一、鸡传染性法氏囊病毒强毒株(vvIBDV)VP_2高变区的替换（论文文献综述）
黄宇[1]（2021）在《广西IBDV的分离鉴定及其两种变异株全基因序列分析及致病性研究》文中指出传染性法氏囊病（infectious bursal disease,IBD）是由传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus,IBDV）引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病,是危害世界养禽业最重要的免疫抑制病之一。IBDV共有四种主要的致病型（pathotypes）,分别为经典毒株（classical IBDV,c IBDV）、变异株（variant IBDV,vIBDV）、超强毒株（very virulent IBDV,vvIBDV）及新型变异株（novel variant IBDV,nvIBDV）,其中新型变异株为近年来在中国首先新发现的致病型。不同致病型的毒株间存在着致病性与抗原性的差异,给IBD的防控带来困难。因此及时跟踪和了解IBD的流行情况以及毒株的致病型及其特性对于疾病的防控具有十分重要的意义。课题对广西各地2017年-2019年间临床上疑似IBD的病例通过采集病料、接种鸡胚进行IBDV的分离与鉴定,最终成功获得13个IBDV分离株。通过对毒株基因组A节段的vVP2以及B节段的VP1-b基因的扩增及其序列的分析,确定2017年-2019年广西同时存在有vvIBDV（9株）、弱毒株（1株）和nvIBDV（3株）的流行。13个分离株分别属于四种不同的基因型,即基因Ⅱ型（A节段为弱毒株,B节段为超强毒株）、基因Ⅳ型（A节段为超强毒株,B节段为Uniq-B）、基因Ⅹ型（A节段为新型变异株,B节段为Uniq-B）和基因Ⅺ型（A节段为新型变异株,B节段为新型变异株）。首次确定广西存在有nvIBDV（QZ191002和QZ191003）和新型变异重排毒株（novel variant reassortant IBDV,nvrIBDV）（YL190623）的流行,其中nvrIBDV为国内首次发现。课题选取2016年-2019年的nvIBDV毒株QZ191002和QZ191003以及nvrIBDV毒株YL160304和YL190623,利用蚀斑技术进行纯化,然后对毒株的全基因组序列进行测定与分析。结果发现YL160304、YL190623、QZ191002和QZ191003毒株的A节段均与nvIBDV参考株SHG19等的核苷酸同源性最高（94.4%-98.9%）,系统进化树分析显示它们同属一个分支,且与SHG19的A节段抗原相关的氨基酸残基的相似性最高（85%-100%）。nvrIBDV毒株YL160304和YL190623的B节段与我国近年来优势流行毒株HLJ-0504（属于vvIBDV）的核苷酸同源性最高（97.6%-97.9%）,系统进化树分析显示它们同属一个分支,且与HLJ-0504的B节段关键氨基酸残基的相似性最高（100%）。nvIBDV毒株QZ191002和QZ191003的B节段与参考株SHG19等的核苷酸同源性最高（97.2%-97.9%）,系统进化树分析显示它们同属一个分支,且与SHG19的B节段关键氨基酸残基的相似性最高（88%）。课题选取nvIBDV毒株QZ191002及nvrIBDV毒株YL160304分别在三黄鸡上进行了致病性研究。实验选用出壳的三黄鸡商品鸡雏共30只,在隔离条件下饲养至35d龄,自由采食和饮水。每周采鸡的血清,并用ELISA检测试剂盒检测其抗体,待试验鸡的血清抗体水平变成阴性后,随机分成三个组,每组10只鸡。在28d龄分别用毒株QZ191002和YL160304以105.0 TCID50/0.2ml的感染剂量,口服感染A组和B组,C组为不感染对照组。每天记录鸡的表现及死亡情况。在试验结束的时候（35d龄）对各组的鸡只进行称重并采集血清,剖杀所有鸡只及试验期间死亡的鸡只,分别采集脾脏和法氏囊,分别进行IBDV病毒载量的检测,计算囊重比、囊指数及脾脏/体重比。结果表明,nvIBDV毒株QZ191002不引起IBD的典型症状,无死亡,能导致法氏囊严重萎缩,囊指数为0.46;nvrIBDV毒株YL160304可引起IBD的典型症状,死亡率为10%（1/10）,法氏囊萎缩程度更加严重,囊指数为0.35;法氏囊和脾脏的病毒载量的检测结果以及法氏囊组织的病理学观察均表明,nvrIBDV毒株YL160304的致病力显着高于nvIBDV毒株QZ191002。课题研究结果表明,2017年-2019年广西鸡群同时存在有vvIBDV、弱毒株和nvIBDV的流行,并首次发现2016年即开始有nvIBDV和nvrIBDV毒株的流行。其全基因组序列分析也首次揭示了这两类新型变异毒株A、B片段的不同进化关系。三黄鸡的致病性研究结果证明nvrIBDV与nvIBDV所引起的病变特征是囊的萎缩,而且nvrIBDV毒株所引起的囊的萎缩程度要高于nvIBDV。
秦颖[2]（2021）在《传染性法氏囊病病毒变异株分离鉴定及不同系统表达VP2蛋白免疫原性分析》文中研究表明传染性法氏囊病（Infectious bursal disease）又称甘布洛病（Gumboro disease）,是由传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus）引起的鸡的急性、高度接触性、传染性疾病,严重危害养禽业发展。传染性法氏囊病主要感染3-6周龄雏鸡,引起严重的免疫抑制。近年来出现的新型变异株主要变现为法氏囊萎缩,虽不致死,但导致鸡的严重免疫抑制。由于传染性法氏囊病病毒由相对独立的两个节段组成,其不同毒株重组的可能性极高,导致不同毒株之间重组病毒的出现。超强毒株持续流行,变异株以及重组病毒的不断出现对传染性法氏囊病的防控形成了巨大的挑战。本研究分离鉴定了两株传染性法氏囊病病毒,对其进行遗传进化树及氨基酸序列分析,并针对VP2蛋白通过原核表达以及杆状病毒表达两种表达系统分别进行表达,将表达产物粗提纯后免疫SPF鸡,验证其免疫原性,为传染性法氏囊病的防控以及疫苗的研发提供了数据参考。1传染性法氏囊病病毒变异株分离鉴定本研究从临床上发生严重法氏囊萎缩的送检病料中用鸡胚接种分离出两株传染性法氏囊病病毒,该病毒可以在鸡胚上增殖;利用传染性法氏囊病特异性引物对其中一株进行全基因测序,对另一株VP1及VP2基因进行扩增测序,并通过生物信息学软件进行遗传进化树和氨基酸序列分析,结果表明两株分离株一株为新型重组病毒,一株为新型变异株。分离的新型重组病毒VP2基因属于超强毒株分支,而VP1基因属于非超强毒株分支。氨基酸序列分析发现该分离株VP2基因编码的氨基酸具有超强毒株所特有的氨基酸序列,和超强毒株同源性最高（99%-99.4%）,VP1基因编码的氨基酸具有弱毒株所特有的氨基酸序列,和弱毒株同源性最高（99.3%-99.8%）,遗传进化树和氨基酸分析结果表明该分离株为超强毒株和弱毒株的重组病毒。分离的新型变异株和中国分离的新型变异株同属于新型变异株分支,与新型变异株同源性达96.2%-98.2%,氨基酸序列分析该分离株具有新型变异株同源性氨基酸序列。本研究分离的两株传染性法氏囊病病毒为传染性法氏囊病的流行趋势以及防控提供了参考。2不同表达系统表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白传染性法氏囊病病毒的防控主要依赖于疫苗免疫预防,疫苗的研发是传染性法氏囊病防控的基础。本研究采用原核表达系统和杆状病毒表达系统分别表达VP2蛋白,将VP2基因成功克隆到原核表达载体pET-28a以及杆状病毒表达质粒中,构建了原核表达载体pET-28a-VP2和重组杆状病毒re-Bac-1-GP67-VP2,两种表达系统均成功表达了 VP2蛋白,原核表达系统主要以包涵体形式表达在裂解后的沉淀中,表达量约占蛋白总量的33%,杆状病毒表达系统以可溶性形式分泌到培养上清中,表达量约占总蛋白量的11%,优化表达条件后收集表达的蛋白,表达的蛋白均可与VP2单抗发生反应,具有一定的生物活性,为后续免疫原性试验提供了基础。3两种VP2重组蛋白免疫原性比较将上述重组蛋白大量表达,经粗提纯后混合佐剂制备疫苗,按照免疫程序免疫SPF鸡,免疫后采血测血清抗体效价,并于免疫后21天进行攻毒保护试验,剖检观察法氏囊大体变化,通过病理组织学分析法氏囊病理变变化,测定排毒量和病毒载量。试验结果表明,杆状病毒表达重组蛋白效果明显优于大肠杆菌表达重组蛋白免疫效果,其法氏囊病理损伤程度较低,血清学抗体水平高于原核表达产物免疫的抗体水平,病毒载量和排毒量相较于原核表达产物免疫较低,免疫程序对免疫效果也有明显影响,免疫两次效果优于免疫一次。本研究结果为传染性法氏囊病亚单位疫苗研制提供了数据参考。
李松[3]（2015）在《鸡传染性法氏囊病病毒的分离与鉴定》文中认为鸡传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease,IBD）是由传染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Disease Virus,IBDV）引起的一种急性、高度接触性的传染性疾病。IBDV主要是侵害鸡法氏囊组织中的B淋巴细胞,使B细胞数量减少,引起严重的免疫抑制,进而导致免疫失败和诱发继发感染。近几年来,IBD流行毒株不断产生新的变异。本研究从福建某地区疑似IBD病鸡的法氏囊、脾脏等组织中成功地分离到一株病毒,通过鸡胚培养、RT-PCR检测、基因测序、动物回归试验等方法对这株病毒进行了鉴定,结果如下:1.经绒毛尿囊膜接种该分离病毒,鸡胚头部、四肢末端等出血,其鸡胚半数致死量（EID50）为10-4.5/0.2mL。2.动物回归试验中,感染该病毒的SPF雏鸡大腿肌和胸肌出血,法氏囊、脾脏肿大出血。3.通过测序比对分析发现,该分离病毒株与参考的中等偏强毒力疫苗株的核苷酸及其推导的氨基酸序列同源性高,分别为98.7%-99.0%,99.0%-99.5%,七肽区均为SWSASGS,毒力相关位点的氨基酸相同,在遗传进化关系上也处于同一进化分支,亲缘关系近,可能存在相同的来源。结果表明,本研究所分离的病原为IBDV,具有较强的毒力。
赵云英[4]（2012）在《IBD天津野毒株的分离鉴定及综合防治》文中认为为了解天津地区IBD的流行状况，更好地指导防控工作，本文以天津9个郊县的212个养殖场自然发病鸡群为研究对象，按照疾病诊断流程对门诊病例进行了确诊并登记在册，随后进行了总结、归纳与分析。结果表明：82.5%的鸡群免疫过1-2次疫苗；11.8%的鸡场出现二次感染；发病日龄主要集中在21日龄-30日龄；一年四季均可发病，主要以5月、6月和9月、10月为主；23.6%混合细菌感染少数混合其他病毒感染；防控过程中存在的问题主要包括免疫程序不合理、日常管理性应激、综合治疗不完善。为进一步研究天津地区毒株的分子特性，为天津地区是否存在超强毒株及变异毒株提供理论依据，本研究从天津地区免疫失败鸡群中分离出2株IBDV，采用RT-PCR扩增出637bp的VP2片段，构建重组质粒PUMT-VP2并测序，与国内外各型毒株进行同源性比较、遗传进化分析。研究结果表明：TJ-hg、TJ-jh分离毒株与vvIBDV UK661、OKYM、HD-96、Harbin-1等的同源性均在95%以上，其中与Harbin-1、GX株同源性达98%以上；分离株与超强毒株的高变区特征性氨基酸完全相同；从进化分析图中可以得出，分离株与超强毒株亲缘关系较近，初步断定该分离株为超强毒株。为了更好地防控传染性法氏囊病，本试验以分离株作为免疫抗原制备抗IBD的卵黄抗体，以脂质体为载体制备成免疫球蛋白脂质体。结果表明：抗体效价达1：128，无菌、无外源病毒污染，4℃保存6个月；结合第二章中IBD在防控中存在的问题，从合理的免疫程序制定、完善的日常管理、发病鸡群的综合治疗三个方面提出有效的措施。
谢怀东[5]（2012）在《重组IBDV Vp2蛋白的制备与免疫保护试验》文中进行了进一步梳理传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease, IBD）是引起我国及世界养禽业经济损失严重的主要传染病之一。目前,使用的常规弱毒疫苗和灭活疫苗的安全性和制造工艺存在缺陷,而为预防变异毒株采用的中强毒力活疫苗存在着较大的生物安全问题。因此,在当前IBD防控工作中,亟需免疫效力强、生物安全性高,并且针对当前流行毒株的新型IBD基因工程疫苗的问世。本试验内容包括两个部分：试验1：重组IBDVVp2蛋白的制备将本实验室前期构建的高效表达IBDVVp2的重组杆状病毒vBacA-Vp2（P3代）接种Sf9昆虫细胞,用间接免疫荧光试验（IFA）检测,出现特异性荧光；用IBDV抗体夹心ELISA检测,呈阳性反应；用Western-blotting分析,在53ku处有一条特异蛋白条带；电镜观察,重组Vp2蛋白能组装成病毒样颗粒。优化重组Vp2蛋白的表达条件,在感染前一天预铺Sf9细胞,待细胞密度达90%时,接种不同接毒量的vBacA-Vp2,分别于72、96和120h收集细胞培养物,用IBDV双抗体夹心ELISA测定细胞培养物效价。结果表明接种vBacA-Vp2的接毒量为0.01,表达时间为72h,收集的细胞培养物中重组Vp2蛋白含量最高,抗原效价达3.2×103。用优化的重组Vp2蛋白表达条件,接种vBacA-Vp2,收集细胞培养物,大量制备重组Vp2蛋白,为研制新型高效IBD病毒样颗粒基因工程疫苗制备抗原。试验2：重组IBDVVp2蛋白的免疫保护试验将重组杆状病毒vBacA-Vp2感染的昆虫细胞裂解物分别与ISA206、ISA50和白油三种佐剂乳化制成抗原,免疫2周龄SPF鸡,一次免疫14d后,ELISA方法检测抗体效价,结果ISA206和IBDV B87株免疫组之间无显着差异（P>0.05）,但均显着高于其他组（ISA50、白油和空白对照组）（P<0.01）,细胞中和试验测定,ISA206组中和抗体效价显着高于其它4组（B87、ISA50.白油和空白对照组）（P<0.01）：二次免疫14d后,ELISA方法检测抗体效价,结果ISA206组显着高于其他组（B87、ISA50、白油和空白对照组）（P<0.01）,而白油、ISA50和B87株免疫组之间没有显着性差异（P>0.05）,细胞中和试验测定,ISA206组中和抗体效价显着高于其它4组（B87、ISA50、白油和空白对照组）（P<0.01）：用IBDVAH1强毒株对各免疫保护组进行攻毒试验,ISA206、白油和B87株免疫组攻毒存活率为1000%,ISA50组攻毒存活率为80%,空白对照组全部死亡。实验观察7d内,ISA206、白油组免疫保护鸡未显任何临床症状和病理变化。本实验制备的病毒样颗粒重组Vp2蛋白在研制新型IBD基因工程疫苗方面显示出了应用前景。
官丁明[6]（2010）在《IBDV地方流行毒株的分离鉴定及生物学特性研究》文中研究指明传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）是引起鸡传染性法氏囊病（Infectious bursal disease,IBD）的主要病原体,主要攻击3-12周龄的幼年雏鸡的中枢免疫器官——法氏囊,破坏其中的未成熟的B淋巴细胞及携带有IgM的早期分化的B淋巴细胞,使鸡体内的免疫器官及淋巴滤泡内的B细胞的功能受到严重的破坏,同时还能导致胸腺和脾脏的淋巴组织坏死,引起机体免疫应答低下或者不应答,给养鸡业带来了极大的损失。目前临床上存在着中等偏强毒株、强毒株、超强毒株及变异株等不同致病型的毒株,而不同时期、不同地方分离的IBDV在抗原性、致病性上表现出不同的差异。因此,分离地方IBDV流行毒株,研究流行毒株的分子进化规律及血清型特征,对临床上正确使用疫苗及新型疫苗的研制和建立有效的防治措施有着重大的指导意义。研究对2006-2010年间从广西,湖南及江苏三个省区的IBD疑似病例的法氏囊病料进行RT-PCR检测,结果30份样品为IBDV阳性,同时将这些阳性病料经过过滤除菌,菌检阴性后的滤液经过CAM（Chorioallantoic Membrane）途径接种9日龄SPF鸡胚进行病毒分离,结果分离到30株IBDV毒株。同时通过具有型特异性的限制性核酸内切酶SspI/SacI对分离株的基因组VP2基因高变区（Hypervariable region, HVR）进行酶切分析,结果表明,NN0704、WZ0608、HUN0801等26个毒株具有SspI酶切位点,符合vvIBDV（very virulent IBDV,vvIBDV）的特征;BB0901具有SacI酶切位点,符合cIBDV（classical IBDV,cIBDV）的特征;JS0806及JS0822两个分离株既不具有SspI酶切位点,又不具有SacI酶切位点,既不符合vvIBDV的特征,也不符合cIBDV的特征;HUN0804既具有SspI酶切位点,又具有SacI酶切位点,不符合vvIBDV的特征,也不符合cIBDV的特征。该研究结果,为下一步从基因水平研究IBDV,跟踪当前IBDV的遗传进化规律奠定基础。研究对30个IBDV流行毒株的vVP2基因的核苷酸序列进行测定,与参考株的相应序列及其关键性位点进行分析比较并绘制遗传进化树。结果表明,30个分离株中,包括JS0806及JS0822在内以及经过酶切分型属于vvIBDV的分离株,共28个毒株（约占93.3%）在七肽区保持着SASWSGS不变,并且具备222A、249Q、254G、256I、279D、284A、294I、299S八个vvIBDV的特征性氨基酸,判定为vvIBDV,与已发表的超强毒株的同源性较高（为93%～100%）,在遗传进化树上可分成3个分支,与常用疫苗株的亲缘关系则较远;HUN0804、BB0901在特征性氨基酸位点上具有弱毒株的特征,二者的同源性高,在进化树上与B87（BJ）的亲缘关系近。在氨基酸同源性上,所有的分离株与经典毒株CJ801、F52/70、Cu-1wt、Edgar的同源性为91.1%～96.8%,同源性较低,与常用疫苗株B87（in）、FW2512的同源性也仅有88.0%～93.7%,同源性低,与经典株及疫苗株相比在相关性的功能区域的氨基酸,特别是第一、第二亲水区发生了部分氨基酸的突变,如NN0603在212D、216F分别突变成212A、216L;QX0601在213D、216F分别突变成213H、216L;NN0704、QX0602则在212D、213D、216F分别突变成212A、213H、216L。这些突变均在与抗原决定簇形成有关的第一亲水区,可能引起该部位的亲水性发生改变,影响病毒的抗原性。综合上述研究结果表明,近5年来在广西、湖南、江苏的鸡群中流行的主要为vvIBDV毒株,各地的毒株来源复杂,部分IBDV分离株的抗原性有可能发生了漂移。研究还对安徽、广西、湖南、江苏、海南、浙江等六个省区于2000-2010年间分离的58个IBDV流行毒株进行了血清亚型的鉴定。首先将58个分离株与已经明确其血清亚型的6个IBDV血清I型的高免血清（YL052、TSC-2（9）、FW2512、B87（in）、BH11、NN040124）在Vero细胞上进行微量中和试验,根据中和滴度初步确定58个分离株的血清亚型;选取独立于上述血清亚型之外的中和滴度较低的分离株（JS7、TSC-1（3）、HUN0801）分别接种家兔,制备相应分离株的特异性高免血清,再将这些毒株与上述六个血清毒及其相应抗血清作病毒-血清微量交叉中和试验,对初步的血清分型结果进行进一步的验证。结果表明58个分离株均为血清I型,其中YL052、JS0802等56个分离株为一个血清亚型,归为亚型I;BH11（广西毒株）为一个亚型,归为亚型Ⅱ;JS7（江苏毒株）为单独一个亚型,归为亚型Ⅲ,而常用疫苗株属于亚型I。
宇文延青[7]（2008）在《我国部分地区传染性法氏囊病分子流行病学研究》文中研究指明本研究针对近年来我国鸡传染性法氏囊病防制过程中出现的免疫失败现象,对该病的分子流行病学进行了研究。从我国11个省（市、自治区）采集法氏囊病料68份,分离鉴定鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）21株。运用RT-PCR方法对VP2基因进行了扩增、测序、序列分析和遗传进化分析,结果表明:除SH-h株外,其余20株均具有IBDV超强毒株的分子特征,即222A、256I、294I和299S。核苷酸同源性比较表明:分离毒株与欧洲超强毒株UK661和我国超强毒株Gx株核苷酸同源率均在97.5%～99.4%;推导氨基酸同源在98.9%～100%。分离毒株间核苷酸同源率在96.7%～99.9%;推导氨基酸的同源率在98.2%～100%。以UK661为参考毒株,对分离毒株第一亲水区和第二亲水区推导氨基酸比较发现:SH-h株在222位发生A→P替换;HLJ-1、HLJ-2、HLJ-3和HLJ-4在第一亲水区的212位发生D→N替换,HLJ-3和HLJ-4株在第二亲水区321位氨基酸发生A→V替换,且血清I型IBDV均起源于同一祖先序列,所有分离毒株均位于vvIBDV进化群内。遗传距离表明:进化顺序为经典毒株、变异株,最后出现的是vvIBDV。以7株抗IBDV VP2单克隆抗体介导的间接ELISA方法对Gx、HLJ-2株和HLJ-4株3株病毒的抗原性进行分析,结果表明:HLJ-2、HLJ-4和Gx在抗原上存在着一定差异。在此基础上,用HLJ-4株和Gx株对传染性法氏囊活疫苗（Gt株）的免疫保护力进行检验,结果表明:传染性法氏囊活疫苗（Gt株）免疫SPF鸡群能抵抗超强毒株Gx和HLJ-4的攻击,SPF鸡保护率达100%。从山东、甘肃、江苏和辽宁等地的7个鸡场采集349份血清,对禽类三种重要的能引起免疫抑制的病毒（CAV、ALV-J和REV）进行了血清学调查,结果显示:CAV的血清阳性率高达81.4%,表明CAV在我国的一些鸡场普遍存在。为进一步研究CAV感染对传染性法氏囊病疫苗的影响,将80羽1日龄SPF雏鸡随机分为5组,即Gx攻毒对照组（A组）、感染组（B组）、Gt株免疫组（C）、感染-法氏囊活株疫苗（Gt株）免疫组（D组）和空白对照组（E组）,每组16羽,B组和D组在1日龄人工肌注感染病毒CAV-M9905株;7日龄,用鸡传染性法氏囊病活疫苗（Gt株）口服免疫C组和D组雏鸡;14日龄、20日龄和28日龄翅静脉采集分离血清,用ELISA试剂盒检测IBDV抗体水平,在28日龄对A、B、C和D组通过滴鼻点、点眼途径攻IBDV超强毒株Gx（ELD50=102.72/0.1ml）,0.1ml/羽,攻毒后连续观察2周。结果表明:CAV感染使IBDV活疫苗（Gt株）的免疫保护率降低,抗体滴度上升缓慢。
杨蒙[8]（2007）在《鸡传染性法氏囊病病毒强弱毒株的鉴别及VP2基因在大肠杆菌中的表达》文中提出鸡传染性法氏囊病（Infectious bursal disease,IBD）是由传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus, IBDV）引起的一种急性、高度接触性传染病。IBDV主要侵害雏鸡的中枢免疫器官法氏囊,不但会使感染鸡致病死亡,生产性能下降,而且还可致雏鸡免疫抑制,导致鸡群对新城疫、马立克病及传染性支气管炎等多种重要疫病的免疫失败,引起了世界禽病工作者的高度重视,是目前危害世界养禽业的主要传染病之一。尤其是20世纪80年代中期以后出现的超强毒株（vvIBDV）,能使感染鸡的死亡率达到60%以上,给世界养禽业带来了严重的经济损失。1957年该病首次在美国特拉华州的甘布罗镇（Gumboro）的肉鸡群中发生。最初分离到的病毒发病率高,但致死率通常在2%～5%,偶尔达20%～30%,这种病毒株称之为标准毒IBDV（vIBDV）。20世纪80年代后期,美国出现了与标准毒在抗原性上有明显差异的变异株。欧洲国家首先报道了致死率高达90～100%的超强毒（vvIBDV）,90年代初传至中国及亚洲其他地区。vvIBDV感染现己遍布于全球主要养禽地区,在工业化养鸡业发达的国家尤为严重。IBDV是双链RNA病毒,属于双RNA病毒科（Biranviridae）禽双RNA病毒属（Avibirnavirus）,无囊膜,呈二十面体对称,病毒粒子直径60nm。其基因组由A、B两个节段组成。B节段（约218kb）编码VP1蛋白,为RNA依赖的RNA聚合酶。A节段（约313kb）具有两个相互重叠的开放阅读框（ORF）,下游的ORF1编码的前体蛋白VP2/VP4/VP3可进一步剪切加工为VP2、VP4及VP3。其中VP2是病毒的主要宿主保护性抗原,与病毒的抗原变异和毒力相关;VP4为一种丝氨酸蛋白酶,负责前体蛋白VP2/VP4/VP3的自我剪切;VP3是病毒的结构蛋白之一,具有群特异性抗原。上游的ORF2（438bp）编码非结构蛋白VP5（约15ku）,该蛋白非病毒复制所必需,与病毒致病性有关。IBDV不同毒株氨基酸的差异主要发生于VP2区特别是206至305个氨基酸,称之为VP2高变区,是抗原性的主要部位。这段区域内不同毒株间的变异很大,其分子结构的改变常导致病毒致病力的改变及宿主对疫苗应答的改变,使得传统的疫苗不能控制其流行。在VP2基因高变区内包括2个亲水区和1个七肽区。亲水区是变异发生的热点部位,对于超强毒株抗原性极为重要。本研究区分了IBDV超强毒株和强毒、疫苗株,并在大肠杆菌中表达了IBDV的VP2基因,获得了以下结果:1. RT-PCR辅助限制性内切酶方法鉴别IBDV超强毒株、强毒株及疫苗株首先根据GenBank上IBDV VP2基因组的保守序列设计一对引物,利用RT-PCR扩增出大小为802bp的PCR产物。对比分析了IBDV超强毒株、强毒株及疫苗株基因组PCR产物的酶切位点,选出Aha I、Stu I和BamH I、Nsp I两组限制性内切酶。分别对超强毒株、强毒株及疫苗株进行酶切,以区分超强毒株、强毒株及疫苗株。结果表明,超强毒株能被Aha I、Stu I切出327bp的片段,而强毒株及疫苗株则只能被BamH I、Nsp I切出270bp的片段。这种方法能够准确、快速地检测出发病是否由IBDV超强毒株引起,为IBD的诊断提供了一种新的手段。2. IBDV VP2基因的原核表达根据IBDV陕西地区分离株的VP2基因的cDNA为模板,设计相应引物进行扩增。得到的目的基因连接到pET-32α原核表达载体中,得到重组质粒pET-VP2。经过PCR、酶切及测序分析,确定目的基因插入位置、方向和读码框完全正确,与预期序列相符。再将重组质粒转化到大肠杆菌JM109中,IPTG诱导表达得到分子质量约为60ku的目的蛋白,为制备抗VP2蛋白的单克隆抗体提供了基础材料。
祁小乐[9]（2007）在《鸡传染性法氏囊病病毒反向遗传操作系统的建立及基因功能研究》文中认为鸡传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease，IBD）是由鸡传染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Disease Virus，IBDV）引起的一种主要危害3-6周龄雏鸡的急性、高度接触性传染病。该病于1957年首发于美国Gumboro地区，50年米，一直威胁着养禽业的发展。免疫抑制、抗原变异，特别是超强毒株（vvIBDV）的出现，使得该病的防控形势更加严峻。国际兽疫局（the Office Internationnal des Epizooties，OIE）将IBD列为“影响社会经济的重要疾病”。关于IBDV的变异以及毒力和细胞嗜性的分子基础，一直是科研工作者研究的重点之一。本课题组的前期研究将超强毒Gx株（vvIBDV）经SPF鸡胚传5代、CEF上传20代驯化致弱为减毒株Gt。Gx株致鸡死亡率高达60％以上且不适应CEF细胞培养，Gt株对鸡无明显毒力且能在CEF上增殖，传代致弱过程中的F9代毒对鸡的毒力显着降低而且适应CEF细胞培养。本研究建立了IBDV基因组长距离高保真PCR方法（LA-PCR），利用此方法克隆了IBDV减毒株Gt的全基因组以及超强毒Gx传代致弱过程中的F9代毒的VP2并对其进行了测序。序列分析发现，与Gx株比较，F9代毒VP2有2个氨基酸突变（Q253H和A284T），Gt株VP2在此基础上又有10个氨基酸突变。另外，Gx株与Gt株在VP3和VP4上各有4个、6个氨基酸差异。本研究的目的是构建高效IBDV反向遗传操作系统，研究VP2、VP3、VP4等基因的序列差异与IBDV细胞嗜性、复制和毒力的关系。目前用于IBDV研究的体外转录、基于T7RNA聚合酶的体内转录、RNA聚合酶Ⅱ体内转录等反向遗传操作系统在病毒拯救效率和操作简便性等方面仍然存在着一些问题。本研究以全新的思路成功构建了RNA polymeraseⅡ介导的IBDV高效反向遗传操作系统。分别在Gt株基因组两端引入了锤头状核酶结构（Hammerhead ribozyme，HamRz）和丁肝病毒核酶结构（Hepatitis delta ribozyme，HdvRz），并将其克隆在真核表达载体pCAGGS的CMV增强子和β肌动蛋白启动子下游，构建IBDV感染性克隆pCAGGmGtAHRT和pCAGGmGtBHRT，经Plasmid Midi Kit（QlAGEN）纯化后，在LipofectamineTM 2000（Invitrogen）的介导下，直接转染DFI细胞，72h后取上清继续在CEF上传代。RT-PCR、间接免疫荧光、电镜等均检测到了拯救的IBDV，且存在分子标签。拯救毒在CEF上能产生特有的砂砾状CPE，且与亲本毒Gt有一致的复制动力学曲线。该系统高效、简便、稳定，具有良好的细胞普适性，能在DFI、Vero/E6、Vero/P12等多种细胞上高效拯救出病毒。IBDV高效反向遗传操作系统的建立为深入研究IBDV的基因功能奠定了基础，也为其它双RNA病毒的反向遗传操作提供借鉴。采用融合PCR（fusion PCR）的方法对Gx、F9、Gt等三个毒株的VP2基因进行了相互替换，利用所建立的反向遗传操作系统，拯救出了三个VP2基因嵌合病毒rGx-F9VP2、rGx-GtVP2、rGt-F9VP2。通过复制动力学试验和SPF鸡攻毒试验，证明：VP2的253和284位氨基酸决定IBDV细胞嗜性，Q253H和A284T可使vvIBDV适应CEF培养，并且具有明显的减毒作用；VP2的A222P、I242V、I256V、D279N、I294L、S299N、S330R等七个氨基酸变化可促进IBDV在CEF上的复制，这七个位点也与IBDV的毒力相关。另外，将vvIBDV Gx株的VP3/3’NCR、VP4/VP3/3’NCR、VP4替换Gt株的相应区域，利用上述反向遗传操作系统，拯救出三个嵌合病毒rGt-GxVP3/3’NCR、rGt-GxVP4/VP3/3’NCR、rGt-GxVP4。通过病毒复制动力学试验和对SPF鸡攻毒试验，证明VP3与IBDV在CEF上的复制相关（其中P981L可能有正向促进作用）；VP3不影响IBDV的毒力；VP4不影响IBDV的毒力以及在CEF上的复制，对VP3亦无协同作用。本研究用全新的思路成功构建了RNA polymeraseⅡ介导的IBDV反向遗传操作系统，并对IBDV VP2、VP3、VP4的功能作了研究，对全面了解IBDV的结构与功能，明确IBDV变异的分子基础，揭示IBDV致病与免疫的分子机制，探索IBDV分子致弱方法，研发适合于流行毒株的新型疫苗具有重要意义。
叶菊秀[10]（2006）在《传染性法氏囊病毒粒子感染及其A节段编码基因转化细胞的转录本初步分析》文中研究表明传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus，IBDV）侵染鸡法氏囊组织的B淋巴母细胞，导致严重的免疫抑制。为了探索IBDV感染及其编码基因转化对宿主细胞代谢的影响，本论文以Vero细胞为模型，利用LongSAGE技术（Long serial analysis of gene expression，LongSAGE），对IBDV感染、A节段、VP2／4／3、VP5基因转染的Vero细胞进行基因表达差异分析，从不同角度挖掘病毒感染过程中，细胞基因表达的调控网络关系，寻找病毒感染与细胞抗病毒过程中重要的基因及其相关通路。（一）传染性法氏囊病病毒A节段cDNA克隆以传染性法氏囊病病毒NB株（弱毒株）基因组dsRNA为模板，采用LA-PCR一步法扩增并克隆了IBDV基因组A节段全长cDNA。序列测定结果表明，IBDV基因组A节段全长共3，259个核苷酸，包括5’、3’-端的非编码区（NCR）和两个部分重叠的开放阅读框（ORF1和ORF2），与GenBank中IBDV其他毒株同源性为81.8-99.9％，与JD1、Cu-1、P2、CEF94等毒株的关系最近，而与欧洲、香港、日本的超强毒株和美国的变异株相对较远。其中ORF1编码1012个氨基酸的多聚蛋白（VP2／4／3）与JD1同源性高达99.5％，VP2片段与JD1，CEF94和D78同源性为99.8％，VP3片段与JD1同源性99.2％，VP4片段与JD1同源性100％，VP5片段与JD1、HZ2、P2、CEF94、CT、Cu-1和D78同源性99.3％。（二）表达IBDV编码基因的Vero克隆化细胞系构建将IBDV A节段、VP2／4／3、VP5、VP2、VP3等基因片段分别克隆入真核表达载体pEGFP-C2和pCI-neo，构建了pEGFP-VP5、pEGFP-pVP2系列、pCI-neo-A、pCI-neo-VP2／4／3、pCI-neo-VP5、pCI-neo-VP3、pCI-neo-pVP2系列等21种真核表达质粒，在Lipofectamine 2000介导下转染Vero细胞，利用荧光显微镜进行蛋白表达分析，结果显示：pEGFP-VP5转染Vero细胞后4-5h，能在细胞膜周围观察到与EGFP融合表达的VP5蛋白；pEGFP-pVP2系列蛋白在转染后9-12h开始出现绿色荧光细胞。在此基础上运用非融合表达的pCI-neo重组真核表达质粒转染Vero细胞，在G418抗性筛选下，进行表达IBDV A、VP2／4／3、VP5、VP2、VP3细胞的克隆，通过PCR／Southern blot、RT-PCR／Northern blot、IFA／IPMA等鉴定，获得了以下克隆化细胞系：获得了2株A节段可稳定表达其编码蛋白VP2、VP4、VP3和VP5蛋白的克隆化细胞系；获得了3株能稳定表达VP2、VP4、VP3的含VP2／4／3基因克隆化Vero细胞；获得了7株能稳定表达IBDV VP5蛋白的克隆化细胞；获得了17株能持续性表达不同VP2截短蛋白的克隆化细胞系；获得了3株稳定表达VP3蛋白的克隆化细胞系。（三） LongSAGE文库构建及数据分析应用LongSAGE技术，分别从IBDV感染的Vero细胞、Vero-A+9C4细胞、Vero-VP2／4／3+4G8细胞、Vero-VP5+2F11细胞及正常Vero细胞中抽提mRNA，建立了5个LongSAGE文库。验证转化效率与转化子大小后，各文库随机选取2000个插入片段大于500bp的转化子进行DNA测序分析。共获得代表24475（占总标签数的25.44％）种不同转录本的96213个随机标签，3124种转录本能与在人类染色体上找到相应位置（定位率为12.76％）。其中，从IBDV感染的Vero细胞库中获得代表9187种不同转录本的22193个标签；从正常Vero细胞库中获得代表8369种不同转录本的17663个标签；从Vero-VP5细胞库中获得代表7130种不同转录本的14221个标签；从Vero-A细胞库中获得代表10160种不同转录本的22968个标签；从Vero-VP2／4／3细胞库中获得代表8840种不同转录本的19168个标签。库间转录本表达差异分析显示：与正常的细胞相比较（P＜0.05），IBDV感染的细胞出现37种转录本表达上调、84种转录本表达下调，Vero-A细胞出现40种转录本表达上调、104种转录本表达下调，Vero-VP2／4／3细胞出现43种转录本表达上调、74种转录本表达下调，Vero-VP5细胞出现36种转录本表达上调、18种转录本表达下调。与IBDV感染细胞相比（P＜0.05），Vero-A细胞（335种转录本）、Vero-VP2／4／3细胞（334种转录本）、Vero-VP5细胞（91种转录本）出现显着水平的表达差异。与Vero-A细胞相比较，Vero-VP2／4／3细胞（49种转录本）、Vero-VP5细胞（113种转录本）出现表达水平的显着差异。与Vero-VP2／4／3细胞相比较，Vero-VP5细胞（104种转录本）均出现表达水平的显着差异。染色体定位结果显示：在23条人类染色体上，共有3124个注释基因获得定位。
二、鸡传染性法氏囊病毒强毒株(vvIBDV)VP_2高变区的替换（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、鸡传染性法氏囊病毒强毒株(vvIBDV)VP_2高变区的替换（论文提纲范文）
（1）广西IBDV的分离鉴定及其两种变异株全基因序列分析及致病性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 论文中所用英文缩略词列表 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 传染性法氏囊病概述 |
| 1.1.1 IBDV病原学 |
| 1.1.2 IBDV基因组结构及其序列特征 |
| 1.1.3 IBDV的主要病毒蛋白及其功能 |
| 1.2 传染性法氏囊病的流行病学 |
| 1.2.1 IBDV流行病学研究 |
| 1.2.2 IBDV分子流行病学研究 |
| 1.2.2.1 基于vVP2与VP1-b基因的基因分型 |
| 1.2.3 IBDV血清学研究 |
| 1.3 IBD的诊断 |
| 1.3.1 临床诊断 |
| 1.3.2 血清学诊断 |
| 1.3.3 分子生物学诊断 |
| 1.4 IBDV致病性的研究 |
| 1.4.1 IBDV致病机理 |
| 1.4.2 IBDV致病性的研究方法 |
| 1.5 本课题的主要研究内容及其目的和意义 |
| 第二章 广西地区2017-2019 年IBDV的分离鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病料的处理 |
| 2.2.2 病料中IBDV的 RT-PCR检测 |
| 2.2.3 病毒分离与鉴定 |
| 2.2.4 vVP2、VP1-b基因序列的扩增及测定 |
| 2.2.5 vVP2、VP1-b基因序列分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 病毒分离与鉴定结果 |
| 2.3.2 基因序列分析结果 |
| 2.3.2.1 vVP2 基因核苷酸序列相似性分析结果 |
| 2.3.2.2 VP1-b基因核苷酸序列相似性分析结果 |
| 2.3.2.3 vVP2 基因中关键氨基酸位点分析结果 |
| 2.3.2.4 VP1-b基因中关键氨基酸位点分析结果 |
| 2.3.3 系统进化树分析 |
| 2.3.3.1 vVP2 基因系统进化树分析结果 |
| 2.3.3.2 VP1-b基因系统进化树分析结果 |
| 2.3.4 基于vVP2 基因与VP1-b基因系统进化树基因分型结果 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 IBDV新型变异株及新型变异重排毒株的全基因组序列测定与分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 IBDV毒株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器和设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 IBDV分离株接种HD11 细胞上的特性生长 |
| 3.2.2 病毒的蚀斑纯化 |
| 3.2.3 全基因组分段扩增引物的设计与合成 |
| 3.2.4 IBDV基因组A、B节段分段扩增 |
| 3.2.5 连接、转化与鉴定 |
| 3.2.6 全基因组序列分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 IBDV分离株感染HD11 细胞产生的CPE |
| 3.3.2 蚀斑纯化结果 |
| 3.3.3 分离株A、B节段分段扩增结果 |
| 3.3.4 分离株全基因序列分析结果 |
| 3.3.5 A节段核苷酸序列与参考毒株相似性比较分析结果 |
| 3.3.6 B节段核苷酸序列与参考毒株相似性比较分析结果 |
| 3.3.7 基于分离株全基因A节段构建的系统进化树分析结果 |
| 3.3.8 基于分离株全基因B节段构建的系统进化树分析结果 |
| 3.3.9 分离株全基因A节段氨基酸位点突变分析 |
| 3.3.9.1 VP5 蛋白氨基酸位点突变分析结果 |
| 3.3.9.2 VP2-VP4-VP3 蛋白氨基酸位点突变分析结果 |
| 3.3.10 分离株全基因B节段氨基酸位点突变分析结果 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 传染性法氏囊病病毒新型变异株及新型变异重排毒株的致病性研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 病毒、试验动物和细胞 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 病毒的增殖 |
| 4.2.2 病毒毒价的测定 |
| 4.2.3 IBDV荧光定量RT-PCR检测方法的建立 |
| 4.2.3.1 引物设计与样品质粒的构建 |
| 4.2.3.2 标准曲线的建立 |
| 4.2.3.3 敏感性和重复性试验 |
| 4.2.4 致病性试验分组情况 |
| 4.2.5 血清中IBDV抗体水平的检测 |
| 4.2.6 试验鸡临床症状指数观察 |
| 4.2.7 法氏囊病变 |
| 4.2.7.1 试验鸡法氏囊损伤记录 |
| 4.2.7.2 试验鸡免疫器官比重(法氏囊和脾脏)及囊病变指数的统计 |
| 4.2.8 试验鸡法氏囊和脾脏组织病毒载量检测 |
| 4.2.9 试验鸡法氏囊组织病理学病变指数观察 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 病毒增殖结果 |
| 4.3.2 病毒毒价的测定结果 |
| 4.3.3 IBDV荧光定量RT-PCR检测方法的建立结果 |
| 4.3.3.1 所获得质粒的拷贝数结果 |
| 4.3.3.2 实时荧光定量标准曲线的获得 |
| 4.3.3.3 灵敏度和重复性试验结果 |
| 4.3.4 试验鸡血清中IBDV抗体水平的检测结果 |
| 4.3.5 试验鸡临床症状指数观察结果 |
| 4.3.6 法氏囊眼观病变图 |
| 4.3.7 试验鸡免疫器官比重(法氏囊和脾脏)及囊病变指数的统计结果 |
| 4.3.8 试验鸡法氏囊和脾脏组织病毒载量检测结果 |
| 4.3.8.1 试验鸡法氏囊组织病毒载量检测结果 |
| 4.3.8.2 试验鸡脾脏组织病毒载量检测结果 |
| 4.3.9 试验鸡法氏囊组织病理学病变指数观察统计结果 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（2）传染性法氏囊病病毒变异株分离鉴定及不同系统表达VP2蛋白免疫原性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 传染性法氏囊病文献综述 |
| 1 传染性法氏囊病病毒病原学 |
| 1.1 病毒形态 |
| 1.2 基因组结构 |
| 2 传染性法氏囊病流行病学 |
| 2.1 易感动物 |
| 2.2 流行特点 |
| 2.3 临床症状 |
| 2.4 IBDV分子流行病学 |
| 3 传染性法氏囊病的诊断 |
| 3.1 临床诊断 |
| 3.2 实验室诊断 |
| 4 传染性法氏囊病的防控 |
| 5 传染性法氏囊病疫苗研究进展 |
| 5.1 传统疫苗 |
| 5.2 新型基因工程疫苗 |
| 6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 传染性法氏囊病病毒变异株分离鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.4 病料信息 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 病毒RNA的提取 |
| 2.2 RT-PCR检测病毒 |
| 2.3 NT2020-8株VP2基因及VP1部分基因片段扩增及载体连接 |
| 2.4 NP2104株全基因测序 |
| 2.5 遗传进化树分析 |
| 2.6 氨基酸变异分析 |
| 2.7 同源性分析 |
| 2.8 病毒在鸡胚上培养 |
| 2.9 动物回归实验 |
| 3 结果 |
| 3.1 病料RT-PCR检测结果 |
| 3.2 NT2020-8株VP2及VP1部分基因扩增结果 |
| 3.3 NT2020-8株VP2及VP1基因遗传进化树分析结果 |
| 3.4 NT2020-8株VP2及VP1部分基因编码氨基酸变异分析结果 |
| 3.5 NT2020-8株同源性分析结果 |
| 3.7 NP2104株全基因扩增结果 |
| 3.8 NP2104株遗传进化分析结果 |
| 3.9 NP2104株氨基酸序列分析结果 |
| 3.10 NP2104株同源性分析结果 |
| 3.11 鸡胚培养结果 |
| 3.12 NP2104株动物回归实验结果 |
| 4 讨论与小结 |
| 第三章 不同表达系统表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要化学试剂 |
| 1.2 主要试剂配制 |
| 1.3 主要生物材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 IBDV超强毒株JS株总RNA的提取 |
| 2.2 原核表达VP2基因的扩增 |
| 2.3 VP2基因与原核表达载体连接 |
| 2.4 原核表达重组质粒的小量诱导表达及鉴定 |
| 2.5 重组转移载体pFast-Bac-1-GP67-VP2的构建 |
| 2.6 杆状病毒转移载体转座DH10 Bac感受态细胞 |
| 2.7 重组杆状病毒质粒的提取 |
| 2.8 重组杆状病毒质粒鉴定 |
| 2.9 重组杆状病毒质粒转染sf9细胞 |
| 2.10 收获P1代重组杆状病毒及鉴定 |
| 2.11 重组杆状病毒表达鉴定 |
| 2.12 重组杆状病毒表达条件优化 |
| 2.13 重组杆状病毒大量表达及收获蛋白 |
| 3 结果 |
| 3.1 原核表达载体pET-28a-VP2酶切鉴定 |
| 3.2 原核表达重组蛋白SDS-PAGE分析及最佳表达菌株的筛选 |
| 3.3 原核表达重组蛋白Western Blot分析 |
| 3.4 原核表达诱导表达条件优化 |
| 3.5 大量诱导表达及包涵体提取效果 |
| 3.6 杆状病毒转移载体pFast-Bac-1-GP67-VP2的酶切鉴定 |
| 3.7 重组杆状病毒质粒的鉴定 |
| 3.8 P1代重组杆状病毒的收获及鉴定 |
| 3.9 重组杆状病毒表达鉴定 |
| 3.10 测定重组杆状病毒TCID50 |
| 3.11 重组杆状病毒表达条件优化 |
| 3.12 重组杆状病毒优化表达条件后蛋白表达结果 |
| 4 讨论与小结 |
| 第四章 两种VP2重组蛋白免疫原性比较 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 毒株 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要生物材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 免疫原制备 |
| 2.2 SPF鸡免疫方案 |
| 2.3 IFA抗体检测 |
| 2.4 中和抗体检测 |
| 2.5 琼扩抗体检测 |
| 2.6 攻毒保护试验 |
| 2.7 法氏囊组织病理学评价 |
| 2.8 荧光定量PCR方法检测法氏囊病毒载量及泄殖腔排毒量 |
| 3 结果 |
| 3.1 血清IFA抗体效价 |
| 3.2 血清中和抗体效价 |
| 3.3 血清琼扩抗体效价 |
| 3.4 攻毒保护试验结果 |
| 3.5 法氏囊组织病理学评价结果 |
| 3.6 法氏囊病毒载量及肛拭子排毒量结果 |
| 4 讨论与小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）鸡传染性法氏囊病病毒的分离与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 综述 |
| 1.1 研究历史 |
| 1.2 病原学 |
| 1.2.1 分类地位 |
| 1.2.2 形态特征及其结构 |
| 1.2.3 理化特性 |
| 1.2.4 培养特性 |
| 1.3 IBDV基因组 |
| 1.3.1 IBDV基因组结构及其功能 |
| 1.3.2 IBDV编码蛋白及其生物学功能 |
| 1.4 流行病学 |
| 1.5 发病机理 |
| 1.6 临床症状 |
| 1.7 病理变化 |
| 1.8 血清型 |
| 1.9 IBDV研究展望 |
| 1.10 研究目的与意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要试验仪器 |
| 2.1.3 其它 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 病料的处理 |
| 2.2.2 病毒的分离 |
| 2.2.3 鸡胚接毒试验 |
| 2.2.4 鸡胚半数致死量(ELD_(50))的测定试验 |
| 2.2.5 SPF雏鸡攻毒试验 |
| 2.2.6 RT-PCR扩增 |
| 2.2.7 VP2基因序列克隆和测定 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 病毒的分离与鸡胚接毒试验结果 |
| 3.2 ELD_(50)的测定试验结果 |
| 3.3 SPF雏鸡攻毒试验结果 |
| 3.4 RT-PCR鉴定结果 |
| 3.5 VP2基因的克隆 |
| 3.5.1 RT-PCR扩增 |
| 3.5.2 纯化的PCR产物电泳鉴定 |
| 3.5.3 重组质粒的PCR鉴定 |
| 3.6 VP2基因序列测定及其序列分析结果 |
| 3.6.1 VP2基因序列、同源性及进化树分析 |
| 3.6.2 氨基酸序列分析结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 病毒的分离与鸡胚接毒试验 |
| 4.2 流行病学 |
| 4.3 IBDV宿主 |
| 4.4 IBD的预防 |
| 4.5 IBD疫苗 |
| 4.6 VP2基因序列测定与分析 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）IBD天津野毒株的分离鉴定及综合防治（论文提纲范文）
| 中文摘要 Abstract 第一章 引言 |
| 1 本研究的目的和意义 |
| 2 传染性法氏囊病的基本概述 |
| 2.1 病原的生物学特性 |
| 2.2 流行病学及临床症状 |
| 3 法氏囊病病毒分子生物学特性 |
| 3.1 基因组结构 |
| 3.2 编码蛋白及其功能 |
| 4 IBDV 检测方法 |
| 4.1 流行病学及临床症状诊断 |
| 4.2 病理学诊断 |
| 4.3 电子显微镜检测 |
| 4.4 病毒分离培养 |
| 4.5 血清学检测 |
| 4.6 分子生物学检测 |
| 5 国内外地方分离株的概况 |
| 5.1 国外地方分离株研究概况 |
| 5.2 国内地方分离株研究概况 |
| 6 IBD 的防控与治疗 |
| 6.1 IBD 的防控 |
| 6.2 IBD 的综合防治措施 |
| 7 卵黄抗体和脂质体概述 |
| 7.1 卵黄抗体研究及应用 |
| 7.2 脂质体的研究与应用 第二章 天津地区传染性法氏囊病现状 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 问诊的结果 |
| 2.2 临床症状及病理变化 |
| 2.3 细菌学检查结果 |
| 2.4 新城疫和禽流感检测结果 |
| 2.5 病理组织学变化 |
| 2.6 琼脂扩散试验结果 |
| 2.7 统计分析结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 天津地区 IBD 的流行现状 |
| 3.2 IBD 防治过程中存在的问题 第三章 IBDV 超强毒株的分离与鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 VP2 扩增及纯化结果 |
| 2.2 菌落 PCR 电泳结果 |
| 2.3 测序结果 |
| 2.4 分离株的序列分析结果 |
| 3 讨论 第四章 抗 IBD 卵黄抗体脂质体的制备及其综合防治措施的制定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 免疫球蛋白的制备及检测 |
| 2.2 免疫球蛋白脂质体的制备及检测 |
| 2.3 综合防治措施的制定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 卵黄抗体的制备及效果检测 |
| 3.2 综合防治措施 结论 参考文献 致谢 附录 攻读学位期间发表的论文 |
（5）重组IBDV Vp2蛋白的制备与免疫保护试验（论文提纲范文）
| 中文摘要 ABSTRACT 缩略语表 第一篇 文献综述 |
| 第一章 传染性法氏囊病的研究进展 |
| 1. IBDV的形态结构和分型 |
| 2. IBDV的基因组结构 |
| 3. IBDV基因组编码蛋白 |
| 4. IBD的流行病学 |
| 5. IBD的诊断及防控 |
| 6. 新型高效疫苗的开发 第二篇 研究内容 |
| 第二章 重组IBDV Vp2蛋白的制备 |
| 摘要 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 菌株、细胞和病毒 |
| 1.3 Sf9细胞培养与病毒感染 |
| 1.4 重组Vp2蛋白的鉴定 |
| 1.5 重组Vp2蛋白表达条件的优化 |
| 1.6 重组Vp2蛋白的大量制备 |
| 2. 结果 |
| 2.1 Sf9细胞培养与病毒感染 |
| 2.2 重组Vp2蛋白的鉴定 |
| 2.3 重组Vp2蛋白表达条件的优化 |
| 3. 讨论 |
| ABSTRACT |
| 第三章 重组IBDV Vp2蛋白免疫保护试验 |
| 摘要 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 细胞、病毒和主要试剂 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 重组Vp2蛋白的免疫试验 |
| 1.4 攻毒试验 |
| 2. 结果 |
| 2.1 重组Vp2蛋白的免疫试验 |
| 2.2 重组Vp2蛋白攻毒试验 |
| 3. 讨论 |
| ABSTRACT 参考文献 全文总结 附录：常用试剂的配制 致谢 |
（6）IBDV地方流行毒株的分离鉴定及生物学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1 传染性法氏囊病分子流行病学研究进展 |
| 1.1 传染性法氏囊病及其病原的基本概况 |
| 1.2 传染性法氏囊病病毒的分子结构及功能 |
| 1.2.1 病毒粒子的形态及其结构 |
| 1.2.2 病毒基因组结构及其功能 |
| 1.2.3 病毒蛋白及其功能 |
| 1.3 IBDV的分子流行病学研究概况 |
| 1.3.1 IBD流行的基本情况 |
| 1.3.2 IBDV的分子流行病学国内外研究概况 |
| 1.4 IBDV的血清型及其亚型 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 2 IBDV地方流行毒株的分离鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 病料核酸检测结果 |
| 2.2.2 病毒分离鉴定结果 |
| 2.2.3 分离毒株的致病型鉴定结果 |
| 2.2.4 分离毒株的背景情况 |
| 2.3 小结与讨论 |
| 3 IBDV地方流行毒株VP2 高变区的序列测定与分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 病毒 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 仪器 |
| 3.1.4 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 VP2 高变区基因的序列测定及其序列分析结果 |
| 3.2.2 氨基酸序列比较及其关键位点分析结果 |
| 3.2.3 分离株核苷酸序列同源性分析结果 |
| 3.2.4 分离株氨基酸序列同源性分析结果 |
| 3.2.5 分离毒株的核苷酸系统进化树分析结果 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 4 IBDV地方流行毒株血清型及其亚型的研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 分离株及常用疫苗毒株血清中和试验结果 |
| 4.2.2 病毒血清型鉴定结果 |
| 4.2.3 病毒血清亚型的鉴定结果 |
| 4.2.4 部分分离株血清亚型与基因分型间的关系 |
| 4.2.5 分离株血清中和滴度的聚类分析结果 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录 |
（7）我国部分地区传染性法氏囊病分子流行病学研究（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 第一章 绪论 |
| 1.1 传染性法氏囊病简介 |
| 1.2 病原学 |
| 1.2.1 IBDV 的形态结构 |
| 1.2.2 IBDV 的分型 |
| 1.2.3 IBDV 的基因组结构 |
| 1.2.4 IBDV 基因组编码蛋白 |
| 1.3 传染性法氏囊病流行病学研究现状 |
| 1.3.1 流行病学与分子流行病学 |
| 1.3.2 IBD 的流行病学 |
| 1.3.3 IBD 分子流行病学的研究现状 |
| 1.3.4 分子进化树构建常用方法 |
| 1.4 传染性法氏囊病的诊断及防制 |
| 1.4.1 诊断方法 |
| 1.4.2 IBD 的防制 |
| 1.5 本研究的重要意义 第二章 传染性法氏囊病病毒的分离与鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 SPF 鸡胚及试验动物 |
| 2.1.4 病料采集 |
| 2.1.5 病料处理 |
| 2.1.6 病毒分离 |
| 2.1.7 病毒免疫荧光检测 |
| 2.1.8 IBDV 基因组RNA 的提取 |
| 2.1.9 引物设计与合成 |
| 2.1.10 病毒RT-PCR 鉴定 |
| 2.1.11 病毒ELD50测定 |
| 2.1.12 SPF 鸡致死率测定 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 免疫荧光检测结果 |
| 2.2.2 分离毒株的地理分布 |
| 2.2.3 病毒的RT-PCR 鉴定结果 |
| 2.2.4 ELD50测定结果 |
| 2.2.5 SPF 鸡致死率测定结果 |
| 2.2.6 发病鸡法氏囊、肝脏、盲肠扁桃体和胸腺的组织病理学变化 |
| 2.3 讨论 第三章 传染性法氏囊病分离毒株的遗传演化分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 主要仪器 |
| 3.1.2 载体、菌种、工具酶与主要试剂 |
| 3.1.3 IBDV 基因组RNA 的提取 |
| 3.1.4 IBDV 基因组的反转录 |
| 3.1.5 IBDV VP2 基因cDNA 的扩增与克隆 |
| 3.1.6 IBDV VP2 基因cDNA 序列分析 |
| 3.1.7 IBDV 遗传进化分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 IBDV 分离株VP2 基因cDNA 的克隆 |
| 3.2.2 VP2 基因序列分析 |
| 3.2.3 IBDV 遗传演化分析 |
| 3.3 讨论 第四章 分离毒株 VP2 蛋白抗原性差异分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 主要试剂及仪器 |
| 4.1.2 分离毒株VP2 蛋白抗原性差异分析 |
| 4.1.3 HLJ-2、HLJ-4 和Gx 株同源建模 |
| 4.1.4 HLJ-2、HLJ-4 和 Gx 抗原性差异检测 |
| 4.1.5 数据处理 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 分离毒株的抗原差异分析 |
| 4.2.2 HLJ-2、HLJ-4 和Gx 同源建模结果 |
| 4.2.3 7 株单克隆抗体介导的 HLJ-2、HLJ-4 株和 Gx 株间接 ELISA 结果 |
| 4.2.4 数据统计分析 |
| 4.3 讨论 第五章 传染性法氏囊病活疫苗（Gt 株）对 HLJ-4、Gx 株免疫保护试验 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验动物、鸡胚、主要试剂及仪器 |
| 5.1.2 Gx 株ELD50测定 |
| 5.1.3 动物试验设计 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 Gx 株ELD50 |
| 5.2.2 死亡鸡胚 IBDV 琼脂扩散检测结果 |
| 5.2.3 疫苗免疫保护试验结果 |
| 5.2.4 攻毒死亡鸡IBDV 琼脂扩散检测结果 |
| 5.3 讨论 第六章 鸡传染性贫血病病毒感染对鸡传染性法氏囊病活疫苗 (Gt 株)免疫效果的影响 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 血清采集与抗体检测 |
| 6.1.2 动物试验设计 |
| 6.1.3 传染性贫血病病毒PCR 检测 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 CAV、ALV-J 和REV 血清学检测结果 |
| 6.2.2 CAV 感染后PCR 检测结果 |
| 6.2.3 IBDV 抗体检测结果 |
| 6.2.4 Gx 株攻毒结果 |
| 6.3 讨论 第七章 结论 参考文献 附录 致谢 作者简历 |
（8）鸡传染性法氏囊病病毒强弱毒株的鉴别及VP2基因在大肠杆菌中的表达（论文提纲范文）
| 摘要 ABSTRACT 第一章 鸡传染性法氏囊病的研究进展 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 IBDV 的基因组结构及病毒蛋白 |
| 1.2.1 VP1 蛋白 |
| 1.2.2 VP2 蛋白 |
| 1.2.3 VP3 蛋白 |
| 1.2.4 VP4 蛋白 |
| 1.2.5 VP5 蛋白 |
| 1.3 病毒抗原变异和毒力差异的分子基础 |
| 1.3.1 IBDV 抗原性变异的分子基础 |
| 1.3.2 IBDV 毒力变异的分子基础 |
| 1.4 IBDV 疫苗研制、免疫途径及免疫失败的原因 |
| 1.4.1 IBD 疫苗种类 |
| 1.4.2 免疫程序 |
| 1.4.3 免疫途径 |
| 1.4.4 免疫失败的原因 |
| 1.5 国内研究进展 第二章 RT-PCR 快速鉴别IBDV 超强毒株、强毒株及疫苗株的研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 VP2 基因的RT-PCR 扩增 |
| 2.2.2 酶切鉴定结果 |
| 2.3 讨论 第三章 传染性法氏囊病病毒VP2 基因的原核表达 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 PCR 扩增结果 |
| 3.2.2 克隆载体pMD-18T-VP2 的鉴定 |
| 3.2.3 原核表达载体pET-VP2 的鉴定 |
| 3.2.4 VP2 蛋白的诱导表达和SDS-PAGE 分析 |
| 3.3 讨论 参考文献 缩略语英汉对照表 致谢 作者简介 |
（9）鸡传染性法氏囊病病毒反向遗传操作系统的建立及基因功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 第一章 绪论 |
| 1.1 鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)研究进展 |
| 1.1.1 IBDV的形态结构 |
| 1.1.2 IBDV的基因组结构 |
| 1.1.3 IBDV的编码蛋白及非编码区 |
| 1.2 动物RNA病毒的反向遗传操作系统 |
| 1.2.1 体外转录拯救系统 |
| 1.2.2 基于T7 RNA聚合酶的体内转录系统 |
| 1.2.3 RNA聚合酶Ⅰ拯救系统 |
| 1.2.4 RNA聚合酶Ⅱ拯救系统 |
| 1.3 鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的拯救系统 |
| 1.4 鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的反向遗传操作研究 |
| 1.4.1 关于IBDV细胞嗜性的研究 |
| 1.4.2 关于IBDV毒力分子基础的研究 |
| 1.4.3 标记疫苗研究 |
| 1.4.4 对非编码区功能的研究 |
| 1.5 问题与展望 |
| 1.6 本研究的目的和意义 第二章 鸡传染性法氏囊病病毒GT株全基因组克隆与序列分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 病毒、细胞、质粒和菌种 |
| 2.1.2 工具酶与主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 引物设计与合成 |
| 2.1.5 IBDV全基因组RNA的提取 |
| 2.1.6 IBDV全基因组的反转录 |
| 2.1.7 IBDV全基因组cDNA的扩增与克隆 |
| 2.1.8 F9代毒VP2基因的扩增与克隆 |
| 2.1.9 IBDV Gt株全基因组及F9代毒VP2序列分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 IBDV Gt株全基因组的克隆 |
| 2.2.2 F9代毒VP2基因的克隆 |
| 2.2.3 基因组遗传演化分析 |
| 2.2.4 基因组序列分析 |
| 2.3 讨论 第三章 鸡传染性法氏囊病病毒反向遗传操作系统的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 病毒、细胞与单克隆抗体 |
| 3.1.2 质粒和菌种 |
| 3.1.3 工具酶与主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.1.5 引物设计与合成 |
| 3.1.6 分子标签引入 |
| 3.1.7 核酶结构引入 |
| 3.1.8 全基因组真核表达载体的构建 |
| 3.1.9 病毒拯救 |
| 3.1.10 拯救病毒RT-PCR及分子标签鉴定 |
| 3.1.11 拯救病毒间接免疫荧光鉴定 |
| 3.1.12 拯救病毒电镜检查 |
| 3.1.13 拯救毒与亲本毒复制动力学比较 |
| 3.1.14 IBDV反向遗传操作系统的细胞普适性与稳定性 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 IBDV全基因组分子标签的引入 |
| 3.2.2 核酶结构的引入 |
| 3.2.3 全基因组真核表达载体的构建 |
| 3.2.4 病毒的拯救 |
| 3.2.5 拯救病毒RT-PCR及序列测定 |
| 3.2.6 拯救病毒间接免疫荧光鉴定 |
| 3.2.7 拯救病毒电镜检查 |
| 3.2.8 拯救毒与亲本毒复制动力学比较 |
| 3.2.9 IBDV反向遗传操作系统的细胞普适性与稳定性 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 RNA聚合酶Ⅱ介导的IBDV拯救系统 |
| 3.3.2 点突变方法与分子标签 |
| 3.3.3 核酶与基因组的完整性 |
| 3.3.4 基因组的保真性与病毒的拯救 |
| 3.3.5 IBDV反向遗传操作系统的细胞普适性与高效率 |
| 3.3.6 影响病毒拯救效率的其他因素 |
| 3.3.7 判定病毒拯救成功的指标 第四章 鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因功能的研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 病毒、细胞和质粒 |
| 4.1.2 SPF鸡 |
| 4.1.3 工具酶与主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 引物设计与合成 |
| 4.1.6 Gt株VP2替换Gx株VP2 |
| 4.1.7 F9代毒VP2替换Gx株VP2 |
| 4.1.8 F9代毒VP2替换Gt株VP2 |
| 4.1.9 Gx株B节段真核表达载体的构建 |
| 4.1.10 VP2基因替换的嵌合病毒拯救 |
| 4.1.11 嵌合病毒的鉴定 |
| 4.1.12 嵌合病毒复制动力学试验 |
| 4.1.13 嵌合病毒毒力试验 |
| 4.1.14 试验鸡法氏囊病毒分离 |
| 4.1.15 试验鸡法氏囊RT-PCR与序列测定 |
| 4.1.16 试验鸡血清抗体效价的测定 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 替换Gt株VP2的Gx株A节段真核表达载体的构建 |
| 4.2.2 替换F9代毒VP2的Gx株A节段真核表达载体的构建 |
| 4.2.3 替换F9代毒VP2的Gt株A节段真核表达载体的构建 |
| 4.2.4 Gx株B节段真核表达载体的构建 |
| 4.2.5 VP2基因替换的嵌合病毒拯救 |
| 4.2.6 嵌合病毒的RT-PCR及序列测定 |
| 4.2.7 嵌合病毒的间接免疫荧光鉴定 |
| 4.2.8 嵌合病毒的电镜观察 |
| 4.2.9 嵌合病毒复制动力学研究 |
| 4.2.10 试验鸡的症状 |
| 4.2.11 试验鸡的剖检病变 |
| 4.2.12 试验鸡的囊重比与囊指数 |
| 4.2.13 试验鸡法氏囊的组织病理变化 |
| 4.2.14 试验鸡法氏囊病毒分离 |
| 4.2.15 试验鸡法氏囊的RT-PCR与序列测定 |
| 4.2.16 试验鸡血清抗体效价的测定结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 VP2的253和284位氨基酸决定IBDV细胞嗜性 |
| 4.3.2 VP2的222等7个氨基酸与IBDV在CEF上的复制有关 |
| 4.3.3 VP2的253和284位氨基酸是IBDV的重要毒力位点 |
| 4.3.4 VP2的222等7个氨基酸是IBDV潜在的毒力位点 |
| 4.3.5 VP2不是影响IBDV复制和毒力的唯一因素 |
| 4.3.6 氨基酸突变影响IBDV细胞嗜性、复制和毒力的可能机理 |
| 4.3.7 融合PCR与基因替换 |
| 4.3.8 不完全酶切在基因克隆中的应用 第五章 鸡传染性法氏囊病病毒VP3和VP4基因功能的研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 病毒、细胞和质粒 |
| 5.1.2 SPF鸡 |
| 5.1.3 工具酶与主要试剂 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.1.5 Gx株和Gt株A节段的亚克隆 |
| 5.1.6 Gx株VP3/3’NCR替换Gt株相应区域 |
| 5.1.7 Gx株VP4/VP3/3’NCR替换Gt株相应区域 |
| 5.1.8 Gx株VP4替换Gt株相应区域 |
| 5.1.9 嵌合A节段核酶结构的引入 |
| 5.1.10 嵌合A节段真核表达载体的构建 |
| 5.1.11 嵌合病毒的拯救 |
| 5.1.12 嵌合病毒的鉴定 |
| 5.1.13 嵌合病毒复制动力学研究 |
| 5.1.14 嵌合病毒毒力研究 |
| 5.1.15 试验鸡法氏囊病毒分离与鉴定 |
| 5.1.16 试验鸡法氏囊RT-PCR与序列测定 |
| 5.1.17 试验鸡的血清抗体效价测定 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 嵌合A节段真核表达载体的构建 |
| 5.2.2 嵌合病毒的拯救 |
| 5.2.3 嵌合病毒RT-PCR及序列测定 |
| 5.2.4 嵌合病毒的间接免疫荧光鉴定 |
| 5.2.5 嵌合病毒的电镜观察 |
| 5.2.6 嵌合病毒复制动力学研究 |
| 5.2.7 试验鸡的症状与剖检变化 |
| 5.2.8 试验鸡的囊重比与囊指数 |
| 5.2.9 试验鸡法氏囊的RT-PCR与序列测定 |
| 5.2.10 试验鸡法氏囊的病毒分离 |
| 5.2.11 试验鸡的血清抗体效价 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 VP3影响IBDV在CEF上的复制 |
| 5.3.2 VP4不影响IBDV在CEF上的复制 |
| 5.3.3 VP3、VP4不影响IBDV的毒力 第六章 结论 参考文献 附录 致谢 作者简历 |
（10）传染性法氏囊病毒粒子感染及其A节段编码基因转化细胞的转录本初步分析（论文提纲范文）
| 摘要 ABSTRACT 引言 第一部分 文献综述 |
| 第一章 传染性法氏囊病病毒研究现状 |
| 1 IBDV发现历史 |
| 2 病毒学分类地位 |
| 3 基因组结构及编码蛋白功能 |
| 3.1 5’-NCR和3’-NCR |
| 3.2 VP1蛋白 |
| 3.3 pVP2、VP2与4条多肽 |
| 3.4 VP3蛋白 |
| 3.5 VP4蛋白 |
| 3.6 VP5蛋白 |
| 4 病毒复制及分子机制 |
| 4.1 IBDV的宿主细胞 |
| 4.2 病毒复制的分子机制 |
| 5 IBDV致病机理与细胞凋亡 |
| 6 抗原与毒力变异 |
| 7 拯救技术在IBDV的研究中的应用 |
| 8 小结 |
| 第二章 基因表达系列分析及相关技术研究进展 |
| 1 SAGE技术的原理 |
| 2 SAGE文库构建方法的改进 |
| 3 SAGE标签的注释 |
| 3.1 注释策略 |
| 3.2 未注释标签的进一步分析 |
| 4 SAGE文库之间差异比较 |
| 5 SAGE获得的表达差异基因的进一步实验分析 |
| 5.1 Northern杂交分析 |
| 5.2 半定量RT-PCR和实时定量RT-PCR |
| 5.3 基因芯片 |
| 6.SAGE-like技术 |
| 6.1 3’SAGE和5’SAGE |
| 6.2 CAGE |
| 6.3 GIS |
| 6.4 SAGE与ChiP联用 |
| 6.5 DK和MSDK |
| 6.6 DACS |
| 6.7 其他 |
| 7 SAGE及相关技术的应用 |
| 7.1 转录组研究 |
| 7.2 基因表达差异研究 |
| 7.3 发现新基因 |
| 8 结束语 第二部分 研究内容 |
| 第一章 传染性法氏囊病病毒NB株基因组A节段全长CDNA克隆 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 载体、菌株、病毒株与SPF种蛋 |
| 1.2 病毒的增殖、纯化与电镜观察 |
| 1.3 IBDV基因组dsRNA的提取 |
| 1.4 引物设计和合成 |
| 1.5 Long accurate(LA)-PCR扩增基因组A节段全长cDNA |
| 1.6 IBDV基因组A节段全长cDNA的T-A克隆 |
| 1.7 序列测定及分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒粒子观察与病毒基因组dsRNA提取 |
| 2.2 IBDV基因组A节段的克隆与鉴定 |
| 2.3 序列测定结果 |
| 2.4 序列分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 一步法LA-PCR克隆IBDV基因组A节段全长cDNA方法的建立 |
| 3.2 VP5蛋白 |
| 3.3 多聚蛋白(VP2/4/3) |
| 3.4 关于IBDV抗原变异和毒力变异的分子基础 |
| 3.5 关于NB株与其它毒株的亲缘关系 |
| 第二章 传染性法氏囊病毒感染前后VERO细胞基因表达差异分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 细胞培养与病毒感染 |
| 1.2 细胞总RNA与mRNA分离 |
| 1.3 ds cDNA合成 |
| 1.4 NlaⅢ酶切双链cDNA |
| 1.5 Linker与结合在磁珠上的cDNA连接 |
| 1.6 MmeⅠ酶切获得cDNA标记物 |
| 1.7 获得130-bp双标签 |
| 1.8 双标签分离 |
| 1.9 串联体产生 |
| 1.10 串联子pZErO-1载体克隆 |
| 1.11 Screening of Clones |
| 1.12 序列测定与LongSAGE数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 IBDV感染检测及细胞mRNA的分离 |
| 2.2 LongSAGE文库的构建及校验 |
| 2.3 测序结果及数据分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 选用LongSAGE技术依据及其文库构建 |
| 3.2 利用人类cDNA、UniGene数据注释标签 |
| 3.3 IBDV感染细胞基因表达谱特征 |
| 第三章 传染性法氏囊病病毒A节段或VP2/4/3基因转化的VERO细胞基因表达差异分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 抗体与试剂 |
| 1.2 真核表达载体构建 |
| 1.3 细胞培养、质粒转染及单细胞克隆 |
| 1.4 克隆化细胞的PCR和Southern blot鉴定 |
| 1.5 RT-PCR和Northern blot检测 |
| 1.6 A节段编码蛋白在克隆化细胞中的表达 |
| 1.7 DNA裂解分析和Caspase-3活性分析 |
| 1.8 Vero-A和Vero-VP2/4/3细胞LongSAGE文库构建 |
| 1.9 文库标签提取与库间差异分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 真核表达载体构建 |
| 2.2 G418阳性细胞筛选与克隆 |
| 2.3 转入基因在克隆化细胞基因组中的整合分析 |
| 2.4 转入基因在克隆化细胞中的转录分析 |
| 2.5 转入基因表达产物在克隆化细胞中检测 |
| 2.6 DNA裂解分析和Caspase-3活性分析 |
| 2.7 Vero-A和Vero-VP2/4/3细胞LongSAGE文库构建 |
| 2.8 测序结果及数据分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 细胞系的建立 |
| 3.2 VP2和VP5蛋白表达与细胞凋亡 |
| 3.3 A节段NCRs的功能 |
| 第四章 表达传染性法氏囊病毒VP5蛋白的VERO细胞系建立及其转录本分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 pCI-neo-VP5和pEGFP-VP5质粒构建 |
| 1.2 Vero细胞培养、质粒转染及克隆 |
| 1.3 单克隆细胞株PCR和Southern blot鉴定 |
| 1.4 单克隆细胞株RT-PCR和Northern blot鉴定 |
| 1.5 IPMA和IFA检测VP5蛋白表达 |
| 1.6 VP5蛋白表达免疫胶体金定位 |
| 1.7 Vero-VP5细胞LongSAGE文库构建 |
| 1.8 文库标签提取与文库差异分析 |
| 2.结果 |
| 2.1 VP5真核表达载体的构建 |
| 2.2 克隆化细胞系的建立 |
| 2.3 VP5基因在克隆化细胞基因组中的整合分析 |
| 2.4 VP5基因在克隆化细胞中转录分析 |
| 2.5 VP5蛋白在Vero细胞中的表达 |
| 2.6 VP5蛋白在Vero细胞中的表达定位 |
| 2.7 Vero-VP5细胞LongSAGE文库的构建 |
| 2.8 测序结果及初步数据分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 细胞系的建立 |
| 3.2 VP5蛋白功能 |
| 第五章 表达传染性法氏囊病毒PVP2及其截短突变体蛋白的VERO细胞系的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 构建IBDV VP2系列真核表达载体 |
| 1.2 Vero细胞培养及质粒转染和单细胞克隆 |
| 1.3 单克隆细胞株PCR和Southern blot分析 |
| 1.4 RT-PCR和Northern blot检测 |
| 1.5 IPAM和IFA检测VP2蛋白表达 |
| 2 结果 |
| 2.1 IBDV VP2系列重组质粒的构建 |
| 2.2 G418抗性细胞筛选与克隆 |
| 2.3 VP2基因在克隆化Vero细胞基因组中的整合分析 |
| 2.4 克隆化细胞系中IBDV VP2基因mRNA转录检测 |
| 2.5 Vero细胞中VP2蛋白表达 |
| 3 讨论 |
| 第六章 表达传染性法氏囊病毒VP3蛋白的VERO细胞系的建立 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 pCI-neo-VP3真核表达载体的构建 |
| 1.2 Vero细胞培养及质粒的转染和单细胞克隆 |
| 1.3 单克隆细胞株的PCR和Southern blot鉴定 |
| 1.4 RT-PCR和Northern blot检测单克隆细胞株的mRNA转录 |
| 1.5 IPMA检测VP3蛋白表达 |
| 2 结果 |
| 2.1 真核表达载体构建 |
| 2.2 克隆化细胞系的建立 |
| 2.3 VP3基因在克隆化Vero细胞基因组中的整合分析与mRNA转录分析 |
| 2.4 VP3蛋白在Vero细胞中表达 |
| 3 讨论 全文总结 附表 参考文献 第三部分 附录 |
| 附录A 常用试剂及仪器 |
| 附录B 常用缓冲液及培养基配方 |
| 附录C 攻博期间发表或录用的学术论文 致谢 |
四、鸡传染性法氏囊病毒强毒株(vvIBDV)VP_2高变区的替换（论文参考文献）
- [1]广西IBDV的分离鉴定及其两种变异株全基因序列分析及致病性研究[D]. 黄宇. 广西大学, 2021(12)
- [2]传染性法氏囊病病毒变异株分离鉴定及不同系统表达VP2蛋白免疫原性分析[D]. 秦颖. 扬州大学, 2021(02)
- [3]鸡传染性法氏囊病病毒的分离与鉴定[D]. 李松. 福建农林大学, 2015(01)
- [4]IBD天津野毒株的分离鉴定及综合防治[D]. 赵云英. 天津农学院, 2012(11)
- [5]重组IBDV Vp2蛋白的制备与免疫保护试验[D]. 谢怀东. 南京农业大学, 2012(04)
- [6]IBDV地方流行毒株的分离鉴定及生物学特性研究[D]. 官丁明. 广西民族大学, 2010(06)
- [7]我国部分地区传染性法氏囊病分子流行病学研究[D]. 宇文延青. 中国农业科学院, 2008(10)
- [8]鸡传染性法氏囊病病毒强弱毒株的鉴别及VP2基因在大肠杆菌中的表达[D]. 杨蒙. 西北农林科技大学, 2007(06)
- [9]鸡传染性法氏囊病病毒反向遗传操作系统的建立及基因功能研究[D]. 祁小乐. 中国农业科学院, 2007(05)
- [10]传染性法氏囊病毒粒子感染及其A节段编码基因转化细胞的转录本初步分析[D]. 叶菊秀. 浙江大学, 2006(03)