冯琦, 孙秉中, 赵永同, 孙凯, 颜真[1]1999年在《慢性粒细胞白血病特异性单、双及叁单位核酶载体的构建》文中研究指明本文拟针对在慢性粒细胞白血病发病中起关键作用的ｂｃｒａｂｌ 融合基因， 构建特异性的系列核酶载体。为此，我们针对ｂｃｒａｂｌ 融合位点设计、合成了３ 个相邻的锤头状核酶。通过基因重组将３ 个单核酶按顺序定向克隆入改建的ｐＧＥＭ３ｚｆ 载体中，构建了ｂｃｒａｂｌ 单核酶、双核酶及叁核酶体外转录载体， 并在此基础上将叁单位核酶克隆入ｐ ＤｏＲｎｅｏ 载体中构建叁核酶逆转录病毒载体。此外， 通过ＰＣＲ 方法， 扩增了ｂｃｒａｂｌ 融合位点附近约３７６ｂｐ 的序列，成功地构建了ｂｃｒａｂｌ 融合基因体外转录载体。本文构建的ｂｃｒａｂｌ 特异性系列载体，为今后遴选特异、高效的核酶打下了基础，并为将核酶用于自体骨髓移植的体外骨髓净化创造了条件。
陈波斌[2]2003年在《核酶和RNA干扰靶向治疗慢性粒细胞性白血病的实验研究》文中提出核酶和RNA干扰靶向治疗慢性粒细胞性白血病的实验研究 研究目的 利用带有导引序列(GS)的RNase P亚单位M1RNA(M1-GS RNA)和RNA干扰技术(RNA interference, RNAi)靶向作用于具有特征性靶基因BCR-ABL mRNA的慢性粒细胞性白血病(chronic myelogenous leukemia, CML)细胞株K562细胞，观察它们对于靶基因及其表达产物的切割效果及细胞凋亡的变化，探索CML靶向治疗的新方法。 研究方法 1．M1-GS RNA细胞外切割实验和含M1-GS RNA模板序列真核表达载体的构建 设计BCR-ABL mRNA融合区域为GS识别靶点，以pTK117为模板(含M1RNA模板序列)通过PCR方法合成M1-GSRNA模板序列，克隆到pUC19上得到pGS210；人工合成与BCR-ABL mRNA融合位点前后序列25个碱基同源的一段DNA模板，克隆到含有T7启动子的pGEM-7zf(+)上，得到pBCR-ABL；pGS210和pBCR-ABL均经限制性酶切和测序鉴定，然后进行细胞外转录，将二者转录产物按照一定摩尔比例混合，进行细胞外核酶切割实验，利用放射自显影检测切割效率和作用的特异性；将M1-GS RNA模板序列克隆到真核表达载体pNAV-1上，得到pAVGS4，进行大量抽提、纯化。 2．检测pAVGS4转染K562细胞后不同时间BCR-ABL mRNA和p210表达的变化 以X-tremGENE Q2介导pAVGS4和pNAV-1(作为空白对照)转染K562细胞株，转染后24、48、72和96小时分别收集细胞，以Trizol法抽提总RNA，作RT-PCR(人源性β-actin作为内参照)通过半定量比较转染后不同时间BCR-ABL mRNA量的变化；收集转染后48小时和96小时实验组和对照组的细胞，抽提蛋白质，作Western Blotting，比较不同时间BCR-ABL的表达产物p210在量上的变化。 3．检测转染核酶后不同时间细胞凋亡的变化： 收集转染后24、48、72、96小时的细胞，分别应用AnnexinV-FITC+PI染色和TUNEL-FITC法通过流式细胞术检测细胞凋亡情况，比较不同时间细胞的凋亡率；收集转染后72小时实验组和对照组的细胞，通过透射电子显微镜观察法比较两组细胞形态的变化。 4．含有siRNA模板序列RNA表达载体的构建及对K562细胞的作用效应 以BCR-ABL mRNA融合区域为作用位点，根据小干扰RNA(small interfering RNA，核酶和RNA干扰靶向治疗慢性粒细胞性白血病的实验研究siRNA)模板的设计原则，设计、合成2条寡核昔酸链，退火后构建到psilencerl .0-u6上，经限制性酶切和测序鉴定，大量抽提纯化，以x一tremeGENE QZ转染K562细胞;收集转染后45和72小时的细胞，分别应用AnnexinV-FITC+pl染色和TLJNEL一FITC法通过流式细胞术检测细胞凋亡情况。研究结果1.含有Ml一GS州A模板序列的pGSZ10和含有底物序列的pBCR一ABL经限制性酶切 分析和测序鉴定证实构建成功;进行细胞外转录和切割实验，通过放射自显影检测 显示:Ml一GS RNA与人工底物按照1:5的当量进行混合4小时的切割率为28.6 %，以1:1的比例混合4小时的切割率为782%，对照组抗MHC的M IRNA对于 人工底物无切割作用;构建的质粒pAVGS4经限制性酶切分析和测序鉴定证实构建 成功，大量抽提纯化后的产物浓度和纯度符合转染要求。2.在p脚GS4转染K562细胞后24、48、72和96小时，作l干卜PeR分析显示:在转 染后24小时，实验组细胞内BCR一ABL mRNA随时间的延长含量下降近1个对数 级，72和96小时时BCR-ABL mRNA的含量接近，而对照组无明显改变。W七stem Blotting分析显示:实验组在48小时的灰度是同期对照组的10.4%，%小时时为 6 .7%。3.凋亡分析:转染72小时实验组和对照组的细胞作电镜分析，在实验组见到大量凋 亡细胞，而对照组少见;应用ArmexinV十PI法检测凋亡，在转染24、48、72和% 小时的凋亡率分别为4.5%、20.1%、423%和56%(p<0.0001)，而对照组在不同时 间的凋亡率5%一6%印>0.05);通过TUNEL法检测上述时间的凋亡率实验组分别 为:5.6%、24.礴%、43.20，0和58.4%(P<0.0001)，对照组的凋亡率在6%~9%(p>0.05)。4.RNAi对于K562细胞凋亡的影响:构建含有siRNA模板的pBCR6载体经限制性酶 切分析和测序鉴定，载体内含有目标序列;经大量抽提纯化后检测pBcR6的浓度 和纯度符合转染要求;在转染48和72小时应用AnnexinV+PI染色检测凋亡率为: 25.5%和48.0%(P<0.01)，而对照组分别为6.5%和6.7%(P>0.05):应用TtJNEL法检 测2个时间的凋亡率为29.8%和53%印<0.01)，对照组为7.9%和8.9%(P>0.05)。研究结论 1.本实验己成功构建含有Ml一GS RNA模板序列的真核表达载体pAVGS4，进行 细胞外切割实验显示具有特异性切割底物的效应; 2.将pAVGS4转染K562细胞株后发现Ml一GS RNA具有特异性切割BcR一ABL mRNA作用，而且随着时间的延长切割效率增加，但72小时和96小时时作用 接近;进行PZ10蛋白检测，发现Ml一GS RNA可以有效地下调该蛋白质的表达。丛塑塑旦NA干扰靶向治疗慢性粒细胞性白血病的实验研究3.应用多种方法检测发现转染pAvGs4可以有效地诱导K562细胞凋亡，在转染 24小时后随着时间的延长，实验组的凋亡率显着增加;表明Ml一GS RNA具有
柴文娟, 杨杞, 李国婧, 王瑞刚[3]2018年在《中间锦鸡儿CiMYB15基因正调控拟南芥黄酮代谢》文中提出目的:R2R3-MYB类转录因子参与调控植物初生和次生代谢。方法:从中间锦鸡儿(Caragana intermedia)干旱转录组数据库中搜索并克隆了一个R2R3-MYB基因,命名为CiMYB15(GenBank登录号MH678649);将CiMYB15基因编码区转入野生型拟南芥中,利用分光光度法测定了野生型和转基因拟南芥中总黄酮含量,并用qRT-PCR检测了转基因植物中At CHS基因的表达情况。同时采用染色体步移法克隆了CiMYB15基因的启动子序列。结果表明:(1) CiMYB15基因g DNA长度为1 960 bp,包含叁个外显子(134、131和521 bp)和两个内含子(281和893 bp);开放阅读框长度为786 bp,编码262个氨基酸。(2)克隆得到1 580 bp的启动子序列,序列中主要包含损伤诱导元件G-box和P-box、盐诱导作用元件GT1-motif、参与干旱诱导的反应元件MBS,以及真菌侵害应答元件BOX-W1、植物-病原菌互作元件EIER;此外,还包含调节黄酮合成基因的MYB转录因子的结合位点。(3) CiMYB15基因的表达受到紫外胁迫的诱导。(4) CiMYB15基因过表达株系的总黄酮含量高于野生型。(5)过表达植物中At CHS基因的表达量亦高于野生型。以上结果说明,CiMYB15基因正调控拟南芥黄酮代谢。
秦康, 朱智甲, 孟爽, 孟丽媛[4]2019年在《蛋白Fbxw7α与P53相互作用的研究》文中认为Fbxw7α是SCF(SKP1-Cullin 1-F-box)蛋白泛素连接酶复合物的组分,它可以降解肿瘤中的许多原癌基因。在多种类型的癌症中均发现了Fbxw7α的突变,因此Fbxw7α被认为是癌发生中的肿瘤抑制因子。然而,Fbxw7α在细胞周期中的作用仍然有很大的未知性。本文在293T细胞中使用免疫共沉淀偶联LC-MS/MS方法,比较了野生型Fbxw7α和F-box缺失的不能与Cullin1形成SCF复合物的Fbxw7α突变体(?Fbxw7α)的相互作用蛋白,并发现关键细胞周期检查点P53与两种形式的Fbxw7α都具有相互作用。然而,Fbxw7α的异位表达没有抑制P53的表达,表明P53不是用于蛋白酶体降解的Fbxw7α的底物。另外,发现WT Fbxw7α和?Fbxw7α的表达诱导细胞周期停滞在G1期。综上,研究证明了Fbxw7α和P53之间的直接相互作用,并揭示了Fbxw7α调节细胞周期的新机制。
于桐, 蔡锦顺[5]2019年在《猫免疫缺陷病毒和猫艾滋病的研究进展》文中研究说明猫免疫缺陷病毒(FIV)可引起一种慢性接触性动物传染病,其基因组结构复杂,称为猫艾滋病(FAIDS)。FIV主要经唾液和血液水平传播,通过对FIV病原学、流行病学等方面的研究,为HIV药物、疫苗的研发和临床治疗提供有力的理论支撑及动物模型。
修光辉, 孙洁, 尹云玉, 周娟, 陈献忠[6]2019年在《CXCR4基因慢病毒载体及其过表达骨髓间充质干细胞株的建立》文中认为目的 构建表达大鼠CXCR4基因的慢病毒载体,建立CXCR4基因过表达骨髓间充质干细胞株。方法 PCR克隆CXCR4基因,将其连接到慢病毒表达载体PGMLV-6751上,转染293细胞,将构建的重组慢病毒载体与包装质粒混合物共转染293T细胞,收集病毒悬液,测定滴度,转染SD大鼠骨髓间充质干细胞,以嘌呤霉素进行筛选,定量PCR和Western blot检测转染后细胞目的基因mRNA和蛋白的表达水平。结果 成功构建了表达CXCR4基因的慢病毒载体,病毒滴度为2×10~(8 )TU/mL,建立了CXCR4基因过表达的大鼠骨髓间充质干细胞株,经定量PCR和Western blot检测,过表达细胞株CXCR4基因的mRNA和蛋白表达水平均较对照组明显升高(均P<0.05)。结论 成功构建携带CXCR4基因的慢病毒载体及CXCR4基因过表达的骨髓间充质干细胞株。
李艺柔, 吴思, 赵静[7]2019年在《癌症免疫疗法研究概述——2018年度诺贝尔生理或医学奖解读》文中研究表明癌症已经成为威胁人类健康的最重要疾病之一。癌症免疫疗法作为继化疗、手术治疗和放疗后的“第四种疗法”,已成为生物医学领域振奋人心的革命性技术之一。本文结合2018年诺贝尔生理或医学奖两位诺奖得主的工作,介绍免疫疗法的早期研究成果,并对其相关分子调控机制进行概述。
参考文献：
[1]. 慢性粒细胞白血病特异性单、双及叁单位核酶载体的构建[J]. 冯琦, 孙秉中, 赵永同, 孙凯, 颜真. 细胞与分子免疫学杂志. 1999
[2]. 核酶和RNA干扰靶向治疗慢性粒细胞性白血病的实验研究[D]. 陈波斌. 复旦大学. 2003
[3]. 中间锦鸡儿CiMYB15基因正调控拟南芥黄酮代谢[J]. 柴文娟, 杨杞, 李国婧, 王瑞刚. 中国生物工程杂志. 2018
[4]. 蛋白Fbxw7α与P53相互作用的研究[J]. 秦康, 朱智甲, 孟爽, 孟丽媛. 生物化工. 2019
[5]. 猫免疫缺陷病毒和猫艾滋病的研究进展[J]. 于桐, 蔡锦顺. 科学技术创新. 2019
[6]. CXCR4基因慢病毒载体及其过表达骨髓间充质干细胞株的建立[J]. 修光辉, 孙洁, 尹云玉, 周娟, 陈献忠. 华中科技大学学报(医学版). 2019
[7]. 癌症免疫疗法研究概述——2018年度诺贝尔生理或医学奖解读[J]. 李艺柔, 吴思, 赵静. 生物学教学. 2019