（湖南省南华大学附属第一医院 421001）
摘要：目的 明确血小板miR-223在伴糖尿病（DM）的缺血性脑卒中（IS）患者中的表达情况及在血小板（PLT）活化中的作用。方法 通过病例对照研究，收集三组病例组病例（单纯DM7例、不伴DM的IS组6例、伴DM的IS组6例）及性别年龄相匹配的正常对照组8例，空腹抽取静脉血，分离和收集PLT；运用流式细胞术测定各组标本PLT活化率，比较各组间PLT活化率差别；提取血小板RNA，实时荧光定量PCR测定各组PLTmiR-223表达量，分别比较各组PLTmiR-223表达是否存在差异。结果 与正常对照组相比，三个病例组PLT活化率均明显增高，具有统计学意义（P＜0.05）；与正常对照组相比较，伴DM的IS组和单纯DM组中PLTmiR-223表达均明显下调，具有统计学意义（P＜0.05）；结论 高糖可能通过下调miR-223的表达，进而上调PLT活化相关靶基因表达，从而促进动脉粥样硬化及动脉血栓形成，增加IS的发病风险。
关键词：缺血性脑卒中；糖尿病；血小板；microRNA
1.前言
IS具有高发病率、高致残率、高死亡率以及高复发率等特点，严重威胁人类生命健康。PLT活化和多种原因引起的血管病变之间可相互促进，共同参与动脉粥样硬化和IS的发生发展。DM是目前IS重要危险因素之一。DM状态下的高血糖、胰岛素缺乏或抵抗、代谢异常、PLT内钙离子内环境紊乱以及氧化应激等使DM患者PLT处于明显活化状态[1]。血小板表面的G蛋白偶联受体P2Y12受体在ADP诱导的PLT不可逆聚集和血栓素A2产生中起至关重要的作用。DM患者血小板P2Y12受体表达显著升高，甚至引起P2Y12拮抗剂氯吡格雷和阿司匹林双重抗PLT药物抵抗。微小RNA是一类非编码RNA，能通过碱基匹配原则识别靶基因mRNA3’非翻译区（3’UTR）靶序列，从而降解靶基因mRNA和（或）抑制翻译，在转录后水平调控特定基因表达，对生物体基因的表达起精细调节作用。最近有研究发现无核血小板中也表达多种miRNAs并可调节PLT的功能，其中miR-223在血小板中含量最为丰富，并通过报告基因实验验证了P2Y12是其靶基因，它表达的蛋白参与血小板激活。Zampetaki等人研究发现，观察人群由健康状态发展为DM过程中血浆miR-223的水平显著低于发病前，而高糖处理巨核细胞后细胞内miR-223表达也显著下调[2]。因此，我们推测糖尿病状态或高糖可通过调控PLTmiR-223的表达，从而影响与PLT功能相关靶基因表达，加速动脉粥样硬化、促进动脉血栓形成，增加IS的发病风险。
2.实验方法
2.1标本收集
收集中南大学湘雅医院2011年12月-2012年2月单纯DM7例、伴DM的IS6例、不伴DM的IS患者6例，均为男性患者，未服用抗PLT聚集药物及降糖药物，在取得患者或患者家属知情同意后，收集患者外周静脉血（空腹），其中一管使用CTAD抗凝管收集2ml全血，用于检测PLT活化率；另外使用ACD抗凝管收集14ml全血，用于提取PLT-RNA；并记录患者一般情况、身高、体重、血压、吸烟和饮酒情况，记录患者脑卒中、冠心病、高血压、DM、肝肾疾病等疾病病史和家族史，记录血糖血脂、凝血功能和肝肾功能等生化指标及相关影像学资料。DM诊断标准采用2011年最新美国DM诊断标准；IS根据TOAST病因分型收集大动脉粥样硬化型。收集性别、年龄、民族与上述IS及DM患者相匹配的健康对照人群血液标本8例，且未服用抗PLT聚集药物，收集患者的社会人口学资料、临床生化指标。
2.2PLT活性测定
将2ml外周血CTAD抗凝管轻轻振荡混匀，分别取混匀后的全血5μl置于1.5mlEP管内，记为A、B两管。将CD41-FITC和CD62p-PE荧关单抗各20μl加入A管与其内的全血混合；将CD41-FITC和IgG-FITC同型对照各20μl加入B管与其内的全血混合（以上步骤均在暗室内完成）。A、B两管室温下避光孵育30min后，分别加入PBS缓冲液600μl，于流式细胞仪上检测。
2.3富PLT血浆制备
将外周静脉血14ml置于低温冷冻离心机内，22℃1000rpm离心20min，吸取上层血浆；再置于低温冷冻离心机中，22℃2000rpm离心8min，上层血浆即贫PLT血浆，下层含白色沉淀血浆为富PLT血浆。
2.4免疫磁珠法去除白细胞纯化PLT
富PLT血浆中依次加入3mlautoMACS Running Buffer缓冲液和70μlCD45标记的磁珠，上下混匀，置于DR-MIX数字翻转摇匀仪上，25℃20rpm温育60min。将分选柱置于分选器的磁场区内，将被CD45磁珠标记过的PRP缓缓注入分选柱，收集漏出液，如上重复2次，收集的漏出液即为去除白细胞的纯化PLT。再将漏出液以22℃2000rpm离心8min，弃去上清，所得沉淀为纯化的PLT。
2.5总RNA的提取
纯化的PLT总RNA提取使用美国Invitrogen公司的TRIzol提取液提取，依照其说明书提取；实时荧光定量PCR时使用cel-miR-39作为外参。总RNA提取前，分别在200μlPPP和LDP中依次加入1mlTRIzol提取液和5μlcel-miR-39外参，轻轻上下颠倒混匀，室温下静置5min。
2.6逆转录和实时荧光定量PCR
按照美国ABI逆转录试剂盒合成步骤在Bio-rad S1000PCR仪逆转录上合成miRNAcDNA；使用ABI TaqMan GEx Master Mix，根据说明书步骤在ABI Step plus One qRT-PCR仪扩增通过实时荧光定量PCR—TaqMan探针法检测miR-223表达量。采用ΔΔCT法分析数据，每个标本重复三次。
2.7实验数据分析
应用软件SPSS18.0对数据进行统计学分析。病例组和对照组的临床计量资料用x±SD表示，计量资料组间比较采用多个样本均数间的多重比较—最小显著差异t检验（LSD-t检验）；计数资料用百分比表示，各组间比较使用χ2检验。实时荧关定量PCR数据分析采用ΔΔCT法，即ΔCT=CT目的基因–CT内参基因；ΔΔCT=ΔCT处理样本-ΔCT对照样本；倍数变化（RQ值）=2-ΔΔCT。病例和对照组miR-223表达量及PLT活化率比较采用多个样本均数间的多重比较—LSD-t检验；血小板miRNA表达量（CT值）比较采用两样本t检验。
3.结果
3.1 病例组和对照组一般情况比较
本研究共收集单纯DM患者7例、不伴DM的IS患者6例、伴DM的IS患者6例，性别、年龄相匹配的正常对照组标本8例，均为男性。单纯DM组、不伴DM的IS组和伴DM的IS组收缩压均高于对照组，具有统计学意义（P值分别为0.022、0.012和0.040）；DM组和伴DM的IS组中空腹血糖均显著高于对照组和不伴DM的IS组（P<0.001）；病例组和对照组在年龄、舒张压、甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白、吸烟及饮酒史分布上无显著性差异（P＞0.05）。
3.2 PLT活化率的比较
正常对照组、不伴DM的IS组、伴DM的IS组和单纯DM组PLT活化率分别为12.82%±1.141、16.49%±1.055、19.63%±0.942和15.56%±1.365；与正常对照组相比，三个病例组PLT活化率均增高，具有统计学意义（不伴DM的IS组P=0.002；伴DM的IS组P＜0.001；单纯DM组P=0.008）；伴DM的IS组分别与不伴DM的IS组和单纯DM组相比较，其PLT活化率均增高，具有统计学意义（P=0.008；P=0.001）；不伴DM的IS组和单纯DM组相比较，两组的PLT活化率无显著性差异（P=0.321）。
3.3各组PLTmiR-223的表达
与正常对照组相比，伴DM的IS组和单纯DM组的PLTmiR-223表达下调，具有统计学意义（伴DM的IS组P=0.047；单纯DM组P=0.017）；不伴DM的IS组与正常对照组相比，PLTmiR-223表达有下降趋势，但无显著性差异（P=0.302）；三个病例组间（不伴DM的IS组、伴DM的IS组、单纯DM组）PLTmiR-223的表达无显著性差异（P＞0.05）（图3-3）。
4.讨论
2008年Merkerova等研究发现miR-223不仅表达于中性粒细胞和单核细胞，在PLT中含量也丰富。2010年Landry等[3]2011年Osman、Nagalla等研究发现miR-223在PLT内含量最高，并发现P2Y12受体mRNA3’UTR区存在miR-223靶向识别结合的特异性序列，运用双荧光素酶报告基因试验进行验证，在不同细胞系，P2Y12受体野生型和miR-223重组表达质粒共转染细胞后能抑制靶基因表达，而突变型组不能抑制靶基因表达，提示miR-223能作用于P2Y12受体mRNA3’UTR，从而抑制其表达，影响PLT活性。P2Y12受体是PLT膜上二磷酸腺苷受体，含有七个跨膜结构域，对PLT激活聚集及血栓形成起着非常重要的作用。P2Y12受体激活可导致血小板释放α-颗粒和致密颗粒，GMP140顺次表达，GPⅡb/Ⅲa受体活化，以及ADP诱导下的TXA2生成和促凝机制的活化，从而引起PLT的聚集和血栓形成；而抑制P2Y12受体的活性（如氯吡格雷）可有效抑制促PLT活化因素所致动脉血栓的形成。因此我们推测，miR-223表达下调，可通过促进其靶基因P2Y12受体的表达，从而影响PLT活化，参与IS的发生发展。
本研究发现，病例组PLT活化率较对照组明显增高，其中伴DM的IS患者PLT活化率最高；进一步研究发现与正常对照组相比，伴DM的IS患者和单纯DM患者的PLT及血浆miR-223表达水平均下调。国内外研究表明，DM状态下的高血糖、胰岛素抵抗、炎症反应以及氧化应激等可促使DM患者PLT处于明显活化状态，且DM患者血小板P2Y12受体表达显著升高，甚至引起P2Y12拮抗剂氯吡格雷和阿司匹林双重抗PLT药物抵抗；另外Zampetaki等[2]通过大样本前瞻性研究发现，患者由健康状态发展为DM的过程中其血浆miR-223的水平显著低于发病前，且高糖处理巨核细胞后细胞内miR-223表达也显著下调。以上结论与我们的研究结果一致，因此我们推测DM相关IS患者miR-223下调的可能机制为高血糖状态下miR-223表达下调，可促进其靶基因P2Y12受体的表达，进而促进PLT活化和动脉血栓形成，增加IS的发病风险。
5.结论
通过此实验，我们发现PLTmiR-223表达下调可能是PLT活化的重要分子机制，高糖可能通过下调miR-223的表达，进而上调PLT活化相关靶基因表达，从而增加IS的发病风险。本研究提示miR-223可作为新型抗PLT药物作用靶点，为DM相关IS患者的治疗开辟新途径。
参考文献
[1]Ferreiro J L，Gomez-Hospital J A，Angiolillo D J. Platelet abnormalities in diabetes mellitus[J]. Diab Vasc Dis Res，2010，7（4）：251-259.
[2]Zampetaki A，Kiechl S，Drozdov I，et al. Plasma microRNA profiling reveals loss of endothelial miR-126 and other microRNAs in type 2 diabetes[J]. Circ Res，2010，107（6）：810-817.
[3]Landry P，Plante I，Ouellet D L，et al. Existence of a microRNA pathway in anucleate platelets[J]. Nat Struct Mol Biol，2009，16（9）：961-966.
作者简介：段晓梅（1988-），女（汉族），湖南衡阳，南华大学附属第一医院，硕士学位，医师，主要从事神经病学的研究。
论文作者:段晓梅,夏健
论文发表刊物:《航空军医》2017年第14期
论文发表时间:2017/9/18
标签：患者论文; 受体论文; 血小板论文; 基因论文; 对照组论文; 血浆论文; 病例论文; 《航空军医》2017年第14期论文;