陈国强[1]2000年在《猪链球菌2型江苏分离株溶血素的产生条件、提纯和特性分析》文中研究表明用平板法和上清法检测了19株猪源链球菌的溶血性，并通过活化和抑制试验，对各菌株溶血素的性质做了初步鉴定。其中8株猪链球菌2型，在血平板上的溶血性较弱，仅为α或弱β溶血，但在THB和5％血清THB中都可产生很强的溶血性，而且其溶血性被还原剂活化，被氧化剂和胆固醇所抑制，卵磷脂对其活性则没有影响，该溶血素属于巯基活化类（类SLO）溶血素。9株马链球菌兽疫亚种在血平板上呈显著的β溶血，在不含血清THB中不能产生溶血性，在含血清的THB中可产生较强的溶血性，其活性不被还原剂活化，不被氧化剂抑制，胆固醇能抑制大部分活性，卵磷脂则可全部抑制，该溶血素属于类SLS溶血素。两株暂定为非典型C群链球菌在血平板上呈显著的β溶血，在THB中显示了非常强的溶血性，而且其活性不被还原剂活化、不被氧化剂抑制或卵磷脂抑制、但被胆固醇强烈抑制，该溶血素属于非SLO、非SLS溶血素。
余炜烈[2]2007年在《华南地区屠宰猪群中猪链球菌的流行病学调查及地方株的特性研究》文中研究指明猪链球菌(Streptococcus suis，SS)是一种重要的人畜共患病病原，可分为35个血清型(1～34型及1／2型)。大多数由猪链球菌引起的临床疾病均与几种主要血清型(如1型、1／2型、2型、7型、9型和14型)有关。健康猪可在上呼吸道隐性带菌，是该菌在猪群中传播的重要传染源。猪链球菌根据致病性的不同可分为强毒株、弱毒株和无毒株。其致病性与毒力因子有关，已发现多种毒力因子。但根据已知的毒力因子不能完全解释SS2分离株之间的致病性差异，动物试验仍是当前区分SS2毒力唯一有效的方法。1．华南地区屠宰猪群扁桃体内猪链球菌的携带情况2006年5至10月间从广东省部分地区肉联厂采集屠宰猪扁桃体401份，其中粤西地区115份、珠三角地区80份、广东周边各省206份。用两个多重PCR检测样品中猪链球菌(SS)及其6个主要致病血清型。检出154份(38.4％)样品SS为阳性，其中69份(17.2％)携带SS2(SS1／2)，35份(8.7％)携带SS9，而SS7和SS1(SS14)较少，各为9份(2.2％)和3份(0.7％)。不同血清型SS菌株可混合感染同一头猪，其中混合感染SS2(SS1／2)和SS9的样品最多，18份(4.49％)；6份(1.50％)样品混合感染SS2(SS1／2)和SS7，4份(1.00％)混合感染SS7和SS9；也有样品混合感染SS2(SS1／2)、SS7和SS9三种以上血清型，但仅3份(0.75％)。在地区分布上，粤西地区采集扁桃体中SS阳性率(18.3％)明显低于其他地区(p＜0.01)。其余各地区之间均无显著差异(p＞0.05)，阳性率均在35％～70％之间。对全部样品进行细菌分离，共分离到SS 53株，分离率为13.21％；其中SS2(SS1／2)25株(6.23％)，SS93株(0.75％)，SS71株(0.25％)，未定型SS 24株(5.99％)。细菌分离结果与PCR检测结果符合率较高，但细菌分离的阳性率远比PCR检测结果低。有286个样品SS的PCR检测和细菌分离的结果一致，符合率为71.32％。108个样品PCR检测结果为阳性，但细菌分离结果为阴性；7个样品的检测结果与上述情况相反。PCR检测的SS阳性率要比细菌分离高25％。证实了华南地区猪群中广泛存在SS，呈多个血清型并存、几个血清型混合感染，以及流行呈地域性等特点。2．猪链球菌扁桃体分离株的毒力基因分布特征设计并合成7对引物，用PCR方法对猪链球菌7种主要毒力基因，包括谷氨酸脱氢酶(gdh)、溶血素(sly)、胞外因子(ef)、溶菌酶释放蛋白(mrp)、纤连蛋白／血纤蛋白原结合蛋白(fpbs)、三磷酸甘油醛脱氢酶(gadph)和毒力相关序列orf2进行检测，分析了29株猪链球菌扁桃体分离株的毒力基因分布特征。在被检的25株2型菌株中，共检测出7个基因型，其中10株(40％)同时具有上述7种毒力基因，7株(28％)缺失sly和ef基因，4株(16％)仅缺失sly基因，1株仅缺失orf2基因，1株缺失sly、ef和orf2三个基因，1株缺失sly和ef基因且携带长片段mrp基因，1株缺失sly、ef、mrp、fbps和orf2五个毒力基因；1株猪链球菌7型分离株缺失ef和mrp两个基因；3株猪链球菌9型分离株均缺失sly、ef和mrp三个毒力基因。可见我国SS分离株的毒力基因分布较为复杂，且SS2的优势流行菌株是同时具有多种毒力基因的高致病菌株，值得关注。3．猪链球菌2型关节炎分离株和9型脑膜炎分离株的特性分析2005年夏秋季从广东地区9例病猪中分离到2株猪源链球菌，形态均呈链球菌的特征，α溶血，生化试验结果相似，且都不与A～G链球菌群特异性血清发生凝集。经PCR及测序鉴定，一株为猪链球菌2型，另一株为猪链球菌9型。2型分离株的三个毒力基因均为阳性(sly~+ ef~+ mrp~+)，但对小鼠的毒力较低，小鼠在接种细菌6～15天后发病致死，细菌在小鼠中的带菌时间会有15d或者更长；9型分离株三个毒力基因均阴性(sly~- ef mrp~-)，但对小鼠有较强毒力，小鼠在接种细菌5天内发病死亡，对小鼠的半数致死量为1.70×10~6CFU。表明广东地区致病性猪链球菌不仅存在2型，而且还有9型。4．猪链球菌2型西藏微型猪感染模型的初步建立选取3个流行病学背景不同的猪链球菌2型菌株人工感染西藏微型猪，探讨西藏微型猪作为猪链球菌2型毒力评价模型动物的可行性。12头西藏微型猪分成4组，A组为阴性对照组接种肉汤培养基，B、C、D三组分别接种猪链球菌2型分离株：GZ06-122B、SH06-21D和HA9801。GZ06-122B株和SH06-21D株分离自华南地区健康猪的扁桃体，毒力基因表型分别为sly-/mrp-/ef-和sly+/mrp+/ef+。HA9801株分离自江苏患败血症死亡的猪体内，毒力基因表型为sly+/mrp+/ef+。接种GZ06-122B株的试验猪无明显临床症状，体温不升高，血液循环中也无细菌出现；试验猪感染SH06-21D株和HA9801株后临床症状显著，尤其是感染HA9801株后，出现体温升高、跛行和神经症状，甚至死亡。攻击后1周内，C组试验猪病死1／3头，D组2／3头。表明HA9801株有毒力较强，SH06-21D株次之，GZ06-122B株的毒力较弱，证实了西藏微型猪对猪链球菌2型有一定易感性，且可用于区分不同猪链球菌2型分离株的毒力强弱。
陈国强, 陆承平, 姚火春[3]2001年在《猪链球菌2型溶血素的提纯及其生物学特性》文中研究指明猪链球菌 2型是一种重要的人兽共患病病原 ,其毒力因子令人关注。用 5 0 %饱和硫酸铵沉淀、DEAE - 5 2纤维素离子交换层析和SephadexG - 10 0凝胶层析 ,对猪链球菌 2型江苏分离株HA980 1上清进行纯化 ,获得一种溶血素。该溶血素不仅对Vero细胞有毒性作用 ,还能致死豚鼠 ,并具有良好的免疫原性 ,免疫动物所产生的抗体 ,可中和溶血素的溶血作用和细胞毒性作用。经溶血素免疫的豚鼠 ,在受到同源全菌攻击时 ,可获得保护。表明猪链球菌 2型江苏分离株HA980 1所产生的溶血素不仅是一种重要致病因子 ,而且还是一种保护性抗原。
倪艳秀[4]2012年在《猪链球菌2型江苏分离株溶血素基因缺失株的构建及特性分析》文中提出猪链球菌(Streptococcus suis, SS)能引起猪脑膜炎、关节炎、败血症甚至死亡,也可导致生猪从业人员的感染和死亡,是一种重要的人兽共患病病原体。根据荚膜多糖的抗原性差异,猪链球菌分35个血清型,其中猪链球菌2型(SS2)分布最广,分离率最高,致病性最强。猪链球菌溶血素(亦称猪溶素,简称SLY),是SS2的一种重要毒力因子。SLY阳性菌株的流行存在一定地域性,北美分离株的溶血素阳性率明显低于欧洲、亚洲分离株。提示我们溶血素在不同地域的猪链球菌的致病过程中可能发挥不同的功能。目前对溶血素的生物学功能和致病机理还不十分明确。除了可以肯定SLY能溶解多种动物的红细胞及对多种细胞有毒性作用外,对溶血素如何诱导细胞因子表达、如何在猪链球菌病(尤其在脑膜炎)的发生和发展起作用,还有待于进一步的深入研究。本研究对国内病猪中猪链球菌2型分离株的溶血素基因进行了检测及序列分析,明确了其分布及遗传变异情况；并通过原核表达全长溶血素及其生物学特性及免疫原性的研究、猪链球菌2型江苏分离株溶血素基因缺失株的构建及其生物学特性与致病性分析,对溶血素的生物学功能、尤其是对其分子致病机理进行了较为深入的研究。1国内病猪中猪链球菌2型分离株溶血素基因的PCR检测及序列分析通过聚合酶链反应(PCR)方法检测29株不同年代、不同地区猪链球菌2型(SS2)国内病猪分离株的溶血素基因(sly),并将其中的5株(SS2-1、HA9801、HA0507、 JR0507和ZY05719)的sly进行克隆及序列分析。结果显示：29株菌都有sly,其中5株菌的sly的ORF的碱基数目都为1,494bp、编码497个氨基酸,核苷酸序列的同源性为99.7%～100.0%,所推导的蛋白质序列的同源性为99.8%～100.0%,其中SS2-1、 HA9801、HA0507、JR0507与国外参考株P1/7的序列完全一致。表明中国猪链球菌2型病猪分离株普遍具有sly,且基因序列极为保守。2猪链球菌2型溶血素全长基因的原核表达及其生物学特性与免疫原性研究根据猪链球菌(Streptococcus suis,SS)溶血素的基因序列,设计引物,以江苏分离株SS2-1的基因组为模板,扩增出除信号肽序列外的sly全长基因,并定向克隆到表达载体pET-32α中,转化大肠杆菌BL21(DE3)。重组菌经1mM IPTG诱导,在37℃下,4h时表达产物(分子量约为72kDa)达到高峰,表达量约占菌体总蛋白20%,表达产物在上清和包涵体中各占一半。将上清经镍柱亲和层析纯化,纯化蛋白经Western blotting鉴定呈阳性,对绵羊红细胞、鸡红细胞的溶血效价分别为1.707×105HU/mg.4.267×104HU/mg,并可引起HEp-2和Vero细胞的融合、颗粒增多和脱落。纯化蛋白对BALB/c小鼠的免疫保护性为83.3%(5/6)。这为进一步研究SLY致病机理和研制猪链球菌新型疫苗奠定了基础。3猪链球菌2型江苏分离株溶血素基因缺失株的构建以猪链球菌2型江苏分离株JR0507为模板,分别扩增溶血素基因的569bp、559bp的上下游同源臂,以pSET3为模板,扩增了长度为1056bp的氯霉素基因,将三者依次与自杀性质粒pSET4S质粒进行连接,将连接产物转化入DH5a感受态中,构建了基因缺失载体pSET4s△SLY。然后将构建的载体pSET4s△SLY:通过电转化导入JR0507的感受态细胞中,利用氯霉素抗性进行初步筛选,并用PCR和Western blotting进行鉴定,结果成功构建了溶血素基因缺失株JR0507(△SLY),为进一步研究猪链球菌溶血素的功能奠定了基础。4猪链球菌2型江苏分离株溶血素基因缺失株的生物学特性及致病性分析对构建好的溶血素基因缺失株JR0507(△SLY)与亲本株JR0507的各项生物学特性及致病性进行了比较研究。结果表明,JR0507(△SLY)已完全失去了溶血活性。与亲本株相比较,其生长特性、生化特性、对PK-15、HEp-2和PIEC细胞的粘附能力没有发生变化,但对这3种细胞的毒性作用都呈极显著下降。缺失株在全血中的存活率为(15.5+2.8)%,亲本株为(40.7+4.8)%,呈极显著下降(P<0.01)。动物致病性试验表明,△SLY对BALB/c小鼠的MLD为1.0×109CFU,比亲本株上升了10倍,同时△SLY对新西兰兔和断乳仔猪都失去了致病性。用细菌接种3D4猪肺泡巨噬细胞6h后,2株菌都不能诱导炎症相关细胞因子(IL-1β、IL-18、IL-8、IL-12和IL-10)的转录,但在接种12h后,亲本株能诱导3D4细胞表达除IL-12外的其它4种细胞因子,而△SLY仍不能诱导这些细胞因子的表达。总之,与亲本株相比,溶血素基因缺失株可引起不同动物的致病性的下降,而引起其毒力下降的原因,与其在血液中的存活能力和对细胞的破坏能力下降、促炎症因子表达减少有关。这些都进一步阐明了溶血素的生物学功能及分子致病机理,说明溶血素在猪链球菌病的发生和发展中起着重要的作用。
方绍庆[5]2002年在《猪链球菌2型江苏分离株溶血素的纯化、化学修饰及其基因检测与分析》文中进行了进一步梳理猪链球菌2型是猪的重要病原菌之一，能产生多种毒力因子，溶血素是其中重要的一种，几乎所有的强毒株均产生溶血素，且其具有良好的免疫原性。本文研究了猪链球菌2型江苏分离株溶血素的纯化、化学修饰，并对其基因进行PCR检测和序列分析。 本试验采用硫酸铵沉淀，阴离子交换层析及凝胶过滤层析纯化猪链球菌2型江苏分离株溶血素，并在此基础上采用二硫苏糖醇等九种化学修饰剂对其氨基酸侧链基团进行化学修饰，以期探明其溶血活性基团。结果表明色氨酸、组氨酸、精氨酸残基是猪链球菌2型江苏分离株溶血素的活性必需基团，二硫键断裂可引起其活性增强。 根据GeneBank已公布的猪链球菌2型溶血素基因序列，设计和合成了一对可扩增其完整阅读框的引物，对HA9801等6株猪链球菌2型江苏分离株核酸进行PCR扩增，结果显示6株均呈阳性，对HA9801株PCR产物纯化后测序，序列分析表明HA9801株溶血素基因与1933株的同源性为99％，表明猪链球菌2型江苏分离株普遍存在溶血素基因。
蔡振鸿[6]2007年在《中国部分地区猪链球菌遗传背景及进化关系研究》文中认为设计了特异性引物对3个致病性猪链球菌2型(SS2)四川分离株4个主要毒力因子基因mrp、epf、sly和orf2分别进行了扩增，序列测定与分析结果表明3个SS2四川分离株均存在4个毒力因子基因mrp、epf、sly和orf2，其核苷酸序列与1998年江苏分离株9801及国外参考菌株的同源性均大于99.5％，提示3个四川分离菌株与1998年江苏流行的高毒力菌株可能具有共同的来源。应用多位点序列分型技术(MLST)结合猪链球菌现有毒力因子基因gdh、cps、mrp(mrp*)、epf(epf*)、sly、orf2、fbps、gapdh基因分布的PCR检测，对来源于发病猪、健康猪扁桃体和发猪链球菌病病人的41株猪链球菌1／2，2，7，9型国内流行菌株进行了基因分型。结果发现了2个在国际上未报道的ST型——STN1和STN2，41株菌分布于10个基因型(由8个ST型和9种毒力基因型组合而成)，其中流行最广的猪链球菌菌株为2型中的ST7／A1型(74.2％，23／31)，毒力基因型为gdh+／cps2+／mrp+／epf+／sly+／orf2+／fbps+／gapdh+；且ST7型菌株与发病猪分离的临床背景高度相关，ST7占发病猪分离菌株的84.6％(22／26)；健康猪分离的菌株基因型与发病猪分离的基因型差异明显；通过菌株MLST型别，绘制了我国流行的猪链球菌菌株的遗传进化图谱。为了了解重庆猪链球菌流行情况，掌握其流行病学规律，随机采集重庆市20个区县定点屠宰场的腭扁桃体1360份和116份发病猪实质器官，进行猪链球菌分离。应用溶血特性、PCR方法和凝集试验对分离菌株进行筛选及猪链球菌种、型鉴定。应用PCR方法对定型的猪链球菌进行毒力因子检测，并应用多位点序列分型技术(MLST)进行分型，同时与2005年和2006年重庆地区已分离的猪链球菌进行比较．结果共分离猪链球菌菌株230株，其中2型4株，7型3株，9型2株，并在国内首次分离出2株猪链球菌1／2型。毒力因子检测和MLST分型结果表明，重庆猪扁桃体分离的2型菌株特性与引起发病的菌株有较大差异。
陈国强[7]2011年在《猪链球菌2型检测方法的研究及其在出入境检疫中的应用》文中研究说明猪链球菌(Streptococcus suis,SS)是一种重要的人畜共患病病原菌,能引起猪的败血症、脑膜炎、肺炎、多发性关节炎和多发性浆膜炎等；该菌在特定情况下也能感染人,引起人的急性败血症、脑膜炎、心内膜炎等疾病。猪链球菌病呈世界性分布。目前,美国、荷兰、英国、加拿大、澳大利亚、新西兰、比利时、巴西、丹麦、挪威、芬兰、西班牙、德国、爱尔兰、中国、日本等几乎所有养猪国家和地区均有发生猪链球菌病的报道,这不仅给养猪业造成了巨大的经济损失,同时还对公共卫生尤其是相关从业人员的健康构成严重威胁。在中国,SS2最早于90年代初发生于广东,但未见感染人的报道；1998～1999年江苏省部分地区猪群爆发该病,同时造成25人感染发病,其中14人死亡；尤其是2005年夏季在四川猪群爆发该病,造成214人感染发病,其中39人死亡.此外,重庆、香港、江西、广东等地也有人感染猪链球菌的零星病例发生。因此,加强猪链球菌检测技术的研究,开展猪链球菌的检测,防止猪链球菌2型传入传出,为进出口贸易提供技术保障,具有重要的意义。1.猪源动物产品中猪链球菌2型检测方法的建立建立了猪源动物产品中猪链球菌2型的选择性增菌和选择性平板分离方法。样品与Todd-Hewitt肉汤(THB)按1：10的比例均质后,加入终浓度分别为0.2g/L叠氮钠、0.0002g/L结晶紫和0.1g/L亚硫酸钠,于37℃静置培养18h后,在含有0.2g/L叠氮钠、0.0002g/L结晶紫和0.1g/L亚硫酸钠的5%脱纤维羊血哥伦比亚琼脂的选择性平板上进行平板分离。与非选择性增菌液和分离平板相比,猪链球菌典型菌落显著增加,杂菌显著减少,分离更加容易,分离率显著提高。2.猪链球菌2型分型血清的制备将猪链球菌2型(SS2)参考菌株ATCC43765在Todd-Hewitt肉汤中连续传代三代,每次培养6小时,然后按照1：10的比例接种于Todd-Hewitt肉汤仅培养2小时,经灭活处理后获得含较多荚膜物质的全菌菌体抗原。该抗原按照每周三次,除第一周按2.0x109cfu/次,其余按8.0x109cfu/次静脉免疫家兔制备全菌抗血清。经测定,该血清仅与SS2发生凝集反应,凝集价为128,不与其它链球菌发生凝集反应,表明该血清具有较高的特异性,可作为SS2的分型血清。在全国检验检疫系统广泛应用,仅在江苏口岸对125株疑似菌株进行鉴定,共鉴定出17株猪链球菌2型菌株。3.猪链球菌2型溶血素基因的检测根据GenBank发表的猪链球菌2型(SS2)溶血素基因(sly)全序列,利用oligo(7.0)软件设计和合成了可扩增长度为495bp的引物,建立了的SS2溶血素基因的PCR检测方法。应用该方法可从SS2参考菌株ATCC43765、SS2江苏分离株HA9801中扩增出495bp的条带,利用Hind Ⅲ限制性内切酶对具有相应单一酶切位点的PCR扩增产物就进行酶切,获得预期的314bp和181bp的2个DNA片段,检测灵敏度达到2.5×102cfu/mL;但不能从马链球菌兽疫亚种ATCC35246、大肠埃希菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923.单增李斯特杆菌ATCC19115/413、粪肠球菌ATCC29212中扩增出相应条带。PCR扩增产物的测序结果与GenBank的猪链球菌sly基因(Z36907)核苷酸序列完全一致。表明本方法可快速、敏感、特异地检测SS2的溶血素基因。对江苏口岸分离的125株疑似猪链球菌菌株进行溶血素基因检测,其中27株猪链球菌均检出了猪链球菌溶血素基因,阳性率为100%,其它菌株均未检出猪链球菌溶血素基因。4.江苏出入境猪源动物产品中猪链球菌的检测2005年～2010年,对江苏出入境猪源动物产品中进行了猪链球菌检测,通过选择性增菌和平板分离,从920份样品中分离到125链球菌菌株。通过生化鉴定、血清学鉴定和分子鉴定,共检出27株猪链球菌,阳性率为2.93%(27/920),其中猪链球菌2型为17株,阳性率为1.85%(17/920)。结果表明,江苏出口养殖场及进出境猪副产品中有猪链球菌存在,但流行率不很高。上述工作为江苏地区猪源动物产品的国际贸易提供了技术支撑,为猪链球菌病防治提供了可靠的科学依据。相关研究内容已经纳入质检总局制定的重大动物疫情防控猪链球菌2型实施方案和猪链球菌2型检测的系列国家标准。
孙学强[8]2010年在《马疱疹病毒1型感染性克隆及表达猪链球菌2型亚单位重组病毒的构建》文中指出马疱疹病毒1型(Equine herpesvirus type1, EHV-1)是马科动物的重要病原之一,临床上多引起呼吸道、流产及神经系统疾病。疱疹病毒拥有庞大的双股DNA基因组,由于其基因组中存在大量非必需基因,有大约30kbp的序列可以被外源基因取代,并且不会严重影响病毒在体外细胞培养中增殖,EHV-1可作为表达外源蛋白活疫苗载体,不但可以用于马病的预防,而且最近的研究显示EHV-1有发展为通用载体或者基因治疗载体的潜力。本实验以ATCC标准株438/77株基础,分别克隆其ORF19和20,与含有绿色荧光蛋白和氯霉素抗性报告基因的pHA2相连构建转移载体后,与母本病毒共转染以传统的同源重组方法在ORF19和20之间插入mini-F序列,构建了含有GFP和氯霉素基因的重组病毒,提取重组病毒基因组环状中间体电转至大肠杆菌DH10B感受态细胞,经过PGR和RFLP筛选到多株阳性细菌人工染色体(BAC)克隆,以磷酸钙法转染RK13细胞,结果均拯救出病毒。拯救病毒与转移载体p1920XM通过同源重组进一步删除含有报告基因mini-F序列构建了无痕迹有标记的恢复病毒。野生株、拯救株和恢复株经过噬斑测定和一步生长曲线测定证明各毒株体外培养特性差异不显著,说明本实验所构建的BAC具有感染性,而且mini-F的插入和删除均没有改变病毒的体外培养特性。猪链球菌2型作为一种人畜共患病病原日益受到关注,而溶血素又是其分泌到细胞外的外毒素,是公认的重要毒力因子之一,具有良好的免疫原性。通过对其基因序列的分析发现5’约81bp编码的27个氨基酸残基为信号肽序列。本试验通过PCR及融合PCR方法构建载体在大肠杆菌中成功的表达了带有信号肽和无信号肽的SLY,以及将463和464位色氨酸突变为丙氨酸的带有信号肽和无信号肽的溶血素突变体-SLYm。经过蛋白杂交试验证明,表达的重组SLY和SLYm与提取的SS2分泌的SLY分子量完全一致,而且带有的信号肽的SLY和SLYm均能在细菌上清中检测到杂交条带,说明SS2sly基因的信号肽序列同样能够引导在大肠杆菌中成熟的SLY或者SLYm进行跨膜转运,而且转运至细胞外的SLY和SLYm的分子量与SS2的分子量一致,说明其信号肽序列已被切除,而无信号肽的SLY和SLYm的上清中均未检测到。同时通过血平板和96孔板溶血试验证明溶血素突变体失去溶血活性,而野生型SLY不仅能够溶解红细胞而且对PK15.RK13.SUVEC细胞具有毒性,突变体则不能引起任何细胞发生病变。小鼠毒力实验证明所表达的SLY通过腹腔注射和静脉注射均能致死小鼠,而SLYm在同样条件下对小鼠安全。用SLY和SLYm免疫小鼠制备的抗血清均能抑制SS2SLY的溶血活性,提示了463和464为氨基酸的突变虽然灭活其溶血活性,但是仍具备免疫原性其抗血清能够封闭SLY的膜结合结构域阻止其细胞膜的结合。瞬时表达及免疫转印试验证明未经优化的SS2溶血素突变体全基因在PK15细胞中不能被Pcmv启动子启动表达,而优化合成的slyom则能够表达,所表达的溶血素蛋白在PK15细胞中不需要信号肽序列也能实现跨膜转运。MRP被认为是猪链球菌的重要的毒力因子,从病猪体内分离的菌株常常含这种分子。对链球菌致病菌株的MRP进行了克隆、测序,显示N端前47个氨基酸是典型的信号肽,游离于细菌表面,N端有7个带电荷的残基,后面是一个21个氨基酸的疏水孔和一个公认的信号肽酶切位点。剪切掉信号肽得到一个分子量为131094的成熟蛋白,它与136kD的MRP接近。C端有一类似于A群链球菌M蛋白基因的锚式序列,本试验通过构建含有mrp片段的真核表达质粒转染细胞后瞬时表达MRP并经免疫转印确定能够在Pcmv启动子启动下表达。应用疫苗预防目前仍旧是防控猪链球菌病有效措施,传统的灭活疫苗仍旧具有需多次注射的局限,新型高效的猪链球菌2型疫苗仍有待于进一步的研究。本试验在所构建的p438/77的基础上,以两步法无痕迹的将mrp基因片段和溶血素突变体分别插入EHV-1基因组内构建了重组病毒,经过免疫转印鉴定能够表达MRP和SLY。重组病毒通过传统的同源重组方法删除了含有氯霉素抗性基因以及gfp的mini-F序列获得4M和4S株。免疫小鼠后以间接ELISA方法检测到4M能够诱导小鼠产生抗MRP特异性抗体,4M株免疫小鼠后能够抵抗致死量的SLY静脉注射的攻击。
梁阳秋[9]2009年在《猪链球菌2型三种免疫原性蛋白基因片段的串联表达及其斑马鱼免疫保护试验》文中指出猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2)是人和多种动物的病原菌,许多研究表明其免疫原性蛋白可对猪产生免疫保护作用,可作为亚单位疫苗的候选单位。斑马鱼(Danio rerio)具有完整的免疫系统,研究表明,斑马鱼可用于猪链球菌2型感染及其疫苗筛选。以猪链球菌2型HA9801株基因组DNA为模板分别扩增MRP(Muramidase-released protein,溶菌酶释放蛋白)、通过免疫蛋白组学鉴定的免疫原性蛋白HM6 (Dihydrolipoamide dehydrogenase,二氢硫辛酰胺脱氢酶)及GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,磷酸-3-甘油醛脱氢酶)抗原性较好的基因片段,定向克隆至表达载体pET-28a(+)中,重组质粒mrp-pET28a、hm6-pET28a及gapdh-pET28a经限制性酶切鉴定后测序。结果表明插入片段大小分别为531、964、1005bp,与NCBI上猪链球菌2型基因序列相比,同源性均达到99%。将重组质粒转入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导可表达分子量分别约为26.0、40.5及41.7kDa的融合蛋白,用猪链球菌2型HA9801株猪康复血清与纯化的融合蛋白进行免疫转印,结果显示融合蛋白MRP、HM6及GAPDH均可被猪链球菌2型HA9801株猪康复血清识别。根据猪链球菌2型mrp及hm6基因序列设计两对引物,分别获取大小为531、964bp的mrp及hm6基因抗原性较强的片段,再通过重叠延伸的方法,将两个基因通过一疏水性柔性多肽接头(Gly4Ser)2碱基序列进行前后拼接,构建新的mrp-linker-hm6融合基因,克隆至pMD18-T Simple载体,经测序分析表明插入片段长度为1525bp,mrp、hm6及接头拼接组合的顺序、方向完全正确。将融合基因定向克隆至pET-28a(+)中,构建重组表达质粒mrp-hm6-pET28a转化至大肠杆菌BL21,经IPTG诱导可表达分子量约为59.7kDa的融合蛋白MRP-HM6,免疫转印结果显示MRP-HM6能与猪链球菌2型HA9801株猪康复血清反应。根据猪链球菌2型HA9801株gapdh基因及上述mrp-linker-hm6基因序列设计两对引物,分别获取gapdh基因和mrp-linker-hm6基因片段,应用重组PCR技术将两个片段通过一疏水性柔性多肽接头(Gly4Ser)碱基序列进行前后拼接,构建新的gapdh-linker-mrp-linker-hm6融合基因,定向克隆至pET-28a(+),构建重组原核表达质粒gapdh-mrp-hm6-pET28a。重组质粒经限制性酶切鉴定后测序,结果表明插入片段长度为2545bp, gapdh、mrp-linker-hm6及接头拼接组合的顺序、方向完全正确。将重组质粒gapdh-mrp-hm6-pET28a转入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达分子量分别约为95.5kDa的融合蛋白GAPDH-MRP-HM6,纯化后免疫转印结果显示该融合蛋白可被猪链球菌2型HA9801株猪康复血清识别。用复壮后的猪链球菌2型HA9801株通过腹腔注射斑马鱼,测定其对斑马鱼的半数致死量LD50为2.39×105CFU／尾。将350尾斑马鱼随机分成7组,每组50尾,分别用50μg纯化的MRP、HM6、GAPDH、MRP-HM6、GAPDH-MRP-HM6融合蛋白及1×107CFU猪链球菌2型HA9801株全菌灭活苗免疫斑马鱼,首免14d后同样剂量加强免疫一次,对照组注射25μL灭菌PBS。二免后第14d用50LD50 HA9801株进行攻击,连续观察7d。结果表明,对照组斑马鱼全部死亡,MRP、HM6、GAPDH、MRP-HM6及GAPDH-MRP-HM6融合蛋白免疫组的相对保护率分别为38%、38%、32%、50%、48%,猪链球菌2型HA9801株全菌灭活苗组的相对保护率达到62%。以上结果表明,用MRP、HM6、GAPDH及其串联原核表达产物免疫斑马鱼,可使其对同源菌株攻击产生一定的保护作用,可为猪链球菌2型亚单位疫苗的研制提供参考。
姚火春[10]2009年在《猪链球菌2型MRP的分子致病作用及16S～23S rDNA区间序列鉴定方法》文中认为猪链球菌2型(Streptococcus suis type2,SS2)是猪链球菌病的重要病原,能导致仔猪患脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎、肺炎,且是一种重要的人畜共患病病原,对养猪业及公共卫生均构成严重威胁。本文研究了重组猪链球菌2型MRP诱导猪肺巨噬细胞凋亡,以阐明猪链球菌2型的分子致病机理；建立了基于16S～23S rDNA区间序列(Intergenic Spacer region, ISR)的鉴定猪源链球菌的PCR方法；对猪链球菌1998年江苏分离株进行了病原学研究。以纯化的重组猪链球菌2型MRP蛋白与猪肺巨噬细胞作用,研究MRP对猪巨噬细胞的致病作用,以探讨MRP的致病机制。通过光学显微镜形态及电子显微镜形态观察,DNA琼脂凝胶电泳和流式细胞仪检测等手段,研究MRP对猪巨噬细胞的作用。结果表明,50μg/mL和100μg/mL的重组MRP能诱导猪肺巨噬细胞发生凋亡,在作用6h后,光学显微镜和电子显微镜下可见感染细胞呈现典型的细胞凋亡形态,DNA琼脂凝胶电泳呈“梯带”图谱,流式细胞仪检测结果显示明显的亚二倍体DNA峰,凋亡率分别为10.8%和13.32%。证实MRP是SS2的重要毒力因子。猪链球菌2型与马链球菌兽疫亚种是我国猪源链球菌病的两种主要病原,对养猪业构成严重威胁。本试验利用16S-23S rDNA区间序列(ISR)的多态性,结合16S rDNA和23S rDNA的保守性,分别在16S rDNA末端和23S rDNA前端保守区设计上下游引物,PCR结果为23株猪源和8株人源猪链球菌2型参考株及分离株扩增长度约为1180bp,1株猪链球菌2型弱毒株(T15)为1070bp,25株马链球菌兽疫亚种约为1390bp,因此由PCR产物长度可区分猪链球菌和马链球菌兽疫亚种,从而达到一对引物区分两种细菌的目的。另外,针对猪链球菌2型和马链球菌兽疫亚种,分别在16S-23S rDNA区间序列内设计两对引物,结果显示能特异性地扩增出230和190bp的目的片段。由此,基于16S-23S rDNA ISR的PCR技术能鉴定猪链球菌2型和马链球菌兽疫亚种。对三株代表菌(HA9801, T15, ATCC35246)的16S-23S rDNA ISR进行测序发现,种的差异表现为碱基的插入和缺失,此对引物为区分猪链球菌2型强毒和弱毒株提供了可能。取1998年在江苏分离的3株猪源链球菌,进行了病原学鉴定。其形态、染色均符合链球菌的特点,具α或β溶血,生化试验结果不稳定。用国际通用的链球菌乳胶分型诊断液检测上述分离株,均不在其检测范围,即不属于链球菌兰氏分群的A～G群。但它们凝集猪链球菌2型抗血清,人工接种小鼠无致病性,兔有致病性。表明此次流行的猪败血症的病原不同于以往曾在我国广泛流行的马腺疫链球菌兽疫亚种,而是猪链球菌2型。
参考文献：
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[3]. 猪链球菌2型溶血素的提纯及其生物学特性[J]. 陈国强, 陆承平, 姚火春. 中国人兽共患病杂志. 2001
[4]. 猪链球菌2型江苏分离株溶血素基因缺失株的构建及特性分析[D]. 倪艳秀. 南京农业大学. 2012
[5]. 猪链球菌2型江苏分离株溶血素的纯化、化学修饰及其基因检测与分析[D]. 方绍庆. 南京农业大学. 2002
[6]. 中国部分地区猪链球菌遗传背景及进化关系研究[D]. 蔡振鸿. 南京农业大学. 2007
[7]. 猪链球菌2型检测方法的研究及其在出入境检疫中的应用[D]. 陈国强. 南京农业大学. 2011
[8]. 马疱疹病毒1型感染性克隆及表达猪链球菌2型亚单位重组病毒的构建[D]. 孙学强. 南京农业大学. 2010
[9]. 猪链球菌2型三种免疫原性蛋白基因片段的串联表达及其斑马鱼免疫保护试验[D]. 梁阳秋. 南京农业大学. 2009
[10]. 猪链球菌2型MRP的分子致病作用及16S～23S rDNA区间序列鉴定方法[D]. 姚火春. 南京农业大学. 2009
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