【摘要】目的：通过使用痛泻药方组方治疗溃疡性结肠炎大鼠模型探讨痛泻药方治疗溃疡性结肠炎的效果以及药理机制。方法：使用2,4-二硝基氯苯滴背法制备溃疡性结肠炎大鼠模型。将大鼠随机分为五组：空白对照组、模型对照组、痛泻药方灌肠组、痛泻药方灌胃组和灌胃灌肠联合治疗组。采用双抗夹心ELISA法检测参与该疾病形成的主要促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-a，抑炎因子IL-4的水平，并观察促炎因子和抑炎因子升降趋势和总体比例。结果：模型组结肠损伤指数明显升高，经治疗后结肠损伤指数明显降低。各治疗组血清IL-4明显升高，IL-1β、IL-6、TNF-a则明显降低，联合治疗组IL-4、IL-1β、IL-6、TNF-a的变化与单独治疗组比较有显著差异。结论：中药痛泻药方灌胃加灌肠联合治疗对于溃疡性结肠炎具有较好的治疗效果。
【关键词】痛泻药方；溃疡性结肠炎；实验研究
【中图分类号】R243 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2016）35-0159-02
溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis，UC）是一种原因不明的慢性直肠和结肠炎性疾病，病变主要位于结肠的黏膜层，以溃疡为主，多累及直肠和远端结肠，也可遍及整个结肠[1]。临床症状轻重不一，可能有缓解与发作相交替的情况，患者可以单独具有结肠症状，或者伴随发生全身症状。现代治疗UC多采用5-氨基水杨酸、类固醇类激素合并一些免疫调节抑制剂如(咪唑疏嘌呤和6-疏嘌呤)联合使用，虽然有一定的效果，但是同时具有腹泻、腹部绞痛、腹痛伴发烧和高血压等严重的副作用[2]，痛泻药方是当前治疗溃疡性结肠炎的临床常用方剂，具有愈后不复发，无副作用等特点。
痛泻药方主要由白术，白芍，陈皮，防风组成，其中白术为君药，起健脾和中，补脾益气的作用。白芍为臣药，起抑肝补脾的作用。陈皮为佐药，起理气燥湿的作用。防风为佐药和使药，起止湿祛风的作用，临床将痛泻药方用于治疗肝郁脾虚型UC[3]。痛泻药方治疗溃疡性结肠炎疗效确切[4]，但是在动物实验上的疗效和机理不清，特别是临床常用口服加灌肠治疗溃疡性结肠炎尚缺乏实验基础。故本次研究从抗炎及抗粘膜损伤机制角度对痛泻药方复合疗法治疗溃结的疗效和机理进行初步探讨。
1.资料与方法
1.1 实验材料
SPF级雄性Wistar大鼠，200±10g，共50只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2012-0001。动物常规饲养，适应环境一周后，随机分为5组：空白对照组：将造模所用试剂换成生理盐水；模型对照组：造模后给予生理盐水；灌肠组采用痛泻药方进行灌肠，灌胃组则采用痛泻药方灌胃，联合治疗组则是灌胃和灌肠组联合治疗。连续给药四周。
1.2 药物与试剂
痛泻药方成分重量比例：白术：白芍：陈皮：防风=2：1：3：1，分别取白术200g，白芍100g，陈皮300g，防风100g，加入500mL 75%乙醇回流3次，2h/次，得醇提取液，将醇提取液减压浓缩，浓缩液干燥，粉碎得粉末，将粉末称重，使用挥发油溶解成原始浓度，使用时稀释成按人和大鼠体表面积换算低剂量2.16 g/（kg·d），高剂量 9.12g/(kg.d)。2,4-二硝基氯苯购自于石家庄莫高化学试剂有限公司。IL-4、IL-1β、IL-6、TNF-a试剂盒购自上海轩昊科技有限公司。其余均为分析纯。
1.3 实验方法
1.3.1造模方法：使用2,4-二硝基氯苯滴背法来制备溃疡性结肠炎的大鼠模型，每天每鼠用2%的2,4-二硝基氯苯丙酮液滴背一次，每次6滴/只，连用20天导致大鼠发生过敏反应之后停止用药，一天后每日向大鼠肛内6厘米处的结肠粘膜灌注0.45%的2,4-二硝基氯苯丙酮液，每次每鼠0.25ml连续灌肠5天。以结肠损伤指数判断造模是否成功。
给药处理2周后大鼠眼球取血2mL置于抗凝管中，4℃保存备用。眼球取血后将大鼠处死，剪开腹腔，取肛门向上2cm的8cm结肠，剪开结肠，使用生理盐水清洗，使用10%福尔马林固定，肉眼观察结肠组织大体形态，进行损伤程度评估，损伤程度评估标准参照Luketal损伤评分标准，如下：0分：结肠肠腔表面无损伤；1分：结肠肠腔表面局部有充血或水肿，但无溃疡；2分：肠腔充血增厚但无溃疡；3分：有1处溃疡且直径小于1cm；4分：有多处溃疡且溃疡直径在1～2cm，肠管与周围组织无粘连；5分：有多处溃疡且溃疡直径1～2cm，肠管与周围组织粘连。
1.3.2标本采集 在造模完成以后，禁食24小时，将各组中大鼠抽取动脉血4～6ml，置于预先标记好的试管中做LI-4、IL-1β、IL-6、TNF-a检测并记录相关的数据。治疗满4周后，禁食24小时，各组均抽取动脉血4-6ml，置于预先标记好的试管中做LI-4、IL-1β、IL-6、TNF-a检测并记录相关数据。
1.3.3检测方法 采用双抗夹心ELISA法检测参与该疾病形成的主要促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-a的水平，抑炎因子IL-4的水平，并观察促炎因子和抑炎因子升降趋势和总体比例，为药物治疗该疾病在纠正细胞因子网络失衡机制上提供相应证据。
2.结果
2.1 一般情况及结肠损伤指数评分
正常对照组大鼠的活动敏捷，毛发光亮，饮食量较其他组大，体态正常，大便颗粒状，肛周洁净。而其他四组大鼠的精神较萎靡，毛发松散无光泽，食量较少，形态消瘦，大便泄泻，肛周污秽。造模组大鼠损伤评分明显高于对照组，说明造模较为成功；治疗组损伤评分明显低于造模组，联合治疗组损伤评分明显低于单独治疗组，且差异有统计学意义（表1）。
表1 各组大鼠结肠黏膜损伤评分情况
注：△与空白对照组比较P<0.05；*与模型对照组比较P<0.05；**与模型对照组比较P<0.01
2.2 血清炎症因子变化
造模后，四组造模动物相对于正常对照组LI-4、IL-1β、IL-6、TNF-a均具有显著差异（P＜0.05）；对于治疗组，治疗后血清中IL-4明显升高，IL-1β、IL-6、TNF-a明显降低，而联合治疗组的变化与单独治疗组相比较有显著差异（表2）。
3.讨论
迄今为止，溃疡性结肠炎的病因和发病机制仍未完全明确，临床缺乏特异性的治疗药物。我国炎症性肠病协作组结合国外处理指南，发表了国人新的炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见。当前国内外对UC的治疗方案基本一致，主要包括传统化学制剂氨基水杨酸类、激素和免疫抑制剂和新发展的生物制剂[5]。虽然近年在氨基水杨酸和激素类有众多新药问世，治疗方法也不断增多，但资料显示，UC治疗的有效率近20年无明显差异[6]。究其原因，这些药物主要在减少副作用，改变输送方式，选择作用部位上有所改变，但药物作用的成分5-ASA和激素没有改变。因此寻找先进、合理、科学、优化的治疗方案，规范UC的治疗是当前的主要任务。痛泻药方是当前治疗溃疡性结肠炎的临床常用方剂，具有愈后不复发，无副作用等特点，但是在动物实验上的疗效和机理不清，特别是临床常用口服加灌肠治疗溃疡性结肠炎尚缺乏实验基础。
研究表明CD4+T细胞的功能异常比CD8+T细胞在UC发生过程中更为重要。当受到外源抗原攻击时，T细胞亚群中某一亚群功能增强，另一亚群功能减弱，进而引起亚群间比例紊乱，免疫调节功能异常，导致炎症细胞和炎症介质异常，从而造成肠粘膜组织损伤，这可能是UC的致病机制。UC动物模型研究也证实，其病因主要是CD4+T细胞移行至结肠，这种移行通过T细胞特异识别肠道细菌启动炎症反应，病症特点是机体T细胞、巨噬细胞及中性粒细胞数量增多，结肠T细胞数量增多，同时伴随炎症分子诸如IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α及IFN-γ等分泌增多[7]。辅助性T细胞为CD4+T细胞，根据其功能和产生的细胞因子种类不同，可分为Th1和Th2。前者调节细胞免疫应答并分泌IL-2、IL-12、TNF-α和IFN-γ。后者调节体液免疫应答并分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13。
白细胞介素是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子。其免疫反应的表达和调节，有来源于淋巴细胞或巨噬细胞等许多因子参与[8]。来源于淋巴细胞的有淋巴细胞活素，来源于巨噬细胞的总称为monokine，其中的各个因子的生物活性各有不同（例如巨噬细胞活化，促进T细胞繁殖等），因子自身的物理化学性质多不清楚[9]。IL-4是一种重要的抗炎症性细胞因子，在溃疡性结肠炎发病过程中有重要作用[5]。IL-1β、IL-6、TNF-a是炎性肠病最常见的致炎因子。以往认为溃疡性结肠炎的炎症反应以IL-4介导为主，它能显著抑制促炎症性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-a的功能，还可抑制淋巴细胞及巨噬细胞的增殖及迁移等。细胞因子作用于机体具有一定的整体性，IL-4也是通过细胞因子网络而发挥作用。在与溃疡性结肠炎有关的细胞因子群中，IL-4、IL-1β、IL-6、TNF-a是溃疡性结肠炎症反应的关键[10]。
本研究发现，治疗后模型IL-4明显升高，而IL-1β、IL-6、TNF-a则明显降低。联合治疗组IL-4、IL-1β、IL-6、TNF-a变化与单独治疗组相比较有显著性的差异。由此可见，痛泻药方对于溃疡性结肠炎具有较好的治疗效果。该组方对溃疡性结肠炎的作用机理可能包括：使血清抑炎因子IL-4的含量升高以及使促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-a的水平下降,从而抑制炎症细胞因子的活性,使该疾病得到有效的控制。本研究从模型动物层面证实痛泻药方灌肠加口服复合疗法能有效治疗大鼠溃疡性结肠炎，这为下一步研究其药效学机制奠定了基础。
【参考文献】
[1] Ordas I,Eckmann L,Talamini M,et al.Ulcerative colitis[J].Lancet,2012,380(9853):1606-1619.
[2] Sakthivel KM,Guruvayoorappan C.Amentoflavone inhibits iNOS,COX-2 expression and modulates cytokine profile,NF-kappaB signal transduction pathways in rats with ulcerative colitis[J].Int Immunopharmacol,2013, 17(3):907-916.
[3]佥艳.陆金根教授治疗溃疡性结肠炎经验[J].四川中医,2012,30(3):10.
论文作者:侯继东,许金彪,李辉
论文发表刊物:《心理医生》2016年35期
论文发表时间:2017/3/8
标签：溃疡性论文; 结肠论文; 泻药论文; 结肠炎论文; 因子论文; 灌肠论文; 细胞因子论文; 《心理医生》2016年35期论文;