侯向华[1]2004年在《CD147在卵巢癌中的表达调节作用及人卵巢癌原位移植裸鼠模型的构建》文中认为【背景】 卵巢癌的死亡率居妇科恶性肿瘤首位，70％的患者就诊时已属晚期，且多因转移而死亡，因此探讨肿瘤浸润转移分子作用机制和基因治疗成为目前卵巢癌研究的热点。CD147属免疫超家族成员，不仅参与机体的致炎作用，而且在多种肿瘤组织中高度表达，促进肿瘤的浸润转移和血管形成。我们实验室前期研究结果显示CD147与卵巢肿瘤的浸润转移密切相关，有效地封闭CD147在卵巢癌细胞中的表达可抑制卵巢癌细胞的侵袭能力和穿膜能力，提示CD147可能是卵巢癌的一个药靶分子。 【目的】 初步研究缺氧对卵巢癌中CD147表达的调节作用，并为其下一步的基因治疗建立一个原位移植高转移动物模型。 【方法】 1．采用Matinspectot software和Framework software进行人源性CD147mRNA全长序列的分子生物学功能结构分析。2．采用激光共聚焦技术和半定量RT-PCR方法研究缺氧对卵巢癌细胞中CD147表达调节作用的影响。3．对缺氧细胞再氧合，观察缺氧所致CD147表达上调稳定性。4．应用显微外科技术将人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤植入裸鼠卵巢包膜内，构建人卵巢癌原位移植高转移裸鼠模型。5．对移植瘤和转移瘤组织进行HE染色和透射电镜观察，评价其生长转移的特性。6．对接种细胞和移植瘤组织进行染色体分析以鉴定肿瘤遗传稳定性。 【结果】 1．CD147分子生物学功能结构分析结果显示，CD147mRNA 第四军医大学硕士学位论文全长序列中有103个高度保守序列，其中在CD147的3’末端有两个与缺氧反应元件活性相关的HIFF/HIF转录结合位点，其高度保守的核心序列5’一ATCG一3’与缺氧反应元件的典型核甘酸序列结构相似。2.CD147蛋白定位于细胞浆中。3一AO和HO一8910PM两组细胞，急性缺氧30分钟后CD147表达量较未处理组明显增加，再氧合4小时，8小时，CD 147表达量逐渐回降，且在统计学上具有显着差异(P=0.000)。LSD一均数多重比较结果:8910PM组:未处理组和再氧合4h比较无明显差异(P二0.557)，余各组相比均有显着统计学差异(p<0.05)。3一AO组:各组之间均有显着统计学差异(P(0.05)。3.CoC12缺氧组结果显示:CD147mRNA表达量随缺氧时间的延长逐渐增加，且呈时间依赖性(r=0.998，P二0.038)。缺氧24h时 CD147mRNA仍然呈高表达。4.缺氧再氧合后卵巢癌细胞中CD147mRNA的表达回降，且呈时间依赖性(r=0.904，p=0.035)，再氧合sh时CD147表达量几乎为零。5.裸鼠卵巢部位成瘤率100%，原位移植瘤转移率75%。原位移植荷瘤鼠自然生存时间为14一30天，平均为(20.7士4.89)天。仅肝脏可见转移灶，其它脏器及淋巴结均未见转移。无腹水形成，腹腔冲洗液未见瘤细胞。裸鼠最早成瘤时间为移植后一周，最早转移时间是肿瘤移植后两周。在裸鼠连续传代过程中，移植瘤仍保持原癌组织的病理形态特点及人类卵巢肿瘤的染色体特点。【结论】1.CD147是HIF一IQ的靶基因。2.缺氧可以上调卵巢癌细胞中CD147的表达，它可能是通过增加HIF一IQ的稳定性和转录活性来实现。3.缺氧对卵巢癌细胞中CD147的表达上调作用是可逆的，瞬时性的。4.缺氧和再氧合可作为调控卵巢癌细胞系中CD147表达的一种手段。5.成功建立了人卵巢癌原位移植自发转移模型，填补了国内卵巢癌特异性单向转移模型的空白，为下一步CD147基因治疗动物实验提供了一个更科学、更可靠的技术平艺为口0
王素梅[2]2008年在《组织蛋白酶及其组织抑制剂与卵巢癌浸润转移关系的研究》文中研究指明卵巢恶性肿瘤是最常见的女性恶性肿瘤之一,5年存活率低,侵袭和转移是卵巢恶性肿瘤重要的生物学特征,是引起卵巢恶性肿瘤患者死亡的主要原因。组织蛋白酶通过降解细胞外基质(ECM),从而在肿瘤的侵袭和转移中起关键性的作用。组织蛋白酶抑制剂可抑制组织蛋白酶的活性,组织蛋白酶及其抑制剂的平衡失调可促进肿瘤的侵袭和转移。本研究的目的是探讨组织蛋白酶及其抑制剂在卵巢恶性肿瘤中的表达及与卵巢恶性肿瘤侵袭转移的关系,探讨血清中组织蛋白酶L(CTSL)及其组织抑制剂(CC)对卵巢恶性肿瘤的诊断意义,并通过体外实验进一步探讨CTSL与卵巢恶性肿瘤侵袭转移的关系,从而寻找卵巢恶性肿瘤基因治疗的方法。组织蛋白酶及其组织抑制剂在卵巢组织中的表达及临床价值目的:探讨组织蛋白酶及其组织抑制剂在卵巢组织中的表达及临床价值。方法:应用RT-PCR方法检测47例卵巢恶性肿瘤患者,20例卵巢良性肿瘤患者,21例正常卵巢组织中CTSB、CTSL、CTSD、CC的mRNA表达,进行阳性率和半定量的比较,并分析其与卵巢恶性肿瘤临床病理的关系。结果:CTSB、CTSL、CC在卵巢恶性肿瘤组织中的半定量明显高于卵巢良性肿瘤和正常卵巢组织(p＜0.05);CTSD在叁组之间的表达无统计学意义(p＞0.05);CTSB的表达与腹水量和组织学类型有关(p＜0.05);CTSL的表达与临床分期、病理分级、淋巴结转移有关(p＜0.05);CC的表达与病理分级、肝转移和大网膜转移有关(p＜0.05);CTSD的表达与肝转移和腹水量的多少有关(p＜0.05);单因素生存分析CTSL阳性率与患者的预后相关(p＜0.05),Cox比例风险回归模型分析CTSL阳性率是卵巢恶性肿瘤的独立预后因素。结论:卵巢恶性肿瘤中CTSB、CTSL、CC表达增高,并与卵巢恶性肿瘤转移有关,有可能成为卵巢恶性肿瘤预测转移和预后的指标。血清CTSL及CC含量测定在卵巢恶性肿瘤中的临床价值目的:探讨CTSL及CC在卵巢恶性肿瘤患者血清中的含量及其临床意义。方法:采用ELISA方法检测64例卵巢恶性肿瘤、23例卵巢良性肿瘤及20例正常对照血清中CTSL及CC的含量,并对其中17例初诊卵巢恶性肿瘤手术患者进行术前、术后血清CTSL和CC含量的动态观察,将结果与临床资料进行统计学分析,并进行单因素生存分析及Cox比例风险回归模型分析。结果:卵巢恶性肿瘤患者血清中CTSL及CC的含量显着高于良性组及正常对照组,差异有统计学意义(p＜0.05);同一患者术前、术后血清CTSL的含量差异有统计学意义(p＜0.05);复发患者的血清中CTSL及CC含量高于未复发患者(p＜0.05);在卵巢恶性肿瘤患者术前血清中,CTSL的含量与肿瘤的临床分期、病理分级、淋巴结转移及残余灶的大小有关(p＜0.05);CC的含量与淋巴结转移有关(p＜0.05);血清CTSL、CC与卵巢恶性肿瘤的侵袭转移有关。血清CTSL对卵巢恶性肿瘤诊断的敏感性为72.7%,特异性为76.7%,阳性预测值为70.58%和阴性预测值为76.7%,准确率75.0%。单因素生存分析CTSL的含量与患者的预后相关(p＜0.05),Cox比例风险回归模型分析显示残余灶大小是卵巢恶性肿瘤的独立预后因素。结论:血清CTSL含量在卵巢恶性肿瘤中异常升高,血清CTSL水平有可能作为诊断卵巢恶性肿瘤,判断有无复发及转移的生物学指标。CTSL基因真核表达质粒的构建与鉴定目的:构建CTSL基因的真核表达质粒并进行表达鉴定。方法:采用RT-PCR技术从人卵巢恶性肿瘤组织总RNA中逆转录CTSL基因的ORF全长,克隆到PMD18-T载体上;亚克隆至pcDNA3.1质粒,重组阳性克隆进行酶切及测序鉴定,重组质粒瞬时转染HO8910细胞,RT-PCR和Western-blot检测CTSL基因mRNA和蛋白表达。结果:RT-PCR扩增CTSL ORF全长,成功克隆入PMD18-T载体,亚克隆至pcDNA3.1质粒,重组阳性克隆经双酶切及测序鉴定证实CTSL基因已正向插入pcDNA3.1质粒。RT-PCR和Western-blot结果证实CTSL基因能够在HO8910细胞中正确表达。结论:成功构建了CTSL基因的真核表达质粒,为下一步探讨CTSL基因在卵巢癌细胞中的作用提供了实验基础。CTSL基因介导的卵巢上皮癌细胞系侵袭转移的体外实验研究目的:通过体外实验研究CTSL基因与卵巢恶性肿瘤侵袭转移的关系。方法:CTSL基因的真核表达质粒转染卵巢癌细胞HO8910,G418筛选,获得稳定转染细胞克隆,采用RT-PCR和Western-blot技术证实CTSL基因转染成功。通过测定细胞生长曲线、克隆形成实验、细胞生长周期、细胞侵袭实验、细胞迁移实验和细胞黏附实验等了解CTSL基因转染后对卵巢癌细胞生物学行为的影响。结果:通过筛选建立了稳定转染细胞系HO8910-CTSL和HO8910-pcDNA3.1。细胞生物学实验显示:CTSL基因可促进卵巢癌细胞的侵袭转移,但是对卵巢癌细胞的增殖、细胞周期和黏附性影响不大。结论:体外实验进一步证明CTSL基因与卵巢恶性肿瘤的侵袭转移有关。CTSL基因siRNA真核表达载体的构建与鉴定目的:构建CTSL基因的siRNA真核表达载体并鉴定。方法:根据GenBank数据库提供的CTSL基因核苷酸序列,设计并化学合成4对双链小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),瞬时转染卵巢癌细胞系A2780细胞,通过RT-PCR检测其对CTSL基因的沉默效果,从中筛选一对沉默效果最好的siRNA序列。并根据psilencer4.1载体插入片段设计要求,设计带有BamH1、HindⅢ粘性末端且能表达shRNA的寡核苷酸碱基对序列,退火后与psilencer4.1-CMV neo载体定向连接,测序进行鉴定,并通过RT-PCR验证其干扰效果。结果:成功构建CTSL的siRNA表达载体psilencer4.1-CMV neo-CTSL,经DNA测序证实与设计完全一致,并通过RT-PCR证明psilencer4.1-CMV neo-CTSL载体可沉默该基因。结论:成功构建了CTSL基因的siRNA真核表达载体,为下一步探讨CTSL基因对肿瘤细胞的作用奠定了基础。RNAi抑制CTSL介导的卵巢上皮癌细胞系侵袭转移的体外实验研究目的:研究RNA干扰CTSL基因对卵巢癌细胞侵袭转移的影响。方法:CTSL基因的siRNA表达载体转染卵巢癌细胞A2780,G418筛选,获得稳定转染细胞克隆,采用RT-PCR和Western-blot技术证实CTSL基因干扰成功。通过测定转染细胞的生长曲线、克隆形成实验、细胞生长周期、细胞侵袭实验、细胞迁移实验和细胞黏附实验等了解CTSL基因干扰对卵巢癌细胞生物学行为的影响。结果:通过筛选建立了稳定转染细胞系A2780-CTSL、A2780-Control、A2780-psilencer,RT-PCR和Western-blot技术证实其能够沉默CTSL基因表达。细胞生物学实验显示:沉默CTSL基因后可以抑制卵巢癌细胞的侵袭转移,但对卵巢癌细胞的增殖、细胞周期和黏附性影响不大。结论:RNA干扰CTSL基因可以抑制卵巢癌细胞的侵袭转移,有可能成为卵巢恶性肿瘤基因治疗的新方法。
潘灵辉[3]2008年在《妇科肿瘤腹腔镜手术CO2气腹与麻醉对机体和颈癌细胞生物学行为的影响》文中研究表明第二部分妇科肿瘤腹腔镜手术CO2气腹对机体的影响及循证医学研究第一章腹腔镜手术CO2气腹对呼吸与循环功能的影响目的:妇科肿瘤腹腔镜手术CO2气腹对呼吸与循环功能的影响。方法:选择腹腔镜手术(LO组)与开腹手术(AH组)各128例,分别于气(开)腹前(T0)、气(开)腹后10min(T1)、气(开)腹后30min(T2)、气(开)腹后60min(T3)和气(开)腹后90min(T4)检测两组患者的收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、心率(HR)、脉搏氧饱和度(SpO_2)、呼气末CO_2分压(P_(ET)CO_2),监测潮气量气道压(Paw)。结果:LO组气腹后各时间点与气腹前比较SBP、DBP、Paw、P_(ET)CO_2均有不同程度的上升,有显着性意义(P＜0.05);AH组开腹后各时间点与开腹前比较SBP、DBP、P_(AW)均无显着性意义(P＞0.05),而P_(ET)CO_2手术开始后呈下降趋势,与开腹前比较差异有显着差异,有统计学意义(P＜0.05);两组SpO_2均无明显变化(P＞0.05)。结论:气腹使患者循环动力学发生改变,通气功能下降,对合并有严重循环系统、呼吸系统并发症的病人慎用腹腔镜手术。第二章腹腔镜CO_2腹气对麻醉方法安全的循证评价目的:评价CO_2腹气对腹腔镜手术中全身麻醉与硬膜外麻醉的安全性。方法:检索CBMdisc光盘数据库、MEDLINE数据库及Cochrane图书馆麻醉学专业组数据库,筛选符合纳入标准的1997年1月至2007年12月公开国内发表的文献15篇。纳入标准为原始文献类型为前瞻性随机对照研究或设计良好的非随机对照研究。通过各研究间的异质性分析及固定效应、随机效应两种模型的综合分析得出生存结果,统计学方法采用Cochrane协作网提供的软件包RevMan 5.0。结果:纳入的15个研究中,全身麻醉与硬膜外麻醉的各项指标异质性Q检验显示差异无统计学意义,WMD值＞0,p=0.11～0.80＞0.05。结论:通过Meta分析的结果表明,硬膜外麻醉与全身麻醉应用于腹腔镜手术同样安全可靠。第叁章腹腔镜手术对机体免疫功能影响的临床初步研究目的:观察腹腔镜与开腹子宫切除术对机体免疫功能的影响。方法:选择40例病人,20例病人接受腹腔镜下子宫切除术(LH组),20例病人接受开腹子宫切除术(AH组),分别于手术前、术后24h、手术后72h抽血检测CD3、CD4、CD8、TNF-α的浓度,观察其变化。结果:两组术后TNF-α浓度与术前相比均明显升高(P＜0.01);术后24h、72h血清TNF-α浓度LH组明显低于AH组(P＜0.01);AH组患者在术后24h、72h外周血T淋巴细胞亚群CD3、CD4、CD8均明显下降(P＜0.01),然而,LH组患者在术后24h、72h外周血T淋巴细胞亚群CD3、CD4、CD8的浓度下降与术前比较无统计学意义。结论:腹腔镜子宫切除术后对免疫功能无明显影响,同时,应注意保护开腹病人的术后免疫功能。第叁部分CO_2气腹对官颈癌Hela细胞生物学影响的实验研究第一章CO_2对宫颈癌Hela细胞生长及细胞周期影响的体外实验目的:研究CO_2气腹对体外宫颈癌细胞增殖及浸润转移的影响。方法:利用宫颈癌细胞作为研究对象,建立体外CO_2气腹模型,将宫颈癌细胞经不同压强、不同时间CO_2作用后,实验测定细胞生长曲线、细胞集落形成、细胞生长周期、细胞侵袭、黏附、迁移能力,观察癌细胞生长浸润转移的变化。结果:CO_2人工气腹后,宫颈癌细胞的生长增殖在受到短暂抑制后,增殖能力明显增强,但与CO_2作用压力大小无关。经CO_2作用后,宫颈癌细胞的侵袭、迁移和黏附能力显着下降。结论:CO_2气腹对宫颈癌细胞的生长周期、增殖能力起促进的作用;与对照组比较抑制了宫颈癌细胞的浸润、粘附、转移能力。第二章CO_2对宫颈癌Hela细胞生长影响的体内实验目的:探讨CO_2对宫颈癌Hela细胞生长影响影响。方法:运用宫颈癌裸鼠模型,建立宫颈癌裸鼠人工CO_2气腹,设立气腹组、开腹组和对照组,术后4周处死全部裸鼠,打开腹腔,依次查找腹腔器官,分离肿瘤组织,计数各脏器肿瘤转移数,称量转移瘤重量,同时检测裸鼠术前术后体重下降情况。结果:CO_2气腹组术后4周腹腔生长的肿瘤质量较开腹组和对照组明显增加,开腹组的肿瘤质量与对照组无显着性变化,气腹组腹壁切口出现转移瘤,腹腔种植和播散较开腹组和对照组明显。实验后开腹组裸鼠体重下降显着于人工气腹组和对照组。结论:CO_2人工气腹较开腹手术更易促进腹腔肿瘤播散和肿瘤的种植。第叁章CO_2对宫颈癌Hela细胞抗失巢凋亡特性影响目的:观察CO_2对宫颈癌Hela癌细胞系抗失巢凋亡能力的影响。方法:以宫颈癌Hela癌细胞系为研究对象,利用MTT、悬浮培养、流式细胞仪、软琼脂克隆形成实验观察CO_2对宫颈癌Hela癌细胞系体外培养过程中增殖和抗失巢凋亡的影响。以SPSS13.0软件对实验结果进行检验。结果:实验组与对照组均具有凋亡能力和抗失巢凋亡能力,实验组的增值能力和克隆形成明显高于对照组(P＜0.01),但,在体外培养过程中实验组与对照组比较实验组抗失巢凋亡能力明显低于对照组。结论:CO_2能够提高宫颈癌Hela细胞克隆形成能力,但并不能提高抗失巢调亡能力,因此,CO_2不能促进癌细胞浸润、转移。第四章CO_2作用宫颈癌Hela细胞相关基因差异性表达检测目的:为了解CO_2作用后的宫颈癌Hela细胞生物学行为改变的机制,依据基因分子平台,研究经CO_2诱变的宫颈癌细胞的差异表达基因。方法:将宫颈癌Hela细胞进行CO_2处理后(8mmHg,培养1天)进行克隆化,筛选出生长速度较快的两组细胞克隆,编号为CO_2A、CO_2B细胞克隆,成瘤能力强,与对照组差异均有显着性(P＜0.05),应用480个人类肿瘤相关基因的Oligo双通道芯片研究差异表达基因。分别抽提CO_2A、CO_2B组和对照组细胞的总RNA,逆转录cDNA并标记探针。将实验组和对照组cDNA探针混合,分别与同一张芯片杂交后,用不同的波长扫描荧光强度,从而筛选出差异基因。结果:CO_2A组与对照组对比有29个基因呈现差异表达,其中上调2倍基因1个,下调2倍基因有28个;CO_2B组与对照组对比有138个基因呈现差异表达,上调2倍差异基因9个,下调2倍差异基因129个。上调差异性表达主要涉及细胞生长、细胞凋亡、细胞增殖、细胞周期调控和信号转导基因等,下调差异表达给予你主要涉及细胞信号传导、抑癌基因、细胞黏附基因、失调控细胞调亡、MARK信号传导通路、调控细胞增值基因等。结论:研究表明,CO2诱变宫颈癌细胞的基因差异表达,导致了细胞生物学行为的改变。第五章CO_2作用Hela细胞系的CAV1、CDK9基因mRNA表达水平测定目的:研究CO_2作用宫颈癌Hela细胞系CAV1、CDK9的表达情况,分析其在肿瘤生长与转移中的作用。方法:采用实时荧光定量RT—PCR法检测CO_2作用后实验组CO_2A(8mmHg,4h,培养24h)、CO_2B(8mmHg,4h,培养120h)及对照组(Hela细胞系未进行CO_2处理)的宫颈癌Hela细胞系CAV1-mRNA、CDK9-mRNA的表达情况。结果:CO_2A、CO_2B实验组与照组比较,CAV1、CDK9的相对量明显下降,同时,CO_2B组与CO_2A组比较,CO_2B组CAV1、CDK9的相对DNA量比CO_2A组明显减少,说明,两个基因在CO_2作用下受到抑制出现基因下调表达。结论:实时荧光定量RT-PCR可以敏感且特异性的检测出宫颈癌Hela细胞系CAV1-mRNA、CDK9-mRNA的表达,且方法准确可靠,操作方便,RT-PCR的结果进一步应证了基因芯片检测结果,提示两个基因在CO_2作用下受到抑制出现下调表达。
参考文献：
[1]. CD147在卵巢癌中的表达调节作用及人卵巢癌原位移植裸鼠模型的构建[D]. 侯向华. 第四军医大学. 2004
[2]. 组织蛋白酶及其组织抑制剂与卵巢癌浸润转移关系的研究[D]. 王素梅. 广西医科大学. 2008
[3]. 妇科肿瘤腹腔镜手术CO2气腹与麻醉对机体和颈癌细胞生物学行为的影响[D]. 潘灵辉. 广西医科大学. 2008
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