用Z9CCK重组蛋白主动免疫生长肥育猪可以提高生长肥育猪的采食量和日增重。Z9CCK重组蛋白主动免疫生长肥育猪对猪血液中CCK、胰岛素、血糖具有调节作用。
徐文华[6]2007年在《猪源胆囊收缩素33肽（CCK33）基因的克隆、表达及免疫原性研究》文中研究指明胆囊收缩素(cholecystokinin，CCK)，是一种由十二指肠和空肠的内分泌细胞Ⅰ细胞分泌的脑肠肽，广泛分布于动物的中枢神经系统、肠道、外周血液、外周神经及某些组织器官中。CCK作为一种内源性饱感激素，具有收缩胆囊、促进胰酶分泌、抑制胃排空、促进胰岛素释放等生物学功能，因此在调节动物摄食量方面发挥重要的作用。国内外广泛采用免疫调控技术来降低动物内源性CCK的含量，从而达到增加动物摄食量，提高动物生产性能的目的。在已有的研究中多数采用人工合成的CCK8作为研究材料，研究成本较高。CCK8分子量小，通常需将其与大分子载体交联后才具有免疫原性，交联效率不稳定，增加了研究的难度。而且交联载体不同，免疫效果也有差异，对于最佳交联载体的选择目前没有明确的报道。采用分子生物学的方法，构建基因工程蛋白可以改变这一现状，并且已经逐步成为目前研究的热点。CCK的分子形式具有多样性，CCK8被公认为是CCK的外周和中枢生物学活性的最小单位。CCK33是存在于肠道粘膜中的最稳定的分子形式，适用于体外重组蛋白的构建与表达。为得到大量的来源广泛、价格低廉、免疫原性良好的猪源胆囊收缩素基因工程蛋白，使得在进一步的深入研究工作中，能够大幅度的降低研究成本，本论文开展了以下的工作并取得了阶段性的成果：1．克隆了猪源胆囊收缩素33肽(CCK33)基因。提取猪十二指肠肠粘膜总RNA，并以反转录的cDNA为模版，设计特异引物成功克隆出与预期相符的100bp左右的CCK33基因。2．成功利用T载体构建了CCK33基因同向4串联体。利用NheI和XbaI的同尾酶特性及T载体上的单一酶切位点NdeI，成功构建了与预期设计相一致的480bp左右的CCK33同向4串联体，使CCK33基因达到免疫原的要求。并且此种串联方法并不局限于某个特定的基因，作为一种通用的手段，只需要稍加改造就可以适用于其他基因。3．构建了CCK33基因4串联体原核表达载体，并在大肠杆菌表达系统中获得成功表达，同时完成了相应的蛋白质纯化及相关条件的优化。构建pET28a-4CCK33重组表达载体；将其转入E．coli BL21(DE3)进行重组蛋白的表达，实验确立使用TYPG培养基，在1mmol／L的IPTG终浓度下37℃诱导表达4h，SDS—PAGE分析证实产物大小为16kD左右，与目的蛋白大小相符；目的蛋白以不溶性的包涵体形式出现在细胞破碎后的沉淀重悬液中，通过不同的洗涤缓冲液对包涵体进行反复洗涤，最终纯化得到纯净的CCK33基因4串联体融合蛋白。4．制备了CCK33基因4串联体的多克隆抗体并检测其免疫原性。用纯化得到的目的蛋白做为抗原，采用皮下多点注射方法免疫新西兰白兔，制备到目的蛋白的特异性多克隆抗体，通过ELISA测定效价为1：64000；Western杂交显示抗体特异性好，并同时证明了CCK33基因4串联体具有免疫原性。5．采用融合蛋白表达策略构建pGEX—CCK33原核表达载体，并获得成功表达，优化诱导提纯条件，获得了纯净的GST—CCK33蛋白，并对其免疫原性进行检测。将CCK33单基因构建入pGEX-4T-1表达载体，实验结果表明在0.05mmol／L的IPTG终浓度下37℃诱导表达4h；得到大小约为29kD左右的可溶性GST—CCK33蛋白，通过谷胱甘肽琼脂糖小珠纯化得到纯净的目的蛋白，ELISA结果表明GST—CCK33可与抗CCK33基因4串联体蛋白的抗体结合，表明GST—CCK33具有一定的免疫原性。总之，本论文从不同的构建策略出发，分别得到了不同的猪源胆囊收缩素蛋白，即CCK33四串联体重组蛋白与GST—CCK33融合蛋白，为以后进行CCK各种生理功能的研究提供了来源广泛价格低廉的研究材料，节约了研究成本。同时对研究不同重组形式的基因工程蛋白免疫原性之间的差异及其在动物体内作用效果的差异提供了前提，为开展胆囊收缩素蛋白大规模应用于动物生产的可行性研究奠定了基础。
参考文献：
[1]. 胆囊收缩素主动免疫产蛋鸡的营养生理效应研究[J]. 丁雪梅, 张克英, 陈代文. 畜牧兽医学报. 2005
[2]. 胆囊收缩素主动免疫产蛋鸡的营养生理效应研究[D]. 丁雪梅. 四川农业大学. 2003
[3]. 胆囊收缩素主动免疫对产蛋鸡营养生理效应的影响[C]. 丁雪梅, 张克英, 李静, 谭雪梅, 陈代文. 中国畜牧兽医学会动物营养学分会——第九届学术研讨会论文集. 2004
[4]. 胆囊收缩素主动免疫对猪的营养生理效应及其机制的研究[D]. 袁中彪. 四川农业大学. 2004
[5]. 猪胆囊收缩素基因的克隆表达及其调节猪采食量的生物学功能研究[D]. 苟钟勇. 华中农业大学. 2008
[6]. 猪源胆囊收缩素33肽（CCK33）基因的克隆、表达及免疫原性研究[D]. 徐文华. 四川大学. 2007
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