杨金凤
中南民族大学 430074
【摘 要】阿尔茨海默症又称老年痴呆症，是一种不可逆的中枢神经系统退行性疾病。抗老年痴呆药物多奈哌齐可改善病人的记忆力减退和认知障碍等症状。BK通道是大电导钙激活钾通道，具有调节兴奋及保护神经细胞的作用。本实验通过多奈哌齐对BK通道的作用的初步研究，为进一步探索抗老年痴呆药物的药理性质提供依据。
【关键词】BK通道；阿尔茨海默症；多奈哌齐
1 前言
BK通道是大电导钙激活钾通道，其α亚基可以单独聚合形成四聚体，成为具有功能性的离子通道。一般由不同种类的β亚基与α亚基聚合成四聚体蛋白共同构成BK通道，辅助其在不同组织细胞中发挥作用[1]。BK通道α亚基几乎在所有哺乳动物组织中表达[2]，参与多种生理与病理的活动，如动作电位复极化，细胞增殖，癫痫等。
阿尔茨海默症又称老年痴呆症，是一种中枢神经系统退行性疾病，临床表现为记忆力减退、认知障碍等。其病理机制是β淀粉样蛋白（Aβ）在大脑皮层和海马区域沉积，导致神经纤维缠节以及神经递质异常，使大量神经元丢失，破坏了大脑功能出现痴呆症状 [3]。
广泛用于治疗阿尔茨海默症（AD）的多奈哌齐是乙酰胆碱酶抑制剂。它可阻滞神经突触中ACh的水解，恢复胆碱能神经传导，从而改善病人症状。
有研究报道，AChE抑制剂能够影响中枢神经元钾通道，来协同其AChE抑制剂的作用[3]，如多奈哌齐可抑制多种钾离子通道电流，如hERG通道等。但目前还没有多奈哌齐对BK通道的文献报道。我们使用膜片钳技术初探多奈哌齐对表达在HER293细胞上BK通道电流的作用，从而拓展多奈哌齐的药理作用。
2 实验方法
2.1 细胞培养和BK通道质粒的转染
HEK293细胞培养所需培养基由高糖培养基（DMEM）和10%胎牛血清配制而成，并加入1%的青霉素和链霉素。质粒和lip2000分别用50μl Optim-MEM稀释，室温放置5分钟后将两者混合。20分钟后，将100μl混合液加入已种细胞的24孔板中。培养箱中放置4h后换成普通培养基。细胞培养24-48h后用于膜片钳实验。
2.2 电生理实验
使用全细胞膜片钳技术记录多奈哌齐对BK通道电流的效应。细胞浴液（以mM记）包含：75 Na-gluconate，70 NaCl，5 KCl，5 HEPES，5 glucose，PH值使用NaOH调到7.4。电极内液（以mM记）包含：150 KCl，5 HEPES，5 EGTA，5 Gluc-
ose，5 Na2ATP，PH值使用KOH调到7.3。将转染了BK通道质粒的HEK293细胞放置在显微镜下，选择带有荧光的细胞进行实验。
2.3 数据分析
Clampex软件记录实验数据，Clamfit软件分析数据，Oringin 7.5软件绘图。实验数据分析结果均以mean±SE表示，对实验数据进行t检验，以P<0.05作为显著性的判断标准。
3 实验结果
我们检测多奈哌齐是否能够作用于BK通道的全细胞电流。实验刺激方案是从-60mV至+160mV持续250ms的阶跃电压刺激，钳制电压为-80mV。记录电流得到图3A，可以看到80μM多奈哌齐可抑制BK通道电流。图3B是I-V曲线，在160mV处，80μM多奈哌齐对BK通道电流的抑制率为40%，且统计学上具有显著性差异。
我们知道BK通道电流具有电压依赖性和钙离子敏感性的特点，所以接下来探索，在Ca2+存在时，80μM多奈哌齐对BK通道的抑制是否会有所增加。图3C是电极内液和细胞外液中加入了10μM Ca2+后的I-V曲线，可以看出电流幅值没有明显增大，80μM多奈哌齐对BK通道电流的抑制程度也没有明显增大。
我们查阅文献得知，β亚基辅助BK通道α亚基发挥作用，因此将BK通道α亚基和hβ亚基共转染到HEK293细胞上，记录电流并做I-V曲线分析得到图3D，发现BK通道电流幅值下降，多奈哌齐对电流的抑制率为47.8%，抑制率略有增大，具有统计学差异。
图3 多奈哌齐对BK通道电流的抑制作用
A图表示对照组和给药80μM多奈哌齐后，BK通道在+160mV处的电流波形图，B图表示抑制BK电流的I-V曲线（n=8，p<0.05）。C图表示加入10μMCa2+后，多奈哌齐抑制BK电流的I-V曲线（n=5，p<0.05）。D图表示加入10μM Ca2+，在HEK293细胞上共转染α亚基和hβ亚基条件下，80μM多奈哌齐抑制BK电流的I-V曲线图（n=4，p<0.05）。
4 讨论
多奈哌齐作为一种抗老年痴呆的益智药，可阻滞Ach的水解，抑制胆碱能神经元减少，而其阻滞机制也受到中枢神经元钾通道的协同作用。在脑组织中，BK通道参与胞内的信号转导，具有调节兴奋及保护神经细胞的作用。我们所研究的BK通道可受到β淀粉样蛋白31-35片段的抑制[3]。BK通道与多奈哌齐均参与神经保护，而Aβ又与这两者有着密切的关系，因此研究多奈哌齐对BK通道的作用可以拓展多奈哌齐的药理作用，为我们进一步研究抗老年痴呆药物提供依据。
参考文献：
[1] Salkoff L，Butler A，Ferreira G，Santi C，Wei A.High-conductance potassium channels of the SLO family.Nat Rev Neurosci.2006 Dec；7（12）：921-31.Review.PubMed PMID：17115074.
[2] Ramanathan K，Michael TH，Jiang GJ，Hiel H，Fuchs PA.A molecular mechanism for electrical tuning of cochlear hair cells.Science.1999 Jan 8；283（5399）：215-7.PubMed PMID：9880252.
[3] 张宇.一、β淀粉样蛋白31-35片段对海马CA1神经元BK通道和[Ca2+]_i的影响：全细胞膜片钳和离子荧光成像技术观察 二、Humanin对Aβ31-35抑制大鼠海马神经元BK电流及升高[Ca2+]_i作用的观察 三、I型代谢型谷氨酸受体参与脊髓痛信号传递作用的观察[D].山西医科大学，2007.
论文作者:杨金凤
论文发表刊物:《中国医学人文》(学术版)2018年2月第4期
论文发表时间:2018/7/10
标签：通道论文; 电流论文; 抑制论文; 细胞论文; 作用论文; 神经元论文; 转染论文; 《中国医学人文》(学术版)2018年2月第4期论文;