罗心静[1]2003年在《全血基因组DNA的快速提取及其应用》文中研究表明目的：建立简便、快速、可靠的分离纯化全血中基因组DNA的方法，以便能在普通的临床实验室使用和推广。 方法：采用不完全溶血剂STMT处理全血样品，异硫氰酸胍裂解白细胞核，硅胶特异性吸附释放出来的DNA，漂洗液洗去硅胶上非DNA成分，最后用TE把DNA从硅胶上洗脱下来。对所建立的方法的实验条件包括异硫氰酸胍(GuSCN)浓度、结合液pH值、结合温度等进行优化，从而得到高质量的DNA溶液，建立异硫氰酸胍-硅胶法。并对所建立的方法通过以下几方面进行评价，包括DNA的产量、DNA的纯度、DNA的完整性、RNA的污染、重复性，以及将纯化产物应用于PCR反应和限制性内切酶消化，并与传统的SDS-蛋白酶K/苯酚-氯仿(简称酚-仿)法进行比较。 结果： 1、异硫氰酸胍(GuSCN)浓度、结合液pH值和结合温度等影响异硫氰酸胍-硅胶法的提取效率。其最佳条件是GuSCN浓度为4M、结合液pH值为6.5、结合温度为37℃。 2、异硫氰酸胍-硅胶法提取DNA平均含量(3.7μg/100μl全血)高于酚-仿法(2.99μg/100μl全血)(p＜0.05)，纯度(OD260/OD280 1.78)与酚-仿法(OD260/OD280 1.76)无显着差异(p＞0.05)；RNA污染试验表明，该方法提取的DNA基本上无RNA污染；琼脂糖凝胶电泳结果显示，该方法提取的DNA为大分子物质，在紫外吸收有典型的DNA紫外吸收峰。 3、该方法重复性好，提取DNA的产量批内变异系数为6.02％，纯度批内变异系数为6.74％。 4、提取DNA适合于限制性酶切反应，PCR反应等。 结论： 1、建立简单、快速提取全血基因组DNA的异硫氰酸胍-硅胶法，整个提取过程费时小于40min。 2、提取的DNA质量高、纯度好，适用于大多数分子生物学实验，如PCR、限制性酶切反应等。 3、费用低，无需贵重试剂和特殊仪器，易于临床实验室大规模使用。
秦奎伟[2]2016年在《空间微流控芯片基因扩增关键技术研究及其装置的研制》文中研究指明近十年是中国载人航天事业史诗般发展的十年,中国空间站预计于2022年前后全面建成,未来将成为中国空间科学和新技术研究实验的重要基地。空间生命科学是空间科学研究的重要研究方向,而空间科学仪器设备则又是空间生命科学研究不可或缺的基础,同时也决定了空间生命科学研究的能力。由于空间特殊环境以及空间站载荷能力限制,常规实验方法及仪器设备不能满足空间生命科学研究以及空间搭载需求,因此不仅需要在概念、原理和技术上进行创新,还需要对空间生命科学研究仪器设备提出各种环境适应性要求。在国家973项目、863计划、国家科技支撑计划和国家重大仪器专项等一系列重大研究计划的支持下,小型化、低功耗、高自动化与集成化的空间生命科学研究仪器设备的研制相继开展,成熟化的项目研究成果未来也将有可能在中国空间站进行搭载并应用。空间基因扩增是空间生命科学研究的重要手段,空间基因扩增装置的研制不仅能够为在分子层面开展空间辐射、微重力环境引起生物体损伤、遗传变异机制及其防护的研究提供平台支持,还可有助于了解航天员长期空间飞行可能存在的损伤,预测和评价航天员的身体健康。本课题针对空间站搭载要求,结合微流控芯片体积小、分析速度块、耗样量少、易于实现集成化、自动化、高通量等特点,研制一套用于空间生命科学研究的微流控芯片基因扩增装置,考虑到对DNA扩增高保真的要求,本课题采用变温PCR扩增技术进行基因扩增,重点攻克空间微流控芯片基因扩增的若干关键技术,如微流控芯片基因扩增DNA提取技术、细胞直接扩增技术、芯片表面钝化技术以及温度改良技术等,为未来微流控芯片因扩增装置在空间站的搭载及应用提供技术基础支持。在以空间搭载为目的的微流控芯片基因扩增装置研究基础上,开展民用化转化研究,研制一套小型化微流控芯片基因扩增装置,推动空间技术在生命科学仪器及医疗器械领域的民用化应用研究。本论文取得以下创新性研究成果:(1)对实验室现有微流控芯片加工技术进行标准化研究,提出了应用于空间生命科学研究的玻璃、PMMA、NOA81叁种微流控芯片的标准化加工方法,完成了叁种微流控芯片的加工并在本课题相关研究中得到应用。通过微流控芯片加工方法的标准化研究,减小了芯片加工的差异化,避免了因加工方法引起的实验误差。(2)设计并加工了一款直通道侧壁多腔室结构的玻璃微流控芯片,在芯片上采用液液萃取的方法25min内完成200μl全血基因组DNA的在线提取,其扩增产物的量可达常规DNA提取方法的1/2。该种芯片DNA提取技术具有连续、快速等优点,可大大简化样品DNA的提取步骤,提高样品DNA的处理能力及提取自动化程度,同时也缩减了仪器装置的体积,未来通过DNA提取芯片与空间微流控芯片基因扩增装置的集成,适用于在空间站中对空间生物样品在线进行DNA提取及基因扩增分析。(3)设计并加工了一款用于细胞直接扩增的NOA81型微流控基因扩增芯片,提出了一种温度梯度循环对细胞进行在线破碎的方法。利用该方法成功地在芯片上实现了HEK细胞的在线破碎、DNA释放以及基因扩增的一体化操作。该种芯片细胞直接扩增技术无需DNA提取步骤,具有简便、快速等优点,大大缩减仪器装置体积。未来通过细胞直接扩增芯片与空间微流控芯片基因扩增装置的集成,可提高装置生物样品的自动化分析能力,并且满足空间搭载仪器装置小型化、低功耗、自动化的需求,为装置的空间搭载及应用提供了可能。(4)发展了一种BSA包被NOA81微流控芯片的方法,用于减小芯片材料对基因扩增的抑制作用。通过该方法对芯片表面的钝化处理,芯片上HLA-DRB1基因扩增效率提高了7倍,并且实现了AEB-HV基因辐射前后芯片上的扩增对比实验。该BSA包被方法操作简便、实用性强,生物兼容性好,为NOA81微流控芯片在空间基因扩增领域的应用打下了良好的基础。(5)改进并完善了一种微流控芯片表面温度控制的方法,该方法主要通过对芯片热源Pletier表面进行溅射镀铜操作,使其温度性能得到提高。利用该方法,微流控基因扩增芯片的温度均一性、降温速度以及PCR扩增效率得到明显提高。该方法具有操作简便、实用性强等优点,大大提高了微流控芯片基因扩增的准确性与可靠性,为该种基于Pletier为热源的微流控芯片未来在空间基因扩增领域的应用提供了强有力的技术支持。(6)搭建了一套空间微流控芯片基因扩增装置,设计加工了与之匹配的NOA81型微流控基因扩增芯片。该装置集成芯片单元(包括核酸扩增芯片和核酸杂交芯片)、液路单元、电控单元、检测单元,可初步实现芯片上IL-6、TNF-α、HMGB-1和BDNF四种基因的同时扩增,以及芯片上cy3标记的IL-6扩增产物的基因芯片探针杂交检测。该装置具有小型化、低功耗、集成化与自动化等优点,具有空间站搭载及空间生物样品在线基因分析的应用潜能。(7)研制了一台小型化民用化的微流控芯片基因扩增装置,并设计了一种可插拔式的微流控芯片。利用该装置可实现芯片上快速PCR基因扩增、STR-PCR扩增以及LAMP扩增,其中该装置通过STR-PCR扩增在法医学个体识别中得到初步应用,芯片LAMP扩增也成功地在沙门氏菌快速检测中得到应用。该装置具有小型化、快速、成本低廉、功能灵活等特点,通过进一步的装置结构优化及外观设计,未来该装置有望在床边快速诊断(point of care test,POCT)、法医学鉴定、食品安全等领域进行产业化推广应用。
张立明[3]2005年在《磁性微球的制备及其在基因组脱氧核糖核酸提取上的应用》文中研究表明随着生命科学和生物工程的快速发展,磁分离技术以其简便而快速的分离应用,适于多样化的样品基质,易自动化和微型化的特性正成为生命科学领域不可缺少的手段。本文以本实验室采用模板法和化学共沉淀法制备的叁种不同基质类型的磁性微球和硅胶为吸附剂,聚乙二醇(PEG)和氯化钠(NaCl)组成的吸附液,研究了小牛胸腺脱氧核糖核酸(DNA)在基于硅醇基的固相载体上的吸附行为。实验结果表明,吸附液组成为20 %(w/v)PEG和2.0 mol/L NaCl和洗脱时间为10 min的条件下,DNA的回收率可达80%。磁性微球的提取效率与硅胶相仿,但是由于省去了离心分离步骤,缩短了核酸模板制备时间,有利于实现自动化操作。为了研究DNA在磁性微球上的吸附机理,我们进一步研究了从PEG和NaCl组成的吸附液中,DNA被吸附至固相载体上的吸附等温线,研究中发现,DNA的吸附可用弗仑德里希吸附模型加以描述,相关系数均可达0.994以上。采用研磨法粉碎哺乳动物组织小牛胸腺和植物组织玉米仁,经细胞裂解液破细胞后,以硅醇基表面的磁性微球为固相载体,进行基因组DNA磁分离提取,得到了片段约20 kb,A_(260)/A_(280)大于1.77的高纯度DNA。将磁性微球用于野生酿酒酵母菌基因组DNA的提取。采用两种不同的方法部分和完全裂解酿酒酵母细胞壁,获得了片段分别为5 kb和20 kb左右,且A_(260)/A_(280)在1.77-1.89之间的DNA片段。对所制备的磁性微球用硅烷化试剂表面改性后,将不同表面官能团的磁性微球用于小牛胸腺、玉米仁和野生酿酒酵母基因组DNA的提取。与硅醇基表面的磁性微球一样,获得了较好的结果。
卢瑛, 刘照关, 徐宏, 古宏晨[4]2008年在《一种快速提取基因组DNA的方法》文中研究指明采用氧化硅超顺磁性纳米磁珠和自己设计的试剂体系及提取流程,建立了一种基因组DNA的快速提取方法,该方法以氧化硅磁珠为固相吸附载体,盐酸胍、β-巯基乙醇和SDS为主要裂解吸附试剂。以全血或培养细胞为实验材料进行基因组DNA的提取结果显示建立的方法提取100μl小鼠抗凝血,可得2~3μg基因组DNA,OD260/OD280为1.8±0.05,其纯度可满足后续的酶切和PCR生物操作要求。该方法整个提取过程只需12分钟,不需特殊实验条件同时可省略蛋白酶K的消化过程和离心操作,适用于一般实验室的需求,是一种操作简便、快速高效的提取方法。
李晓晓, 赵焕英, 杨云廷, 徐舒, 徐志卿[5]2013年在《叁种人全血基因组DNA提取方法的比较》文中研究指明目的:比较改良酚-氯仿抽提法、盐析法、试剂盒法从人全血中提取基因组DNA的效果,以期建立一种快速、经济的提取高质量基因组DNA的方法。方法:分别用上述叁种方法从人全血中提取基因组DNA,通过紫外分光光度计、琼脂糖凝胶电泳、聚合酶链式反应(PCR)、限制性内切酶酶切检测提取的基因组DNA的产量、纯度和质量。结果:改良酚-氯仿抽提法与试剂盒法提取的基因组DNA相比,DNA的产量有统计学差异,DNA的纯度无统计学差异,但试剂盒法提取的基因组DNA有较明显的降解现象;盐析法与改良酚-氯仿抽提法、试剂盒法相比,基因组DNA的产量和纯度都存在统计学差异,并且基因组DNA聚合酶链式反应(PCR)扩增的稳定性也明显劣于另外两种方法;叁种方法提取基因组DNA均能进行限制性内切核酸消化。结论:改良酚-氯仿抽提取法是一种经济、快速、高效、稳定提取人全血基因组DNA的方法,适用于批量临床标本处理。
杨泽民, 罗少洪, 陈耕夫[6]2009年在《叁种全血基因组DNA提取方法的比较》文中进行了进一步梳理目的比较高盐法、改良高盐法和超声波处理法叁种方法对全血基因组DNA的提取效果。方法取200μl肝素抗凝血,分别采用上述叁种方法提取基因组DNA,用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和含量。结果叁种方法提取的基因组DNA含量分别为:高盐法38μg/ml全血;改良高盐法76.5μg/ml全血;超声波处理法20μg/ml全血;叁种方法提取的基因组DNA纯度用A260/A280表示分别为:高盐法1.62;改良高盐法1.46;超声波处理法4.10。结论叁种全血基因DNA提取方法操作简便、安全、快速,以改良高盐法提取效率最高。
李纯钢, 唐圣松[7]2004年在《全血基因组DNA快速提取法》文中指出目的 建立一种简便、快速、有效、微量外周血基因组DNA的提取方法。方法 采用NaI作细胞裂解剂裂解细胞和细胞核 ,用氯仿∶异戊醇 ( 2 4∶1 )直接提取基因组DNA。结果 该方法提取外周血基因组DNA的纯度高 ,A2 60nm/A2 80nm=1 .83± 0 .1 3,每毫升外周血可得DNA 33± 3.5 2 μg。结论 本法简便、快速、有效 ,适用于批量临床标本的处理。
张彩权[8]2010年在《四氧化叁铁磁性复合微球的制备及其在全血基因组DNA自动化提取中的应用》文中研究表明与传统的核酸纯化方法相比,以Fe304磁性复合微球为载体的核酸纯化方法由于其纯化过程不需要离心,避免了交叉污染,提取结果重复性好、稳定性高、操作简单等优点而成为一种非常有前景的纯化方法,目前国内应用于大规模自动化生物分离的磁性微粒产品仍较少。本研究旨在利用水热合成的方法制备四氧化叁铁磁性微粒,并将二氧化硅修饰在磁性微粒表面形成磁性复合微球,使其具有良好的磁响应性和化学稳定性,并将磁性复合微球应用于全血基因组DNA纯化,建立了快速、高效、高质量的核酸自动化纯化体系。主要得到了以下结论：(1)利用水热合成的方法制备了Fe304磁性微粒,并以X射线衍射(XRD)、透射电子显微镜镜(TEM)、扫描电子显微镜(SEM)、傅立叶红外光谱(FT-IR)、振动样品磁强计(VSM)等分析技术对Fe3O4粒子的物相、微观形貌和磁学性能进行了表征,实验结果表明,制备的Fe304磁性粒子粒度大小在200 nm-300 nm范围内,粒径分布均一、大小可控、分散性好,平均饱和磁化强度为72.6 emu／g,室温下接近于超顺磁性。(2)利用TEOS水解将二氧化硅包覆在Fe304磁粒上,制备了具有良好磁响应性和化学稳定性的SiO2@Fe3O4磁性复合微球。并利用XRD、TEM、FT-IR、VSM等分析技术对复合微球进行了表征,其结果表明：复合粒子表面均匀包覆了无定型SiO2壳层,其结构为核壳结构,复合微球的平均饱和磁化强度为68.8 emu／g。(3)SiO2磁性复合微球在全血基因组DNA纯化上的应用：利用本实验室已建立的核酸纯化试剂体系,以制备的SiO2磁性复合微球为载体,提取全血基因组DNA。经过优化后的DNA纯化体系,换算成每毫升新鲜血液提取的基因组DNA的量平均为29.8μg,经紫外分光光度计检测和琼脂糖凝胶电泳检测,结果显示DNA的片段大小在22 Kb左右,电泳中所有DNA均呈均一条带,未发生降解,且纯度较高。将优化的体系与开放式的核酸自动化提取工作站相结合,并对自动化提取过程进行了优化,结果显示：应用自动化纯化体系,换算为每毫升新鲜血液平均可以提取38.9μg的基因组DNA,电泳中所有DNA都呈明亮均一的条带,没有发生降解。对磁性复合微球载体批内差和批间差的测试表明,优化体系的批内差和批间差都在5%以内,重复性好,一个纯化周期80 min内可提取96个样本,大大增加了全血基因组DNA提取的效率,从而建立了一种高效、快速、稳定性的核酸纯化体系,为试剂体系用于大规模自动化的核酸提取及后续的实验奠定了基础。
蓝月[9]2009年在《二氧化硅纳米粒子固相萃取全血中DNA的研究》文中研究表明全血样品基体复杂,对于其中的DNA进行分析时,分离纯化操作常常是必要的。本论文以二氧化硅纳米粒子为DNA分离纯化的新型固相吸附剂,建立了一种快速、高效的DNA分离纯化方法,实现了全血中DNA的自动化在线萃取。第一章综述了DNA分离纯化的意义、发展历程和常用分离纯化方法,介绍了固相萃取法分离纯化DNA的原理、常用吸附材料,DNA在线固相萃取技术,以及纳米材料固相萃取方法研究进展,最后提出本论文的工作目的及设计思想。第二章建立了以二氧化硅纳米粒子为固相吸附剂的DNA分离纯化方法。探讨了二氧化硅纳米粒子萃取DNA的机理,考察了胍盐浓度、样品溶液pH值、吸附时间、吸附温度、洗脱液pH值、洗脱时间、洗脱温度等实验条件对分离纯化效率的影响。在饱和胍盐条件下,二氧化硅纳米粒子对DNA的吸附效率在0.5min内即可达到98%,二氧化硅纳米粒子对DNA的平均吸附容量达124ng/mg。在55℃条件下,以1×TE(pH8.3)溶液洗脱15min,DNA回收率可达90%。整个固相萃取过程在25min内就能完成。第叁章制作了二氧化硅纳米粒子萃取柱,以顺序注射技术为样品预处理手段,建立了全血DNA在线纯化方法。通过对萃取柱进行加热,提高了DNA的回收率,优化了上样流速、洗脱流速、萃取柱温度等实验条件。在最佳实验条件下,在线纯化系统对于DNA的回收率达69%,整个萃取过程所需时间仅为4min。使用该纯化过程处理的人全血样品的DNA产物,通过PCR扩增反应,验证了二氧化硅纳米粒子作为固相吸附剂对全血样品中DNA提取的纯化效果。第四章对本论文建立的快速、高效DNA分离纯化系统进行了总结和展望。
朱德华[10]2003年在《全血基因组DNA的快速纯化》文中研究说明目的 探讨全血基因组DNA的快速纯化方法。方法 微量全血通过红细胞裂解后,得到白细胞,再通过白细胞裂解,高盐离子去除蛋白,异丙醇沉淀即可得到高纯完整的全血基因组DNA。结果 该方法简单快速,得到的产品产率高(6.94μg/300μl全血),纯高度(A_(260)/A_(280)=1.82,A_(260)/A_(230)=2.08),完整性好(单一条带)。结论 该方法快速、高效,不仅缩短了实验时间,而且还提高了产品质量,可完全满足实验室快速分析的要求。
参考文献：
[1]. 全血基因组DNA的快速提取及其应用[D]. 罗心静. 中南大学. 2003
[2]. 空间微流控芯片基因扩增关键技术研究及其装置的研制[D]. 秦奎伟. 北京理工大学. 2016
[3]. 磁性微球的制备及其在基因组脱氧核糖核酸提取上的应用[D]. 张立明. 天津大学. 2005
[4]. 一种快速提取基因组DNA的方法[J]. 卢瑛, 刘照关, 徐宏, 古宏晨. 中国生物工程杂志. 2008
[5]. 叁种人全血基因组DNA提取方法的比较[J]. 李晓晓, 赵焕英, 杨云廷, 徐舒, 徐志卿. 现代生物医学进展. 2013
[6]. 叁种全血基因组DNA提取方法的比较[J]. 杨泽民, 罗少洪, 陈耕夫. 中国实用医药. 2009
[7]. 全血基因组DNA快速提取法[J]. 李纯钢, 唐圣松. 南华大学学报(医学版). 2004
[8]. 四氧化叁铁磁性复合微球的制备及其在全血基因组DNA自动化提取中的应用[D]. 张彩权. 西北大学. 2010
[9]. 二氧化硅纳米粒子固相萃取全血中DNA的研究[D]. 蓝月. 东北大学. 2009
[10]. 全血基因组DNA的快速纯化[J]. 朱德华. 河南科技大学学报(医学版). 2003