刘红亮[1]2003年在《伪狂犬病病毒河南株的分离鉴定与TK基因的克隆和序列分析》文中研究指明从郑州某养猪场一患病小猪的脑和脾、肾等内脏内，我们分离到一株病毒。接种到BHK细胞株后，该病毒能产生典型的细胞病变(CPE)，感染的细胞融合，形成合胞体。采用固定病毒、稀释血清的方法进行中和实验，证明该病毒株能被猪伪狂犬病毒(PRV)的阳性血清所中和，其中和效价为1：107，对照伪狂犬病毒株鄂A株中和效价为1：209。用Reed-Muench法测该病毒的TCID_(50)滴度为10~(-6.64)/0.1ml。用该病毒肌肉注射成年健康家兔，能引起家兔嘶咬注射部位，四肢麻痹等典型的伪狂犬病症状。以上试验证明该病毒确为伪狂犬病毒。 根据GeneBank公布的伪狂犬病毒的TK基因序列，我们设计了一对引物，然后利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增其TK基因，TK基因克隆到pGEM-T-Easy载体后，利用PCR技术，酶切反应技术进行鉴定后，再送到大连宝生物公司进行测序。测序结果显示，我们得到了TK基因的完整序列，该基因长945bp,编码315个氨基酸。 利用DNA Star软件将分离毒株的TK基因序列与LA株,KOR株的TK基因序列进行比较发现，同源性均为97.3％。这说明TK基因是较保守的。我们同时发现在分离株的ATG下游第706，第924个核苷酸处有单个碱基的缺失，在第848个碱基处有13个碱基的缺失，造成第236个氨基酸后的氨基酸序列变化，与对应两序列同源性下降，均为75.9％。氨基酸序列发生变化，但该毒株的毒力并没下降，此结果说明，无论是开发PRV的TK基因缺失苗，还是开发以TK基因缺失为基础，以PRV为载体的基因工程多价苗，缺失第706个核苷酸以后的序列，可能得不到理想结果。 在试验中，我们提出了PRV基因组提取的新方法，为猪伪狂犬病的快速诊断提供了一些帮助，该方法同时可用于其它病毒基因组的提取；我们 刘红亮 厂n大业人学儿门体叶毕业论文 得到了完整的TK基因，为研制猪伪狂大病的TK基因缺失基因工程苗做 好了基础工作，同时也可由此出发，开展以PRV为载体的基因工程多价苗 的研究IK基因序列分析的结果，对于进一步研究胸昔激酶上氨基酸的功 能位点有一定帮助，对于确定构建TK缺失载体时应缺失的位置有点意义。
徐国, 梁海英, 曾智勇, 汤德元, 王彬[2]2018年在《伪狂犬病毒(PRV)GZ-JS2017株的分离鉴定及主要毒力基因分子特征分析》文中认为为查明贵州省遵义地区某规模化养殖场猪只发生急性死亡的病因,以及明确病原主要毒力基因的分子特征。本试验采用PCR技术、细胞接种试验、动物试验及透射电子显微镜观察等方法进行病原的分离鉴定,并对该病原的主要毒力基因进行克隆、测序及生物信息学分析。结果显示:PCR检测可扩增出PRV特异性核酸阳性条带,接种Vero细胞后可见明显CPE现象,在透射电子显微镜下可见囊泡中呈圆形、160nm左右的成熟病毒粒子,胞核中可见病毒包涵体和实心、空心2种无囊膜病毒粒子;接种健康猪可引起神经症状,最后麻痹死亡;通过生物信息学分析显示该毒株的gE、gC、gD及TK基因序列均与参考毒株中湖北HNX株和河南HN1201株相对应的核苷酸同源性最高,且在gE基因的48位和496位都有1个天冬氨酸(Asp)的插入;根据gE、gC、gD及TK基因序列的遗传进化树结果显示本次分离毒株与2011年以后所分离鉴定的变异毒株属同一分支。说明本试验成功分离鉴定一株猪伪狂犬病病毒变异毒株,以期为贵州省猪伪狂犬病病毒的流行及变异提供一些参考。
余秋颖, 常洪涛, 陈文定, 陈陆, 明星[3]2014年在《2012-2013年新流行猪伪狂犬病病毒的分离鉴定及其gE、TK、gD基因序列分析》文中提出2012年伊始,猪伪狂犬病(pseudorabies,PR)在河南省部分地区再次暴发。为探寻其中缘由,对2012年3月至2013年6月间采集的疑似PR病料接种Vero细胞并经PCR鉴定,分离到4株伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)。同时对该4株病毒的gE、TK和gD基因进行PCR扩增、克隆、测序及分析。序列分析显示:4株PRV河南分离株的gE、TK、gD基因有些核苷酸及氨基酸发生变化,不同于参考毒株;遗传进化分析显示:4株PRV河南分离株形成单独1个小亚群,与中国其他地区分离株之间的亲缘关系较近,与欧洲、南美洲分离株之间的亲缘关系较远,推测此4株河南分离毒株是新型国内流行株。
龚才伟[4]2016年在《一株伪狂犬病病毒的分离鉴定及其gE基因的遗传进化分析》文中进行了进一步梳理伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV;Aujeszky’disease virus,ADV),属于疱疹病毒科(Herpesvirdae)α-疱疹病毒亚科,PRV可感染多种家畜及野生动物,其中猪最易感,也最为严重,是该病毒的自然宿主和贮存者。PRV可造成严重的经济损失,被我国列为2类传染病。当前,国内使用的PRV疫苗有猪伪狂犬弱毒疫苗、野毒灭活苗和基因工程缺失疫苗。疫苗的广泛使用有效地控制了PR的流行,部分国家依靠疫苗已经逐渐消灭了PR,我国也在2010年前基本控制了PR。但自2011年以来,童光志、田志军、李学伍和陈焕春等相继报道了在吉林、黑龙江、河南和山东等多个省份免疫猪群暴发PR的病例。发病猪场公猪出现体温升高、阴囊炎,母猪屡配不孕或者配种后产弱仔、死胎或流产,仔猪腹泻、伴发神经症状和高死亡率。张青占、赵鸿远和潘宵等分别从河南、黑龙江、江苏和吉林等多个省份发病的免疫猪场中分离到PRV,且实验证明部分分离株为变异PRV强毒株,表明现有疫苗不能完全保护免疫猪群,仍有暴发PR疫情的可能。近几年,陕西省猪群PR发生的频率呈上升趋势,为分析陕西省猪群PR的流行情况,本研究对陕西省12家规模化猪场进行了采样和PRV检测,并对其中某疑似发生PR的猪场进行了实验室诊断和病毒分离鉴定及遗传进化分析,研究内容和结果如下:1.陕西省规模化猪场PRV感染状况的调查。选取陕西省具有地域代表性的12个PR免疫过的猪场,随机采取经产母猪血样,分离血清,共获得血清样品78份,使用PCR和ELISA PRV-g E抗体检测方法对血清样品进行检测。结果显示,4个猪场PRV PCR检测阳性,占抽检猪场的33.33%;14份血清PRV PCR检测阳性,占检测样品数的17.95%;5个猪场PRV g E抗体阳性,占抽检猪场的41.46%;17份血清PRV g E抗体阳性,占检测样品数的21.79%。2.发病场猪PR的诊断及PRV的分离鉴定。2015年10月陕西某猪场暴发疑似PR的疫情,采取发病仔猪的血液、脑、脊髓、肝脏和脾脏,通过ELISA、PCR、动物试验等对病例进行实验室诊断,最终确定为PRV感染。将病料处理后接种BHK-21细胞进行PRV分离,经连续6次传代,细胞出现病变规律稳定,获得效价稳定的病毒,测定TCID50为10-5.386/0.1m L。通过PCR检测、家兔接种、鸡胚接种等试验对病毒进行了进一步鉴定,鉴定为PRV,将其命名为SX-10-2015。3.PRV SX-10-2015株g E基因的扩增与序列分析。为进一步研究PRV陕西分离株SX-10-2015的遗传进化地位,对分离株g E基因进行了扩增和测序,将获得的g E基因序列与近些年来流行的PRV毒株、本实验室2006年分离的WG株、以及国内外经典PRV毒株的g E基因序列进行了同源性比对分析,并构建了遗传进化树。结果发现分离株SX-10-2015与国内近年的PRV流行毒株GD-4-2013株、JN和WZ株遗传距离较近,属同一分支;与国外Kaplan、Ni A3和00V7分离株遗传距离较远,属于不同分支;分离毒株SX-10-2015的g E基因编码氨基酸同源性分析显示与GD-4-2013分离株和He N1分离株同源性分别为99.7%和99.3%;而其与Ea和FA PR疫苗株g E氨基酸同源性分别为99.3%、98.8%和98.8%。以上研究结果提示,陕西省规模化猪场PRV阳性率和猪个体PRV阳性率均较高;分离的SX-10-2015株g E毒力基因核苷酸和氨基酸序列与近年报道的变异株同源性较高,遗传进化地位更近,但其氨基酸同源性与国内疫苗毒株Ea和FA同源性也高达98.8%,疫苗免疫能否为SX-10-2015株提供免疫保护仍需进一步研究。
郭广君[5]2013年在《猪伪狂犬病病毒野毒与基因缺失疫苗株鉴别检测方法的建立及应用》文中认为以本实验室分离保存的PRV SA强毒株，根据GenBank中伪狂犬病病毒全基因组序列设计了9对引物，扩增出目的基因，并将目的基因分别与T载体连接转化，挑取阳性菌落摇菌。分别进行PCR、单酶切和双酶切叁种方法对阳性克隆进行了鉴定。成功克隆目的基因gI、gE、gD、gG、28k基因。对所得序列进行Blastn分析，并递交到DDBJ/EMBL/GenBank数据库中，登录号分别为AB440240（gG）、AB440243（gE）、AB440295（gI）和AB44024（Tk）。针对gI、gE、28K、TK四个基因序列特异性位点，利用5条引物对强毒株SA株、gI-/gE-/PRV SA双基因缺失株和Bartha K61疫苗株进行了扩增，得到2061bp、1323bp、801bp和963bp特异性目的条带。Bartha K61疫苗株基因组检测最小浓度为136pg/μL。建立了针对野毒和两种疫苗株的PCR鉴别诊断方法。经测序得到gI-/gE-/PRV SA双基因缺失株gI-/gE-序列，GenBank登录号为GU262988.1，强毒株SA株TK基因GenBank登录号为AB44024。明确了gI-/gE-/PRV SA双基因缺失株（缺失gI和gE部分序列共计738bp）和PRV BarthaK61疫苗株(部分gI基因，全部的gE和US9基因和部分US2基因共计3489bp)确切位点。建立了SYBR Green I实时定量PCR方法检测伪狂犬病毒gE基因缺失毒株。灵敏度比传统PCR方法的灵敏度高1000倍，前者可达1.75个拷贝/μL，后者为1.75×103个拷贝/μL。该方法可检测出PRV，不与PCV2、PPV、CSFV、PRRSV病毒发生交叉反应。利用gE基因建立的荧光定量方法对两株野毒株、我国疫苗市场中的6种伪狂犬病活疫苗进行了检测，结果符合病毒遗传背景。对山东区域分离伪狂犬阳性病料进行检测，发现2株gE基因阳性，测序分析，发现gE的抗原位点部分碱基突变。建立了gE-ELISA检测方法的建立；检测由山东各地送检的不同猪场的240份疑似PRV感染血清样本，gE-PRV抗体检测阳性率27%，IDEXX HerdChekELISA Kit检测阳性率25.8％，阳性符合率95.19%。建立了PRV gD-ELISA检测方法，确定了最佳反应条件和判定标准；检测了来自山东、河南、河北等地的306份血清样本，检出阳性258份，阴性58份，血清抗体阳性率为84.3%。
黄宝钦[6]2009年在《猪伪狂犬病病毒FZJX株的分离鉴定及TK基因的克隆与序列分析》文中提出本试验从福州郊区某猪场病死猪的肺脏中分离到一株病毒,运用相关的试验方法对该分离病毒进行鉴定,结果证实该分离病毒为伪狂犬病病毒,并对该株病毒的TK(胸苷激酶)基因进行克隆和序列分析。该株病毒初次接种Marc-145细胞未见明显的细胞病变,经过一代盲传,从第二代开始产生了细胞圆缩、聚集、溶解和脱落等典型的细胞病变,并可见到大量的多核巨细胞,产生细胞病变的时间为48h左右;经过连续传代后,产生细胞病变的时间明显缩短,基本稳定在20h左右。在电镜下能观察到直径约为150-180nm、有囊膜、呈圆形或椭圆形的病毒粒子,囊膜表面有呈放射状排列的纤突;细胞核内可见到包涵体;病毒粒子在胞质囊泡和细胞膜上出芽生殖。该病毒对鸡红细胞和大鼠红细胞没有血凝活性,而对小白鼠红细胞具有血凝活性,其血凝效价为1:64。对鸡胚做绒毛尿囊膜接种时,死亡的鸡胚在绒毛尿囊膜上出现白色痘斑样病变,尿囊膜水肿、充血,胚体头盖部突起,全身弥漫性出血;而对鸡胚做尿囊腔接种时,胚体出现类似的病变,但在绒毛尿囊膜上没有出现痘斑样病变。病毒液接种家兔和小白鼠,分别经过59h、96h死亡,两者都出现神经症状,但没有出现奇痒和啃咬的症状。病毒液接种断奶仔猪,仔猪出现神经症状,同时体温升高达41℃;接毒10天后体温和食欲恢复正常,神经症状消失,仔猪表现为耐过。用分离病毒感染细胞,提取病毒和细胞的总DNA,在PRV的TK基因上设计一对特异性引物,通过PCR技术成功扩增出约917bp的特异片段,与预期结果一致,进而从核酸水平证实了所分离的病毒为PRV。以上试验结果表明从该猪场分离到的病毒是猪伪狂犬病病毒,并命名为FZJX株。通过对TK基因进行克隆和序列分析,我们发现PCR扩增的917bp基因片段中含有一个长为897bp的开放阅读框,共编码298个氨基酸。利用DNAStar软件将该序列与GenBank中收录的Ea株(序列号为AF080571)、SH株(序列号为AF199413)、Min-A株(序列号为171242)、LA株(序列号为AY173125s1)、Korea株(序列号为217095)、USA株(序列号为E00505)、Spain株(序列号为X55001)、FJFZ株(序列号为FJ477295)的TK基因进行序列比对,并推导出其编码的氨基酸序列,分别对其进行同源性比较和进化树分析。同源性比较结果显示,FZJX株TK基因与USA株、Ea株、FJFZ株、Korea株、LA株、Min-A株、SH株、Spain株TK基因的同源性分别为:93.3%、99.7%、99.3%、99.4%、99.8%、98.3%、98.5%、99%;其推导氨基酸序列的同源性分别为84%、100%、99.7%、99.3%、100%、98.7%、54.7%、98.7%。进化树分析结果表明,TK基因的变异具有一定的地域性,而其推导氨基酸的变异不具有地域性。
高晓云[7]2014年在《猪伪狂犬病毒河南流行株的分离鉴定与生物学特性研究》文中认为伪狂犬病(PR)是由伪狂犬病毒(PRV)引起的多种家畜、家禽和野生动物的一种以发热、奇痒(除猪外)及脑脊髓炎为主要症状的一种急性传染病。PRV可以感染不同年龄段的猪,主要引起妊娠母猪流产、产死胎和木乃伊胎;哺乳仔猪出现神经症状,衰竭死亡,死亡率几乎高达100%。我国自1947年刘永纯从猫体内分离到PRV以来,已有20多个省市报道发生了该病。在生产实践中,主要依靠疫苗尤其是基因工程缺失疫苗对PR进行防制,从而使该病得到有效控制。但2012年春季以来,在河南、吉林、黑龙江等多地区使用PRV基因缺失苗免疫的猪场出现疑似PR病例,本试验分离并鉴定了 PRV河南流行株,进行了gE、gC全基因测序及相关生物学特性研究,探索了河南分离株NY的免疫原性。采用PCR方法对河南不同地市采集的疑似PRV感染病料进行PCR检测,将PCR检测为阳性的病料接种ST细胞,分离到9株PRV,分别命名为NY、ZK、M5、JY、GY、MZ1、MZ2、LGX、ZM。9株病毒均能在ST细胞上出现较稳定的CPE,且均能扩增出特异性gE基因片段(429bp),传代至第7代时病毒毒力效价基本稳定在105.6TCID50/0.1mL～109TCID50/0.1mL。9株PRV接种6周龄雌性小鼠,72 h小鼠先后均死亡。以NY株为例进行理化特性试验,结果表明,对分析纯氯仿敏感;对酸、碱、热有较强抵抗力;对胰蛋白酶敏感;对紫外不敏感。经电镜观察,可看到大小均一、近似圆形的病毒粒子,大小约110～150nm,囊膜表面有呈放射状排列的纤突。证实分离的9株病毒均为PRV野毒株。参照GenBank中发表的gE基因序列(AF171937),使用引物设计软件Primer5.0设计了 1对引物,扩增9株PRV野毒株的gE全基因片段,克隆到克隆载体pMD(?)18-T中,并对其序列进行测定,以及gE基因序列分析及进化分析。结果表明9株分离株之间的核苷酸同源性介于99.9%～100%:9株PRV分离株处于一个相对独立的小分支上,且与近年国内的分离毒株具有较近的亲缘关系;其gE基因推导的氨基酸序列均在48位和494位均插入1个天冬氨酸,均在448位和510位发生氨基酸置换(V448I,G510S),仅NY株在385位发生氨基酸置换(T→M),仅ZK株在530位发生氨基酸置换(S→G)。参照GenBank中发表的gC基因序列,使用引物设计软件设计了 1对引物,扩增9株伪狂犬野毒株的gC全基因片段,并对其序列进行测定,以及gC基因推导的氨基酸进行分析。9株PRV分离株之间的核苷酸同源性介于99.9%～100%,且均在第63位氨基酸后连续插入或缺失7个氨基酸(AASTPA)。将猪伪狂犬病毒NY株大量培养后,经0.3%甲醛灭活,加入弗氏佐剂制备PRVNY株灭活油乳剂。用PRVNY株灭活油乳剂、Bartha-K61株商品苗和湖北98株商品苗分别免疫接种6周龄雌性昆明小鼠,28 d后采血分离血清,进行血清中和试验,并用PRVNY株进行攻毒保护试验,结果PRV NY株灭活油乳剂免疫组小鼠中和抗体最高,且小鼠完全被保护,而Bartha-K61株商品苗和湖北98株商品苗免疫小鼠仅部分保护,且中和抗体低,表明PRV NY株与Bartha-K61株和湖北98株存在一定的抗原交叉性,但抗原差异较大。
薛双[8]2008年在《猪伪狂犬病病毒河南株的分离鉴定、gE基因克隆与序列分析及原核表达》文中研究表明参照genebank中公布的minA株PRV gE基因序列(序列号:AY170318)设计了一对特异性引物,通过一系列条件优化建立了PRV的PCR诊断方法。2007年作者从河南省部分发病猪场采集临床症状明显的、疑似PR的病死仔猪内脏和脑组织,利用所建立的PCR方法进行检测,将PRV阳性并且无圆环病毒混合感染的病料接种PK-15细胞,连续传代后均出现与阳性对照一致的典型病变,并且利用PCR方法对细胞培养物进行了鉴定。结果表明,成功分离到4株PRV,且无圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒污染,将分离株分别命名为HNJZ株(焦作株)、HNDF株(登封株)、HNTY株(汤阴株)、HNNY株(南阳株)。参照genebank中公布的minA株PRVgE基因序列(序列号:AY170318)设计了两对特异性引物,分别用于gE全基因和主要抗原表位基因的扩增,并通过条件优化建立了相应的PCR扩增方法。利用该方法从分离到的HNJZ株中扩增出了gE全基因片段,而从分离到的4株PRV中均扩增出gE主要抗原表位基因片段。将所扩增到的基因片段克隆到PGM-T载体中,通过筛选与鉴定获得了相应的阳性重组质粒,并测序获得了插入片段的基因序列,进行了相应分析。HNJZ株与国内外其他毒株的gE基因序列比对结果显示:不同地域分离株核苷酸同源率达97.3%-99.9%,推导氨基酸序列同源率达94.8%-99.8%,这说明gE基因比较保守;HNJZ株与国内的minA株及韩国的yangshan株同源率最高,而且结合遗传进化分析可知HNJZ株与国内minA株和国外的yangshan株亲缘关系较近;HNJZ株gE基因所编码的氨基酸序列中发生了4处变异,但均不在其主要抗原表位区内。4株河南PRV分离株的gE基因主要抗原表位区的核苷酸同源率和氨基酸同源率均在96%以上,因为4株PRV的分离地在河南省内的跨度较大,所以可以初步推测河南省内不同地方PRV变异很小。而且高度的同源性也进一步说明gE基因主要抗原表位区很保守,这为gE基因主要抗原表位区的表达及相应诊断方法的建立提供了科学的理论依据。在以上的研究基础之上,根据HNJZ株的gE基因序列,设计了一对引物用于扩增编码gE主要抗原表位的基因片段,并将其克隆到表达载体pET-28a中,构建了gE基因主要抗原表位的原核表达载体。经过筛选与鉴定,获得了阳性转化子,经IPTG诱导表达的产物通过SDS-PAGE电泳检测,表明该融合蛋白得到了表达,且一系列的条件优化使其表达效率得到了提高。经Western- blotting分析,重组蛋白有良好的免疫反应性,为单克隆抗体的制备及诊断方法的建立奠定了基础。
曾显成[9]2007年在《猪伪狂犬病病毒FZ株的分离鉴定及gD基因的克隆》文中研究指明本试验从福州郊区某猪场发生疑似伪狂犬病的仔猪中分离到一株病毒，进行生物学特性分析，并对囊膜蛋白gD基因进行克隆和序列分析。该毒株初次接种Vero细胞，第1、2代细胞病变不明显，盲传第3代时，24h后细胞开始变圆、集聚成簇、折光度加强，继而萎缩、脱落、出现空洞，可见合胞体。从第4代开始，16h开始出现典型的细胞病变。连续传15代，均产生典型的细胞病变。把适应Vero细胞的病毒液接种MDCK细胞，可得到与Vero细胞相同的细胞病变，连续传20代，均可产生稳定的细胞病变。试验证实该病毒具有泛嗜性和融细胞性，符合疱疹病毒有关特征。运用琼脂糖固体培养基进行蚀斑克隆纯化病毒，得到了性状稳定的病毒克隆株，并对克隆株增殖培养作为本试验的种毒进一步试验。该病毒感染MDCK细胞制作细胞组织超簿切片，电镜观察可见直径约110-180nm大小不等、不规则圆形、有囊膜的伪狂犬病毒粒子。该病毒在MDCK细胞上TCID_(50)为10~(6.601)/0.1ml。用固定病毒稀释血清法进行中和试验，能被猪伪狂犬标准阳性血清所中和，其中和效价为1∶77。制作细胞飞片，8h后经伪狂犬标准荧光抗体染色，在荧光显微镜下可观察到细胞浆内呈现散在的翠绿色荧光。对乙醚、热、胰蛋白酶敏感，在pH5.0-9.0之间保持稳定，不凝聚鸡、大鼠红细胞。感染仔猪症状较轻，但在攻毒后25天，可检测到伪狂犬的抗体，并在仔猪的肺气管冲洗液中回收到同样理化特性的病毒，说明仔猪隐性感染或隐性带毒的存在。接种成兔和小白鼠均可出现典型的伪狂犬病症状，具有嗜神经性。接种大鼠和鸡均不敏感。鸡胚尿囊膜方法接种9-12日龄鸡胚，86h可见鸡胚尿囊膜水肿、出血，有大小不一白色痘斑样病灶，胚体萎缩，头盖部突起、全身弥漫性出血。试验证实，本研究所分离的病毒为猪伪狂犬病毒，并命名为PRV FZ株。根据GenBanK已发表的PRV gD基因序列(AJ271966)，设计合成一对特异性引物，采用病毒感染MDCK细胞培养物方法提取病毒基因组DNA作为模板，通过PCR技术扩增gD基因，成功地扩增出1579bp的特异性条带，其开放阅读框长1203bp，共编码400氨基酸。在gD基因的上、下游引入EcoRⅠ和HindⅢ两个酶切位点，将回收的gD基因片段克隆到载体PCAGGS，构建质粒PCA-gD，并转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞，进行抗性筛选，得转化子经PCR鉴定和双酶切分析筛选出阳性克隆。经琼脂糖电泳试验，成功的克隆到gD基因。通过对gD基因测序结果的分析，PRV FZ株gD基因与Min A株、Fa株、La株、Kaplan株、Ea株碱基序列的同源性分别是99.8％、99.6％、99.4、99.2％、99.1％，氨基酸序列的同源性分析分别是99.5％、99.0％、99.3％、97.8％和98.5％。表明不同PRV gD基因高度保守，这与整个疱疹病毒保守性是一致的。
皇甫和平[10]2004年在《猪伪狂犬病病毒豫A株的分离、鉴定及PK基因的克隆与序列分析》文中提出从河南某猪场发生疑似伪狂犬病（Pr）的仔猪体内无菌采取病料（脑、淋巴结、叁叉神经、肝脏和肾脏等组织），研磨，离心，上清液加入青、链霉素至终浓度为1000u/ml，接种长成单层的PK15细胞，连续传4代，均能产生明显的细胞病变（CPE）；取病料悬液和细胞培养液接种家兔进行动物实验，家兔没有表现出典型的Pr症状，接毒后20天利用猪伪狂犬病乳胶凝集检测试剂盒检测到伪狂犬病病毒（Prv）抗体，滴度达1:4－1:16。参考GeneBank公布的猪伪狂犬病病毒的PK基因序列，自行设计了一对针对Prv PK基因的引物，进行聚合酶链式反应（PCR），在该份病料和第4代细胞培养液中均可检测到预期大小的全长目的基因片段。以上试验证明分离到了河南地方株Prv，命名为豫A（Yu A）株。利用上述引物，对来自河南省的另一份疑似Pr病料以及闽A（MinA）株细胞毒进行PCR扩增，均扩增到了全长目的基因片段，将叁份扩增产物分别克隆于pMD 18-T 载体，对重组质粒作PCR、酶切分析和序列测定，证实了克隆片段的特异性。重组质粒分别命名为MinA-PK、YuA-PK和YuB-Pk。叁个序列已被Genebank收录，收录号分别为：AY590265、AY644398、AY644399。借助生物学分析软件，将 Prv MinA株,YuA株和 YuB株 PK基因的核苷酸序列与已被Genebank收录的 Prv Er 株、NIA-3 株及Ka株的 PK 基因核苷酸序列进行同源性和差异性比较，六个 Prv 毒株 PK 基因核苷酸序列间具有很高的同源性，最低者为YuA株和Ka株，其同源性为97.1％；YuA株在282位比其它毒株少一个G ，导致缺失突变，93位以后氨基酸序列的同源性大大降低，该毒株与MinA株，YuB株，Er株，Nia-3和Ka株同源性分别降为30.7％，30.7％，30.2％，29.5％,19.5％，明显低于其它组间的最低值 86.1％，分离毒对家兔的不致病性可能与该位点的缺<WP=6>失突变有一定关系。以NiA-3株为标准，在其 238 至 249位是一个高变区，在 1081至 1098 位有一个高变区，这两个高变区没有打乱读码框，也没有破坏PK激酶的保守氨基酸位点，推测这两个区域对于PK激酶结构的稳定性和功能的发挥是非必需的。 本实验为了解河南省的Prv特性、分子流行病学、毒株之间的进化关系、进一步了解PK基因的功能和构建PrvPK缺失株奠定了基础，并为用Prv PK基因构建载体制备基因工程多价苗提供了新的思路和参考依据。
参考文献：
[1]. 伪狂犬病病毒河南株的分离鉴定与TK基因的克隆和序列分析[D]. 刘红亮. 河南农业大学. 2003
[2]. 伪狂犬病毒(PRV)GZ-JS2017株的分离鉴定及主要毒力基因分子特征分析[J]. 徐国, 梁海英, 曾智勇, 汤德元, 王彬. 病毒学报. 2018
[3]. 2012-2013年新流行猪伪狂犬病病毒的分离鉴定及其gE、TK、gD基因序列分析[J]. 余秋颖, 常洪涛, 陈文定, 陈陆, 明星. 中国兽医学报. 2014
[4]. 一株伪狂犬病病毒的分离鉴定及其gE基因的遗传进化分析[D]. 龚才伟. 西北农林科技大学. 2016
[5]. 猪伪狂犬病病毒野毒与基因缺失疫苗株鉴别检测方法的建立及应用[D]. 郭广君. 吉林大学. 2013
[6]. 猪伪狂犬病病毒FZJX株的分离鉴定及TK基因的克隆与序列分析[D]. 黄宝钦. 福建农林大学. 2009
[7]. 猪伪狂犬病毒河南流行株的分离鉴定与生物学特性研究[D]. 高晓云. 河南农业大学. 2014
[8]. 猪伪狂犬病病毒河南株的分离鉴定、gE基因克隆与序列分析及原核表达[D]. 薛双. 河南农业大学. 2008
[9]. 猪伪狂犬病病毒FZ株的分离鉴定及gD基因的克隆[D]. 曾显成. 福建农林大学. 2007
[10]. 猪伪狂犬病病毒豫A株的分离、鉴定及PK基因的克隆与序列分析[D]. 皇甫和平. 河南农业大学. 2004
标签：生物学论文; 畜牧与动物医学论文; 猪伪狂犬病论文; 基因合成论文; 同源重组论文; tk论文; 同源基因论文; 氨基酸论文; pcr论文;