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摘要：
CRISPR-Cas起源于细菌用来切除外来病毒基因的免疫功能，由一个成簇规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)和附属的蛋白质(Cas)组成，是近几年来比较热门的一种基因编辑手段。在这之前还有第一代“锌指核酸内切酶（ZFN）”、第二代“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”。通过Cas系统中编码的蛋白质的鉴定和序列分析，可将 Cas蛋白归并为45个蛋白家族，Cas9蛋白是其中发现到的最精准且操作最为简单的，这种复合物可以在guide RNA的指导下对特定的DNA序列进行切除。对此，本文利用了CPT1A基因进行了对于CRISPR-Cas9技术效率的检验，并将对实验过程、所需仪器、实验现象与结果等进行综述，并根据结果进行原因分析，进一步提高CRISPR-Cas9的编辑效率。
关键词：CRISPR；Cas9；基因组编辑；CPT1A基因。
1.引言
本实验进行了CRISPR/Cas9技术对特定基因编辑效率的研究。本研究中选用的靶基因是CPT1A，与线粒体的脂肪酸代谢有关，是代谢途径中的限速酶。
为了确定CRISPR/Cas9对于CPT1A基因的编辑效率，需要将CRISPR/Cas9所需的向导RNA和Cas9蛋白以及CPT1A转入细胞内，从而使得基因编辑得以发生
2. 正文
2.1 实验原理
CRISPR-Cas起源于细菌用来切除外来病毒基因的免疫功能。CRISPR会转录出入侵病毒的DNA，形成复合物，切割外源DNA使其无法表达。后发现CRISPR对其他DNA的切除也有效，经过筛选和实验发现CRISPR-Cas9是其中操作较为简单，更适合人体的基因序列。CRISPR-Cas9的基因序列中包含前导区、重复序列区、间隔区。前导区类似于启动子，重复序列区和间隔区交叉出现，间隔区则为插入的外源DNA，转录后用于识别外源DNA。实际操作中，pre-crRNA被转录后，被cas蛋白处理后形成crRNA后直接与转录后形成的trancRNA直接进行连接，连同cas蛋白一同转入目的细胞。通常为了稳定性与持续性会转入DNA而非RNA或蛋白。因为前期我们需要将guide RNA的序列连在质粒上，连同含有cas9蛋白DNA的质粒一同转入。
识别靶基因后，cas9蛋白会通过RuvC和HNH两个位点进行切割，DSB触发HR（同源重组）或NHEJ（非同源末端连接）两种修复模式来编辑基因。
为了使本实验的结果更加明显，实验中需要进行样本细胞的转染实验，进行扩增，从而获得大量目的DNA片段。之后进行的细胞转染则是将外源遗传物质(CPT1A与guide RNA的载体)转入细胞，从而触发基因修复机制，NHEJ，连接绿色荧光蛋白(GFP)基因，在荧光显微镜下可以呈现荧光。
2.2.1 实验仪器
移液枪、离心机、离心管、PCR仪、琼脂糖凝胶模具、量筒、凝胶成像仪、锥形瓶、水浴锅、浓度测量仪、电泳仪、收集管HiPure DNA Column、恒温培养箱、超净工作台、电子秤、称量纸、摇菌管、摇床、培养皿、水浴锅、光学显微镜（荧光显微镜）、震荡仪、除菌仪、漩涡混合仪
2.2.2 实验试剂
H8基因组（682.8 ng/μL)、2xU universal Hot Start High-Fidelity PCR mix、Primer-F/R、无菌水 (去离子水)、缓冲液 GDP (buffer GDP)、缓冲液 BW2(buffer BW2)、洗脱液 (elution buffer)、HiPure DNA微柱 (micro columns)、核酸染料 (gel red)、琼脂糖 (agarose)、LB培养基 (无抗&有抗)、Buffer P1/RNase A混合液、Buffer P2、Buffer NP3、Buffer PW1、Buffer PW2（已用无水乙醇稀释过）
2.3 实验过程
2.3.1 CPT1A引物以H8P56基因组做为模版进行PCR反应
CPT1A，PCAG-EGXXFP，PX459质粒酶切，酶切质粒胶回收
首先依次使用移液枪吸取5μL2xU universal Hot Start High-Fidelity PCR mix，3.5μL的去离子水，0.5μL的Primer-F/R及0.5μL，浓度为682.8/μL的H8基因组至离心管。过程中可以使用抢头轻微敲打离心管。将含有混合溶液的离心管放入离心机中，充分混合。然后将离心管放入PCR热循环仪中，先设置温度为95°C左右变性，在设置成60°C左右互补配对，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72度左右），35个循环为一个流程。
先配置合适浓度的琼脂糖凝胶，80V电压电泳20min分离DNA片段。取出凝胶，放入凝胶成像仪，在紫外灯下观察。用刀片小心切出含有目的片段的凝胶部分 (发光部分)。将凝胶块转移至1.5mL离心管中，加入等倍缓冲液 GDP（buffer GDP），55°C左右水浴10min，待凝胶块完全溶解。短暂离心收集液滴置入HiPure DNA column中，外套入2mL收集管，12000xg离心60s。倒弃滤液，将剩余液体转移至柱子中，套上收集管，12000xg离心60s。倒弃滤液，将柱子套回收集管中，加入300μL缓冲液GDP于柱子中，静置一分钟，12000xg离心60s。倒弃滤液，将柱子套回收集管中，加入用无水乙醇稀释过的600μL缓冲液 DW2，12000xg离心60s，重复两次。倒弃滤液，将柱子套回收集管中，12000xg离心120s。将柱子套入1.5mL离心管中，加入洗脱液（elution buffer）至柱子膜中央。静置2分钟，12000xg离心60s。丢弃柱子，将DNA保存于-20°C环境下。
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2.3.2 靶基因与 PCAG-EGxxFP 载体、guide RNA 退火引物与 pX459 载体 Solution I 连接，平板涂布转化。
根据表在锥形瓶中配置140mL的营养液供大肠杆菌生长（加入NaCl，酵母等）。进行除菌处理。在两个离心管中分别加上CPT1A-g1-F/R, pCAG-EGxxFP载体与Solution I, 和PCGF6-g1-F/R, pX459载体与 Solution I。静置30min，等待分子连接。在冰浴?，分别把两个链接好的DNA溶液加?到大肠杆菌中，经过20min冰浴。将两个离心管放入42 ?C的环境当中热激1min，随后再冰浴5min。加?200μL无抗性的LB培养基，在37 ?C的环境下静置45min左右。使用接种环涂版，并在 37 ?C环境下倒置培养。
2.3.3 挑单菌落，进行菌落PCR鉴定。摇菌扩增。细胞培养基配制，传代，铺板。293T细胞消化，计数，铺板。从菌液中提取目的质粒，目的质粒转化细胞。
在离心管中加入20μL 的无菌水。取菌板，挑取一个单菌落，置于20μL的无菌水中，吹打混匀。取1μL 放入离心管作为模板进行菌落PCR鉴定。依次用移液枪加入5μL的2x PCR mix，3μL的无菌水及1μL Primer-F/R。剩余菌液补加200μL抗性LB溶液，37 ?C摇菌。配置琼脂糖凝胶，将菌落PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。 将细菌放在已经加入LB培养液的培养基中，加入抗生素。进行大提摇菌过夜（37 ?C，220rpm）。
细菌摇床后，10000x g 离心1min，收集1.5mL菌体。倒弃培养基，加入250μL Buffer P1/RNase A混合液，高速涡旋重悬细胞直到彻底看不到细菌团块。往重悬液中加入250μL Buffer P2，轻轻颠倒混匀8～10次（要小心力度，涡旋会引起基因组DNA污染）。加入350μL Buffer NP3，立即颠倒8～10次让溶液彻底中和（一定要迅速，否则沉淀会团聚影响中和效果）。13,000 x g 离心1min，20～25 ?C。将HiPure DNA Mini Column II 装在收集管中，上清液倒入柱子中。13,000 x g 离心30～60s。倒弃滤液，将柱子套回收集管中。加入500μL Buffer PW1至柱子中，13,000 x g 离心30～60s。倒弃滤液，将柱子套回收集管中。加入600μL Buffer PW2（已用无水乙醇稀释）至柱子中，13,000 x g 离心30～60s。重复一遍上述过程。倒弃滤液，把柱子套回收集管中。13,000 x g 离心1min，干燥柱子。将柱子套在灭菌的1.5mL离心管中，加入30μL 去离子水至柱子的膜中央。静置一min, 13,000 x g 离心1min洗脱DNA。弃去柱子，将质粒保存于-20 ?C的环境中。
从培养板中抽出培养基，加入预先混好的质粒/转染试剂/培养基的溶液。放入培养箱中培养，6h后补充培养基。（37 ?C）
2.3.2 注意事项
1）将琼脂糖溶液倒入制胶器中时要把气泡赶到边缘处。
2）离心机要注意配平，否则可能会有安全隐患。
3）将洗脱液（elution buffer）加入至柱子膜中央时要注意枪头不能戳到柱子膜。
4）要使用的基因与载体的比例大概是1:7/mol。
5）将溶液加入大肠杆菌中要注意温度，不能离开冰浴太久。
6）打菌时要注意和水混合完全。
7）将液体注射至凝胶样品孔处时要注意是否对准，否则实验将会没有结果。
8）高速涡旋重悬细胞对于产量来说十分关键。
9）将Elution Buffer 至柱子的膜中央时，枪头不要戳到柱子膜。
2.4 实验结果与分析
最终将质粒倒入293T细胞后，两种质粒在细胞中被表达，CRISPR-Cas9体系建立，开始对目标基因进行编辑。目的基因被切断后会自动触发修复机制，若触发了非同源末端连接(NHEJ)，将断链两端直接连接，则绿色荧光蛋白(GFP)的基因可以连接完整。通过此方法，在荧光显微镜下可以直接观察出细胞是否编辑成功。
实验中我们采用了三种使用不同试剂的对照组，第一组为阴性对照，内含有的CPT1A基因并没有被切割过，所以在荧光显微镜下不呈像。第三组为阳性对照，只加入了GFP，所有细胞全部产生荧光，证明GFP在细胞中可以正常表达。第二组为实验组，根据图像，部分细胞发出荧光，则表示另一部分编辑失败。
通过分析，第一种造成实验失败的原因可能是因为向导RNA(guide RNA)的脱靶现象，可以是由于基因链上除目的基因片段之外的部分还有含有与靶基因序列相同的片段，或是因为向导RNA的错配而导致。第二种则是我们所出发的NHEJ细胞修复机制并没有按照我们所需要的直接连接而修复，而是造成了基因链上部分基因的敲除或增加，从而导致了GFP的基因不能正确表达，发出荧光。
3.参考文献
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[3]郑小梅, 张晓立, 于建东, 郑 平, 孙际宾. CRISPR-Cas9 介导的基因组编辑技术的研究进展 [J].生物技术进展 2015, 5 ( 1 ):1 -9
[4]贾良杰 .CRISPR/Cas 基因组靶向编辑技术综述 [J].中国医药导报, 201408, 11(22):154-164
论文作者:夏凡
论文发表刊物:《科技新时代》2019年3期
论文发表时间:2019/5/8
标签：基因论文; 柱子论文; 质粒论文; 凝胶论文; 细胞论文; 离心管论文; 培养基论文; 《科技新时代》2019年3期论文;