福建医科大学附属漳州市医院检验科 福建漳州 363000
【摘要】目的 观察慢性乙肝病毒(HBV)感染者免疫功能的变化，探讨病毒复制程度与免疫功能的关系。方法 应用流式细胞仪检测91例慢性乙肝病毒感染者，31例正常对照外周血T淋巴细胞亚群及B淋巴细胞百分率；用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测HBV感染者HBV-DNA病毒拷贝数，根据HBV感染者血清中HBV-DNA病毒拷贝数，将它们分为DNA阴性组(<10³ IU/ml)、低拷贝组（10³-105IU/ ml）、高拷贝组(>106 IU/ ml)。结果 低拷贝组、高拷贝组的CD3+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+比值比对照组明显减低； DNA阴性组、低拷贝组、高拷贝组的CD19+比对照组明显增高; 低拷贝组、高拷贝组的CD3+CD4+、、CD4+/CD8+比值比DNA阴性组明显减低。 而CD3+CD8+、CD3+、CD19+在低、高拷贝组及DNA阴性组之间没有明显差异存在（P﹥0.05）。结论 HBV感染可导致感染者免疫功能的改变，随着HBV-DNA复制增加，慢性HBV感染者淋巴细胞免疫功能紊乱加重。
【关键词】慢性乙肝病毒感染者；T淋巴细胞亚群；B淋巴细胞；HBV-DNA
[Abstract] Objective To investigate the changes of immune function in patients with chronic hepatitis B ,and to analyze the relationship between the level of HBV-DNA and immune function Methods Flow cytometry was used to detect the peripheral blood T-lymphocyte subsets and B lymphocyte in 91 patients of chronic hepatitis B and 31 healthy blood donors.The level of HBV-DNA in patients of chronic hepatitis B was tested by fluorescence quantitative polymerase chain reaction(FQ-PCR),patients was divided in
HBV-DNA negative group(<10³ IU/ml),lower HBV-DNA group（10³-105IU/ ml） and higher HBV-DNA group(>106 IU/ml).Results Compared with healthy control,the percent of CD3+、CD3+CD4+、the ratio of CD4+/CD8+ decreased markedly in lower HBV-DNA group and higher HBV-DNA group,but the percent of CD19+increased markedly in HBV-DNA negative group、lower HBV-DNA group and higher HBV-DNA group. Compared with HBV-DNA negative group, the percent of CD3+CD4+、the ratio of CD4+/CD8+ decreased markedly in lower HBV-DNA group and higher HBV-DNA group,but the percent of CD3+CD8+、CD3+、CD19+ had no different in statistically significant（P﹥0.05）
Conclusions the immune function could be changed by hepatitis B virus infection in patients ,as the level of HBV-DNA increasing ,the immune function of lymphocyte was disturbed serious in chronic hepatitis B
[Key words] Chronic Hepatitis B, T-Lymphocyte Subset, B Lymphocyte,
乙型肝炎病毒(HBV)是一种非细胞毒性病毒，其所致的肝细胞损坏是由机体针对HBV特异性抗原的免疫反应所引起，HBV感染所致的不同临床结果与机体不同的免疫状态密切相关[1]。机体免疫功能及病毒逃逸免疫的能力决定了HBV感染发生，发展和转归[2]。本文采用直接免疫荧光法通过流式细胞仪检测HBV感染者外周血T淋巴细胞亚群(CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+) 、B淋巴细胞(CD19+)及采用FQ-PCR检测血清中HBV-DNA载量水平，来评价HBV感染后血清HBV-DNA水平与机体免疫功能变化的关系。
1 材料和方法
1.1 研究对象 91例慢性乙肝病毒(HBV)感染者，男64例，女27例，年龄17-75岁，平均年龄36.9岁，符合2000第十次全国病毒性肝炎及肝病学术会议修订的病毒性肝炎诊断标准。正常对照组31例，其中男21例，女10例，年龄22-70岁。平均年龄35.7岁，均为我院体检中心体检合格的健康人。
1.2 仪器和试剂 IMMUNO-TROL™Cells标准品、CD19-PE、 CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PC5荧光标记抗体及红细胞裂解液(Opti2LyseC)购自法国Immunotech公司，流式细胞仪为Beckman-Coulter公司生产的Epics-XL型流式细胞仪，HBV核酸荧光定量PCR试剂盒为厦门安普利生物工程有限公司生产，PCR扩增仪为Amplly公司的GeneLight9800荧光定量核酸扩增仪。
1.3 标本收集 抽取静脉血6ml分三管，一管用EDTA-K2抗凝，用于流式细胞术检测；另两管为分离胶管，分离血清后用于HBV及HBV-DNA病毒检测。
1.4 检测方法 采用IMMUNO-TROL™Cells标准品进行校正。各取100µl抗凝血于流式专用试管中，分别加入20µlCD19-PE、CD4-FITC/CD8-PE /CD3-PC5荧光标记抗体，室温闭光反应20min，加入500µl红细胞裂解液，溶解红细胞15min，加入500µl鞘液混匀，1000rpm/min离心5min，弃上清，再加入500µl鞘液，混匀后上机检测并记录荧光抗体染色阳性CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+ 及CD19+百分率。HBV-DNA定量分析采用荧光定量PCR法，严格按照试剂说明书步骤进行，HBV-DNA检测单位IU/ml表示。
1.5统计学分析 通过统计学分析，最后均数间数据采用t检验。
2 结果 见下表
3 讨论
CD3分子构成TCR/CD3复合体为T细胞的特异性表面分子。根据T细胞表面表达CD4+CD8+分子，又分为T辅助/诱导细胞亚群(CD3+CD4+)和T抑制细胞亚群(CD3+CD8+) 。TH细胞可产生多种淋巴因子，在体液免疫和细胞免疫的调节中起关键作用，在病毒的免疫应答中发挥中心作用；同时，对病毒清除起重要作用[3]。CD8+T细胞激活和抑制严格依赖CD4+TH细胞，正常情况下，两者保持一定的比例，维持机体的细胞免疫功能。TCR/CD3复合体是CD3+T细胞与T细胞抗原受体的独特结构(TI)结合形成的，传递信息。所以T淋巴细胞状态直接反映细胞免疫状况。本文结果表明DNA低拷贝组、高拷贝组的CD3+T细胞百分率及CD3+CD4+T与对照组、DNA阴性组比较明显减低，表明感染者特异性T细胞作用有所加强，而T辅助/诱导细胞亚群(CD3+CD4+)细胞生成减少，使特异性抗体产生不足，不能清除游离的乙肝病毒,可造成病毒在体内持续存在。CD4+/CD8+比值可监测人体细胞免疫功能，反映机体免疫状态的重要指标，比值失衡可能造成免疫紊乱和一系列免疫病理改变。本实验结果表明，与正常对照组、DNA阴性组比较，低拷贝组、高拷贝组CD4+/CD8+比值显著差异 (P<0.01)，与相关报道一致[4-5]。动态观察该比值的变化趋势可以反映HBV-DNA体内复制情况。
人体体液免疫是机体免疫应答的重要组成成分之一，在人体特异免疫功能中起着重要的作用，是致敏B淋巴细胞受抗原刺激后，即转化为浆细胞并产生能与相应抗原结合的抗体[6]。B淋巴细胞作为人体的主要体液免疫细胞，其细胞表面标志已被人们所认识， CD19+细胞代表B淋巴细胞水平。乙型肝炎病毒并不直接引起肝细胞的损伤，而是由于感染乙型肝炎病毒后引起人体细胞免疫和体液免疫应答造成的。本研究发现，慢性乙肝病毒(HBV)感染者的各组CD19+明显高于正常对照组(P<0.05)。说明体液免疫在慢性肝炎的病程中起到关键作用，B淋巴细胞产生的抗体能对血液中的乙型肝炎病毒进行反应加以杀灭。
综上所述，通过对HBV感染者外周血T淋巴细胞亚群及B淋巴细胞检测，可及时提示HBV感染者免疫功能的变化并加强临床监测。
参考文献:
[1]van Hecke E,Paradijs J,Molitor C, et al. Hepatitis B virus specific eytotoxic T lymphocyte response in patients with acute and chronic hepatitis B virus infertions[J].J Hepatol.1994,20(4):514-523.
[2]Mini MK , Boni C , Lee CK ,et al. The role of virus specific CD8+ cells in liver damage and viral control during persistent hepatitis B virus infection[J].J Experimental Medicine,2000,191(8):1269-1280.
[3李鸿宾,江晓萍,黄浏培,等.测定慢性乙型肝炎患者外周血T淋巴细胞亚群的临床意义[J].安徽医药,2006,10(8):588-589.
[4]丁兆明. 乙肝相关疾病HBV-DNA含量与细胞免疫功能相关性研究[J].医学检验与临床,2008,19(3):28-29.
[5]刘明,陆颖,等.慢性乙型肝炎病毒感染者外周血T细胞亚群化与其血清HB-DNA的水平分析[J].中国实验诊断学,2008,12(2):232-235.
[6]彭文伟.传染病学[M].第4版.北京:人民出版社.1999.5
论文作者:郑源海
论文发表刊物:《临床医学教育》2017年11月
论文发表时间:2017/12/15
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