猪的12个STR基因座复合扩增体系的构建
马温华，莫晓婷，张 颖，白 雪，杨 帆，张 建，李万水，赵兴春
（公安部物证鉴定中心，北京市现场物证检验工程技术研究中心，法医遗传学公安部重点实验室，北京 100038）
摘 要： 目的 构建一套猪的STR复合扩增体系，并进行体系验证。方法 筛选出猪的12个STR基因座：SW240、S0386、S0655、PigSTR4C、PigSTR5C、PigSTR7B、PigSTR11B、387A12F、PigSTR13E、PigSTR14A、PigSTR15A、PigSTR17A，并结合性别位点Amelogenin基因座设计荧光标记引物，优化反应条件，构建出复合扩增体系。结果 成功构建了一套包含猪的12个STR基因座和1个性别位点的复合扩增体系。体系的最佳条件为10μL体积，60℃退火温度，28次循环。体系的准确性、一致性、均衡性、稳定性、种属特异性、多态性均良好，灵敏度达0.125ng。12个基因座的累积个体识别率为0.999 999 999 999 961，累积随机匹配概率为3.9208×10-14，累积非父排除率为0.9952。结论 本文构建的猪复合扩增体系可以用于涉及猪的个体识别和亲子鉴定的案件鉴定。
关键词： 法医遗传学；短串联重复序列；复合扩增；猪
自1985年Jeffreys首次将DNA技术引入法庭科学中以来[1]，基于PCR和毛细管电泳平台的常染色体STR检验成为法医DNA人类个体识别的标准方法。近年来，许多民事或刑事案件中与动物相关的亲权鉴定和个体识别也越来越多。微卫星标记技术在猪的生产育种、遗传资源评估与保护、食品安全和亲子鉴定等方面已有广泛的研究[2-7]。上述研究中涉及的STR基因座主要由联合国粮农组织（FAO）和国际动物遗传学会（ISAG）联合推荐，而这些基因座大多是二或三核苷酸重复，扩增时会产生较高的stutter峰，并不适用于法医学检验[8]。本文试选出适用于毛细管电泳技术检测的四核苷酸重复的STR基因座，构建了一套猪STR基因座的荧光标记复合扩增体系，并对其进行了体系验证。
1 材料与方法
1.1 样本及DNA提取
240份无关个体猪的耳组织，分别来自9个不同的猪品种（藏香猪、巴马猪、梅山猪、金华猪、内江猪、东北民猪、夏洛克猪、长白猪、大白猪）。用Qiagen公司的DNeasy Blood & Tissue Kit提取DNA。同一猪个体的心肌、骨骼肌、肺脏、肝脏、脑和皮肤组织DNA。大鼠、猴、酵母、牛、犬、人、羊、鱼的 DNA 样本，其中部分样本由中国医学科学院动物研究所提供，部分样本为本实验室收集。
1.2 STR基因座筛选
根据已经公开的猪微卫星位点数据资料进行整理和分析。对基因座的染色体分布、核心及侧翼序列信息、等位基因长度及分布等进行系统研究，依据其各自的等位基因杂合度、多态信息含量、重复单位特征、序列结构复杂程度等技术指标进行评估，最终筛选出12个STR基因座和1个性别位点。
我没想过。我确实没想过阿花被拒绝时的心情。在女孩面前，我从不献殷勤，更不懂得如何去关爱女孩，这也是我至今还孤身一人的原因。在爱情如闪电同居像快餐的南方，每天都发生着打工男女聚散依依的故事，而我从没走进过女孩的心里，也从没有女孩走进我的心里。其实，我是个柔情似水的男人，我渴望爱，但我不会示爱。看那些男孩拉着女孩的手，搂着女孩一起走，我就特瞧不起自己。
上小学时，我看过连环画《水浒传》、小说《水浒传》，而且不止看过一遍。后来又听过《水浒传》的评书，看过《水浒传》的电视剧，也不止看过一遍。
1.3 引物设计及合成
参考文献[9]，对引物浓度、模板用量、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶用量、退火温度、循环参数等条件进行摸索并优化。
2.3.4 PCO2 纳入18篇文献，各研究间无异质性（P=0.42，I2=3%），采用固定效应模型进行Meta‐分析，见图4。结果显示，治疗前后试验组PCO2减少值显著大于对照组，差异有统计学意义［MD=-6.99，95%CI（-7.68～-6.29），P＜0.000 1］。
表1 复合扩增体系中13个基因座的基本信息
Table 1 The information of 13 loci for the porcine multiplex system
1.4 PCR复合扩增体系的建立
利用Primer Premier5.0软件设计引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。各基因座的信息见表1。
1.5 扩增产物的检测
1.7.4 稳定性检验
1.6 等位基因分型标准物的制备
参考文献[10]，应用分子克隆技术，对13个基因座的等位基因进行克隆，制备该体系的等位基因分型标准物。每一个等位基因都经测序确认并命名，测序工作由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。
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1.7 复合扩增体系的可行性验证
为了达到水利工程的节能目的，可以从用电设备的使用出发，如提高水泵的整体性能。为了提高水泵的使用性能，需要对水泵的进水效率进行调整。为了实现水泵的节能使用，需要不断加强水泵的改造升级工作，从而减少用电负荷，实现绿色施工。
1.7.3 种属特异性检验
取大鼠、猴、酵母、牛、犬、人、羊、鱼、猪、大肠杆菌、鸡、鸭的DNA样品，检测体系的种属特异性。
对采自同一猪个体的心肌、骨骼肌、肺脏、肝脏、脑和皮肤组织DNA样本进行扩增，以验证该复合扩增体系对同一个体不同组织的分型的一致性。
取猪的DNA样品，用Nanodrop1000（Thermo Fisher Scientific，Inc., USA）进行定量后，分别以1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125 ng的模板量进行检验，扩增体积为10 μL，每个反应重复三次。
1.7.1 灵敏度
1.7.2 组织一致性检验
取扩增产物1 μL，于ABI 3130xL和3500xL型遗传分析仪上进行检测。分别应用ABI 3130xL Data Collection Software 3.1，GeneMapper 3.3软件对电泳结果进行分析，按照软件说明书，制作适用于本研究的Panel和bin 文件及方法文件。完成对样本各个基因座的自动分型。
在不同时间配制试剂，分别对同一组样本进行检测，以验证不同批次试剂盒的稳定性。将各个组分分别反复冻融5～20次后进行检验，包括引物混合物、PCR扩增缓冲液、分子内标及等位基因分型标准物（ladder）等。
1.7.5 群体遗传学数据调查
用新构建的复合扩增体系对240份猪的样本进行群体遗传学数据调查，利用PowerMaker v3.25软件，分别计算12个STR基因座的基因频率，采用Powerstats v1.2软件计算个体识别率（DP）、杂合度（H）、多态信息含量（PIC）、非父排除率（PE）、匹配概率（Pm），并计算12个基因座的累积个体识别率、累积非父排除率和累积随机匹配概率。
2 结果
2.1 PCR反应体系及循环条件
通过优化实验，PCR反应最佳的复合扩增体积为10 μL。复合扩增体系的最佳退火温度为60 ℃，PCR循环次数28次，整个PCR循环条件为：95 ℃、11 min，94 ℃、1 min，60 ℃、1 min，72 ℃、1 min，28个循环；60 ℃、 60 min；4℃保存备用。通过对复合扩增体系条件的优化，得到理想的毛细管电泳分型结果（图1）。峰型对称尖锐，无双肩峰，各峰之间基本平衡。检验结果的正确分型是通过和等位基因分型标准物（allelic ladder）比对分析获得。allelic ladder每次电泳的偏差都在0.5 bp以内，且在不同型号的遗传分析仪上结果一致，其分型图见图2。
图1 猪13个基因座复合扩增体系的毛细管电泳图
Fig.1 The typing result of the porcine multiplex system containing 13 STR loci
图2 猪的13个基因座复合扩增体系的等位基因标准物
Fig.2 Allelic ladders of the porcine multiplex system containing 13 loci
2.2 灵敏度检验
经过对不同的模板量进行扩增，结果当模板浓度≥0.125 ng时，13个基因座的全部等位基因均可正确分型；模板≤0.0625 ng则出现等位基因丢失现象，因此该复合扩增体系的灵敏度可达0.125 ng。
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2.3 组织一致性检测
对采自同一头猪的心肌、肝脏、脑、肺脏、骨骼肌和皮肤组织DNA样本进行扩增，得到的分型结果均一致。因此该复合扩增体系可用于检测猪的不同组织且能准确判断基因型。
2.4 种属特异性检验
取大鼠、猴、酵母、牛、犬、人、羊、鱼、猪、大肠杆菌、鸡、鸭的DNA样本进行复合扩增，除猪的DNA 样本外，均未检出扩增产物，说明该复合扩增体系具有良好的种属特异性。
由此，深圳政府可以通过给予水上“巴士”政策支持和补贴，调低运价，吸引更多货源，以提高深圳港水水中转比例.
2.5 稳定性检验
各个组份经反复冻融多次，对45份猪的DNA样本进行检测，扩增后检验发现并无明显变化，表明结果稳定、谱图完整清晰；重复检测结果无明显差异。
2.6 群体遗传学数据
经过χ2检验，本研究中240例猪的无关个体所有基因座的基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡。12个猪的等位基因频率见表2，共发现123种等位基因，单基因座等位基因频率分布在0.0021～0.5833之间。群体遗传学参数见表3。根据频率调查结果，每个基因座的等位基因数都在5个以上，个体识别率均在0.8以上，均具有较高的个体识别率。
表2 猪的12个STR基因座等位基因频率
Table 2 Frequencies of porcine 12 STR loci
表3 猪的12个STR基因座的多态性参数
Table 3 The polymorphic parameters for porcine 12 STR loci
3 讨论
四核苷酸重复的STR基因座比二核苷酸重复的STR基因座含有更多的遗传信息[11]。本研究共筛选出12个STR基因座和1个性别位点，其中包括四核苷酸重复的STR基因座10个，二核苷酸重复的STR基因座2个。这些二核苷酸重复的STR基因座来自我们之前研发的包含10个猪二核苷酸重复的STR基因座复合扩增体系[12]。本研究保留了其中两个多态性较好的二核苷酸重复的基因座SW240和S0386，以方便两个复合扩增体系之间相互印证。本研究筛选到的基因座SW240、PigSTR4C、PigSTR5C、387A12F、 PigSTR13E、PigSTR14A、PigSTR15A、PigSTR17A分别位于不同的染色体上，虽然S0655和PigSTR7B同在7号染色体上，S0386和Pig-STR11B同在11号染色体上，但它们的遗传距离分别为35 Mb和67 Mb，均大于10 Mb，不具有遗传连锁关系[9]。本研究经对复合扩增体系中的等位基因进行测序，并按照ISFG的微卫星标记应用指南统一命名[13]，用克隆法构建了等位基因分型标准物，并编制了对应的分析软件Panel 和Bin，实现了检测及分析的自动化。经过对检测结果进行统计分析，各位点的扩增产物较小，大小均在75～340 bp之间，扩增效率及重现性高。
荧光标记的PCR产物在遗传分析仪进行毛细管电泳时往往需考虑matrix和内标的选择。本研究选用了本中心Typer系列试剂盒应用的五色荧光标记系统，其中FAM、HEX、TAMRA 和ROX用于标记引物，FAM标记四个STR基因座，其他三种荧光分别标记三个STR基因座，Typer 500作为内标，使得扩增和检测过程都更方便和高效。
本研究建立的猪STR复合扩增体系，12个STR基因座的累积匹配概率为3.9208×10-14，累积个体识别率为0.999 999 999 999 961，各基因座的累积非父排除率为0.9952，而专利[12]中检测体系的累积个体识别力和累积非父排除率为0.999 999 98和0.9921。因此，本体系可以用于猪的个体识别和亲子鉴定，能够解决日益增多的动物类检材的案件。依托该复合扩增体系得到的猪STR基因座的多态性数据可为其在法庭科学中的应用提供理论基础和应用参考。
参考文献
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A Multiplex Amplification System Containing Porcine 12 STRs:Construction and Verification
MA Wenhua, MO Xiaoting, ZHANG Ying, BAI Xue, YANG Fan, ZHANG Jian, LI Wanshui, ZHAO Xingchun
(Institute of Forensic Science, Ministry of Public Security (MPS), Beijing Engineering Research Center of Crime Scene Evidence Examination, MPS' Key Laboratory of Forensic Genetics, Beijing 100038, China)
ABSTRACT: Objective To establish a porcine multiplex amplification system that was to be validated. Methods 12 porcine STRs (SW240, S0386, S0655, PigSTR4C, PigSTR5C, PigSTR7B, PigSTR11B, 387A12F, PigSTR13E, PigSTR14A,PigSTR15A, PigSTR17A) were selected to construct a fluorescent multiplex system plus the sexual marker Amelogenin.Through the serial completion of designing primers, labeling fluorescence dye and optimizing experiment conditions, a porcine multiplex amplification system was built up and to be validated. Results A multiplex PCR system, containing porcine 12 STR markers and an Amelogenin gender marker, has been successfully established. The most appropriate amplification conditions of the system are 10μL of amplification volume, 60℃ annealing temperature and 28 cycles. With the requirements met on precision, accuracy, peak height balance, stability, species specificity and polymorphism, the system is at lowest quantity of 0.125ng DNA to obtain complete STR genotyping, showing its cumulative discrimination power (CDP) of 0.999999999999961, the cumulative matching probability (CMP) of 3.9208×10-14 and the cumulative excluding probability of paternity (CEP) of 0.9952, respectively. Conclusion The established fluorescent multiplex system is capable of being used for porcine individual identification and paternity test in real cases.
KEY WORDS: forensic genetics; STR; multiplex amplification; pig
中图分类号： DF795.2
文献标识码： A
文章编号： 1008-3650(2019)04-0308-05
DOI： 10.16467/j.1008-3650.2019.04.006
基金项目： 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目（No.2015JB007、2017JB005）
第一作者简介： 马温华，女，山东潍坊人，硕士，主检法医师，研究方向为法医遗传学。E-mail: mawenhua052@126.com
引用 本文格式：马温华，莫晓婷，张颖，等. 猪的12个STR基因座复合扩增体系的构建[J]. 刑事技术，2019,44(4):308-312.
收稿日期： 2017-03-10；修回日期：2017-05-08
标签：法医遗传学论文; 短串联重复序列论文; 复合扩增论文; 猪论文; 公安部物证鉴定中心北京市现场物证检验工程技术研究中心法医遗传学公安部重点实验室论文;