（广西医科大学 广西南宁 530021）
【摘要】目的：探究蜂毒素与沉默组织蛋白酶S（CTSS）对于MHCC97H细胞增殖、凋亡的影响。方法：通过制备的沉默CTSS的MHCC97-H细胞株（沉默CTSS的细胞株用PLVT1150表示，正常表CTSS的细胞株用PLVT8表示）,使用不同浓度蜂毒素干预2组细胞30min，后流式细胞仪检测细胞凋亡率,重复三次。制作沉默CTSS的MHCC97-H裸鼠皮下荷瘤模型，使用80μg/（kg*day）蜂毒素干预，对照组予以PBS代替。观察裸鼠移植肿瘤生长的状况，记录肿瘤生长情况。免疫组化检测caspase3，cleved-caspase3在裸鼠荷瘤模型中的表达。结果：用流式细胞仪检测各组凋亡率，PLVT1150细胞凋亡率依次为18.87%、36.72%、52.98%，PLVT8凋亡率依次为4.27%、15.32%、28.86%，进行两两比较，P<0.05。比较裸鼠皮下移植瘤发现第1组（PLVT1150+PBS）与第2组（PLVT1150+蜂毒素）比较、第3组（PLVT8+PBS）与第4组（PLVT8+蜂毒素）比较，裸鼠荷瘤体积在第14天出现统计学差异；第2组与第4组比较在第22天出现统计学差异；第1组与第4组比较，在第31天出现统计学差异。在裸鼠肿瘤组织切片的免疫组化实验中检测到4组Caspase-3阳性表达率依次为40%、20%、80%、40%，进行灰度值比较：1组与2组相比，P<0.05；3组与4组相比，P<0.05. Cleved-caspase-3阳性表达率分别为40%，80%，20%，60%，灰度值比较：1组与2组相比，P<0.05；3组与4组相比，P<0.05。结论：沉默CTSS促进MHCC97-H细胞凋亡，蜂毒素与沉默CTSS引起的MHCC97-H细胞凋亡有协同作用，蜂毒素有可能为肝细胞癌生物学治疗的新研究方向。
【关键词】原发性肝癌；组织蛋白酶S；裸鼠模型；蜂毒素
【中图分类号】R730.5 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2016）21-0051-03
THE INFLUNCE OF MELITTIN AND SILENCING CATHEPSIN S ON MHCC97-H CELL
Yu Guotang Xu Jing(Guangxi Medical University,Nanning 530021,China
【Abstract】Objective Inquiry the influences of melittin and silence Cathepsin S (CTSS) to MHCC97H cell for cell proliferation and apoptosis.Methods Prepared by the silence CTSS MHCC97H cell lines(Silence CTSS cell lines marked PLVT1150, normal cell lines wich expressing CTSS marked PLVT8),Using different concentrations of melittin intervention two cell lines,then two groups cell apoptosis was detected by flow cytometry.Then the silence CTSS MHCC97-H tumor-bearing nude mice model was made. Experimental groups of nude micetreated with melittin 80μg / (kg * day), the control group was treated with PBS instead.Observe and record the growth of tumor in nude mice.Use immunohistochemistry to detect caspase-3, cleved-caspase-3 expression in tumors.Result We detected PLVT8 and PLVT1150 cells's apoptosis after melittin（0,4,8ug/ml）intervention 30 minutes by flow cytometry. The experiment was repeated 3 times,the results were expressed as x±s. After melittin（0,4,8 ug / ml）intervention the two cells group apoptosis rate were (PLVT1150:18.9%±2.1,36.7%±2.2,53.0%±1.5;PLVT8:4.27%,15.32%,28.86%).The same concentration of cells group were statistically analyzed, P <0.05.Through the observation of nude mice, we found that compared with group 1 (PLVT1150 + PBS), group 2 (PLVT1150 + melittin) tumor-bearing nude mice volume appeared larger statistical difference at day 14,the same as group 4（PLVT8+melittin）to group 3(PLVT8+PBS).P<0.05;compared with group2, group4 tumor-bearing nude mice volume appeared larger statistical difference at day22,P<0.05 and group1 to group 4 appeared larger statistical difference at day 31,P<0.05.We detect the 4 groups caspase-3 expression in tumor by immunohistochemistry experiments found that 4 groups Caspase-3 positive expression rate were 40%,20%, 80%, 40%,through comparison of the gray value: group 1 compared with group 2, P <0.05; group 3 compared with 4 group, P <0.05.The 4 groups cleved-caspase-3 positive expression rate were 40%,80%,20%,60%,through comparison of the gray value: group 1 compared with group 2, P <0.05; group 3 compared with 4 group, P <0.05.Conclusion Lentiviral-mediated silencing CTSS promote MHCC97-H apoptosis,and melittin can promote apoptosis of MHCC97-H cell after silence CTSS;Combined silence CTSS and melittin treatment may add a new research direction for biological treatment of hepatocellular carcinoma.
【Key words】Hepatic carcinoma;Cathepsins;Nude mouse model;Melittin
原发性肝癌(Pmary liver cancer)属于世界上是常见的5大肿瘤之一，其中肝细胞肝癌（HCC）所占比列大于90%[1-2]。在我国原发性肝癌发病率高并逐年增加、发病年龄年轻化，位居恶性肿瘤死亡率的第3位[3]，大约占全球一切死亡原因的1%[4-5]。组织蛋白酶S（CTSS）参与细胞生长因子的分泌、体内血管增生调控以及能介导细胞外基质降解，提示 CTSS与肿瘤血管形成和肿瘤转移相关。CTSS在原发性肝癌、胃癌等高表达。蜂毒素（Melittin）又称蜂毒溶血肽[6]，是天然的抗癌物质，在抗癌方面的研究中取得较大进展。如蜂毒素能够促进胃腺癌SGC-7901细胞、肝癌细胞SMMC7721的凋亡并抑制其增殖[7]。研究证明，Melittin与沉默CTSS都具有抗肿瘤作用，而两者抗肿瘤之间可能存在协同关系。本研究旨在通过实验验证蜂毒素与沉默组织蛋白酶S在抗肿瘤方面的作用以及二者是否有协同作用。
1.材料和方法
1.1 实验细胞
人高转移肝癌细胞MHCC97H细胞来源于复旦大学中山医院肝癌研究所，沉默组织蛋白酶S的MHCC97H稳定细胞株由本课题组前一部分实验构建完成。
1.2 实验动物
BalB/C雌性裸鼠20只，4～6周龄，体重16～20g，合格号：SCXK桂 2009-0002
1.3 主要试剂
蜂毒素购买于Santa Cruz公司，免疫组化试剂盒来源于北京中杉金桥公司，Caspase-3兔抗人一抗、Cleved-Caspase-3兔抗人一抗来源于Cell Signaling TechNology 公司，
1.4 实验方法
1.4.1流式细胞仪检测凋亡率 培养细胞，并接种于六孔板。在细胞对数期进行蜂毒素干预试验，30min，浓度为0、4、8ug/ml。制备细胞悬液，分别加入流式管中1200rpm离心5min，弃上清。稀释并滴加Annexin V静置10分钟。加入PI染液混匀，5uL/管。使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
1.4.2裸鼠动物模型建立及处理 取对数期PLVT8、PLVT1150细胞，制备细胞悬液，调整浓度为1×108/ml。消毒后，使用一次性1mL无菌注射器将细胞悬液注射入裸鼠的右侧腋背部皮下，每只裸鼠注射0.1ml。7天后，成瘤率100%。采用随机数字表法把裸鼠分为4组，5只/组，第1组：MHCC97H-PLVT1150+PBS、第2组：MHCC97H-PLVT1150+蜂毒素、第3组：MHCC97H-PLVT8+PBS、第4组：MHCC97H-PLVT8+蜂毒素。第7天开始，每天对蜂毒素干预组以蜂毒素80μg/（kg*day）从鼠尾静脉注入，对于PBS组以PBS液代替，连续24天，记录肿瘤体积大小变化。
1.4.3免疫组化
1.4.3.1免疫组化染色的步骤 切片脱蜡水化，高压修复抗原30min，山羊血清封闭20min，滴加Cleved-Caspase-3和Caspase-3抗体，4℃保存过夜，羊抗兔二抗37℃孵育1h，DAB 显色1min，苏木素复染，透明，干燥，封片。以PBS缓冲液代替一抗作阴性对照，用已知的阳性切片作阳性对照。
1.4.3.2免疫组化实验结果评价 由三位病理科医生进行免疫组化阅片，根据 Fromowitz的综合计分法进行结果评估。通过高倍镜观察：⑴阳性程度的判定：无着色0分；淡黄1分；棕黄2分；棕褐3分。⑵阳性范围判定：着色5～25%为1分；着色26～50%为2分；着色51～75%为3分；着色76%～100%为4分。把两结果相加：<2分阴性（－）；2～3分者为弱阳性（+）；4～5分中度阳性（++）；6～7分强阳性（+++）。
1.4.4采用SPSS 19.0统计软件进行相关数据分析和处理。计数资料的比较用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1 蜂毒素干预下流式细胞仪检测MHCC97H细胞凋亡结果
PLVT1150细胞凋亡率分别为18.87%、36.72%、52.98%,PLVT8凋亡率分别为4.27%、15.32%、28.86%。见下图1。使用卡方检验统计，进行两两比较，均为P<0.05,有显著统计学差异。
在裸鼠肿瘤组织切片的免疫组化实验中检测到4组Caspase-3阳性表达率依次为40%、20%、80%、40%，灰度值（x-±s）分别为179.61±4.37、201.73±7.17、156.19± 5.31、189.52±6.49，进行灰度值比较：1（Plvt1150+PBS）组与2（Plvt1150+蜂毒素）组相比，P<0.05；3（Plvt8+PBS）组与4（Plvt8+蜂毒素）组相比，P<0.05；Cleved-caspase-3阳性表达率分别为40%，80%，20%，60%，灰度值分别为179.63±5.85、161.12±6.01、194.13±5.50、174.51±6.33灰度值比较：1组与2组相比，P<0.05；3组与4组相比，P<0.05。
图5
A：Caspase-3灰度值比较PLVT1150+PBS(1)与PLVT1150+蜂毒素(2)组相比，P<0.05；2、PLVT8+PBS(3)与PLVT8+蜂毒素(4)相比，P<0.05. B：Cleved-caspase-3灰度值比较PLVT1150+PBS(1)与PLVT1150+蜂毒素(2)组相比，P<0.05；2、PLVT8+PBS(3)与PLVT8+蜂毒素(4)相比，P<0.05.
3.讨论
研究表明组织蛋白酶S在各种恶性肿瘤中高表达，具有促进肿瘤滋养血管生成的作用。而蜂毒素是天然的抗癌物质。研究表明，蜂毒素与组织蛋白酶S间在抗肿瘤方面存在着协同作用。董小锋[8]等人在研究中发现，沉默CTSS后肿瘤细胞Bax、Fas-L表达上调，Bcl-2表达降低。Bcl-2能抑制肿瘤细胞凋亡，而Bax具有拮抗Bcl-2的作用，通过增加线粒体通透性，从而使得caspase-3的活化增加，最终促进肿瘤细胞的凋亡。Fas-L与细胞膜上蛋白受体结合后，通过级联反应，激活caspase-3的上游调控蛋白，激活caspase-3，促进细胞凋亡。国外研究表明[9]，蜂毒素也能够下调BCL-2的表达，并激活caspase-3诱导U937细胞凋亡。研究表明[10]沉默CTSS后，NF-κB活化减少，总量不变。活化的NF-κB可进入细胞核于DNA结合，激活、诱导抗凋亡基因的转录达到抗肿瘤细胞凋亡促作用，从而可以抑制肿瘤细胞凋亡。根据李曙光的研究[11]，蜂毒素单体能够抑制TAKI介导的NF-κB的活化诱导肝癌细胞凋亡。实验结果显示，沉默CTSS+蜂毒素组的细胞凋亡及肿瘤生长抑制情况明显高于正常表达CTSS组以及单独沉默CTSS组，提示蜂毒素与沉默CTSS可能具有协同效应。
蜂毒素是天然的抗癌物质，已经拥有大量基础研究，现需进一步临床研究以期用于临床抗癌一线。组织蛋白酶S在肿瘤凋亡调节中有重大作用。
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论文作者:余国堂,徐静（通讯作者）
论文发表刊物:《心理医生》2016年21期
论文发表时间:2016/11/3
标签：蜂毒论文; 细胞论文; 凋亡论文; 肿瘤论文; 肝癌论文; 蛋白酶论文; 阳性论文; 《心理医生》2016年21期论文;