黑龙江省中医医院儿科二/小儿肾病科 150036
【摘 要】目的：探讨当归芍药散对阿霉素肾病幼鼠足细胞的保护作用；方法：4周龄幼鼠40只，分为空白组、模型组、坎地沙坦组及中药组，除空白组外，其余幼鼠以阿霉素建立肾病综合征模型，造模成功后，坎地沙坦组予以坎地沙坦酯片混悬液灌胃，中药组予以当归芍药散水煎浓缩剂灌胃，空白组、模型组分别予以等量生理盐水灌胃，持续4周，4周后观测幼鼠一般状态、生化指标24小时尿蛋白定量、尿素氮、肌酐水平，电镜观测肾小球足细胞情况，免疫组化法测定nephrin、podocin 蛋白表达情况；结果：4周末时模型组幼鼠一般状态差、体重低于空白组、眼睑可见水肿，24小时尿蛋白、尿素氮、肌酐高于空白组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；中药组及坎地沙坦组上述状态略好于模型组，体重、24小时尿蛋白、尿素氮、肌酐等指标均有所改善，与模型组相比，差异有统计学意义（P＜0.05），电镜下空白组可见足细胞排列，模型组足细胞消失，足突融合破坏。4周末时模型组nephrin、podocin低于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05），中药组及坎地沙坦组该指标均有所上升，与模型组相比，差异有统计学意义（P＜0.05），电镜下观测中药组及坎地沙坦组足突破坏缓解。结论：当归芍药散对阿霉素肾病综合征幼鼠具有一定的治疗作用，这种作用可能是通过改善其足细胞裂孔蛋白Nephrin、Podocin表达水平来实现的。
【关键词】当归芍药散；阿霉素肾病；幼鼠；足细胞
[abstract] Objective：To investigate the protective effect of Danggui Shaoyao Powder on podocytes of adriamycin-induced nephropathy in young rats；Methods：Forty four-week-old young rats were divided into blank group，model group，candesartan group and traditional Chinese medicine group. Shaoyaosan Decoction concentrate was given orally，blank group and model group were given the same amount of normal saline for 4 weeks. After 4 weeks，the general state，biochemical indexes，24-hour urinary protein，urea nitrogen and creatinine levels of young rats were observed. The glomerular podocytes were observed by electron microscopy and the expressions of nephrin and podocin were determined by immunohistochemistry. Poor state，lower body weight，eyelid edema，24-hour urinary protein，urea nitrogen and creatinine were higher than those of the blank group，the difference was statistically significant（P < 0.05）；the above-mentioned state of the Chinese medicine group and Candesartan group was slightly better than that of the model group，body weight，24-hour urinary protein，urea nitrogen，creatinine and other indicators were improved，compared with the model group，the difference was statistically significant（P < 0.05）. Under electron microscopy，podocytes were arranged in the blank group，podocytes disappeared in the model group and podocytes fused and destroyed. At the end of the 4th week，nephrin and podocin in the model group were lower than those in the blank group，and the difference was statistically significant（P < 0.05）. Compared with the model group，the index in the Chinese medicine group and the Candesartan group increased，and the difference was statistically significant（P < 0.05）. The foot breakthroughs in the Chinese medicine group and the Candesartan group were observed under the electron microscope. CONCLUSION：Danggui Shaoyao Powder has a certain therapeutic effect on adriamycin nephrotic syndrome in young rats，which may be achieved by improving the expression levels of podocyte cleavage protein Nephrin and Podocin.
[Key words] Danggui Shaoyao Powder，Adriamycin Nephropathy，Young Rat，Podocyte
近年来，小儿肾病综合征（nephrotic syndrome，NS）发病率呈缓慢上升趋势，小儿NS多由感染、免疫功能紊乱等引起，主要症状为水肿，大量蛋白尿，病理改变多为微小病变型[1]。肾小球滤过膜具有三层结构，即内皮细胞、基底膜、足细胞，足细胞受损多出现在肾病早期或微小病变型之中，足细胞损伤后可引起滤过屏障功能的改变，导致蛋白尿的发生[2]。当归芍药散出自《金匮要略》，具有养血调肝，健脾利湿之功效，原文中主治妇人妊娠或经期由肝脾两虚导致的腹痛头晕或下肢浮肿[3]。现代医家并不拘泥于此，而以之治疗多种疾病，笔者尝试以当归芍药散治疗小儿肾病综合征效果较好，现通过实验探讨当归芍药散对NS足细胞的保护作用，成文如下：
1 资料与方法
1.1 实验动物
4周龄雄性SD幼年大鼠40只，体重（210.36±9.67）g，购于黑龙江中医药大学实验动物中心。幼鼠正常饮食饮水，实验室温度控制在20~25℃，湿度50%~60%，氨浓度低于20ppm。实验室每天定时通风，垫料及饲养笼3天更换1次并消毒。
1.2实验药物
当归芍药散所用中药饮片由黑龙江省中医医院药局提供，组成为：当归9g，芍药18g，川芎24g，茯苓12g，泽泻24g，炒白术12g，上述药材以水浸泡1小时后，大火烧开，小火浓缩煎煮3次后取汁混合，水浴浓缩得到总生药浓度为1.5g/mL药液，冷藏备用。坎地沙坦酯片（重庆圣华曦），以蒸馏水制备为20mg/mL混悬液备用。
1.3实验试剂及仪器
阿霉素（合肥巴斯夫），配制为以1mg/ml溶液，2℃保存、水合氯醛（青岛宇龙海藻）配置为10%溶液，4℃保存，兔抗鼠多克隆 podocin 抗体、兔抗鼠多克隆 nephrin 抗体、抗体稀释液均来自南昌博奥森生物科技有限公司，其余基础实验材料及器材均由黑龙江中医药大学实验中心提供。
1.4 动物分组、模型制备及给药方法
40只幼鼠适应性饲养3天，随机分为空白组、模型组、坎地沙坦组、中药组，每组10只，除空白组外，其余3组于实验第4天予以阿霉素造模，剂量参考其他学者文献[4]以6.5mg/kg尾静脉注射，分2次给药，首次予以4mg/kg/只，1周后追加2.5mg/kg/只。大致操作如下：幼鼠禁食12小时后以固定器固定，40℃温水浸泡鼠尾1分钟左右，使鼠尾静脉充盈，碘伏消毒鼠尾皮肤，取内存生理盐水的注射器从腹侧尾静脉远端的1/3处，以15°角刺入皮肤，平行进针，回抽见血，换阿霉素注射液缓慢推注，推注过程中如有渗漏则立即停止给药，尽量将渗出药液挤出，然后更换位置重新进针给药，静注药物完毕后更换推注0.2ml生理盐水冲净针头内药物。空白组予以等量生理盐水尾静脉注射。
2次造模均完成后，间隔1周开始给药，坎地沙坦组予以坎地沙坦酯片混悬液灌胃，中药组予以当归芍药散灌胃，给药剂量参考公式幼鼠剂量（g／kg）=儿童剂量（g／kg）×折算系数（6）[5]，空白组、模型组分别予以等量生理盐水灌胃，灌胃持续4周。
1.5 观察指标
给药4周后，代谢笼留取幼鼠24小时尿，考马斯亮蓝法监测 24 h 尿蛋白定量，水合氯醛麻醉幼鼠，腹主动脉取血后检测尿素氮、肌酐；取肾脏，将肾脏组织学固定后，脱水包埋，电镜下观察足细胞损伤情况，后以免疫组化法测定nephrin、podocin 蛋白表达情况，操作步骤严格依据试剂盒所示进行。
1.6 统计学方法
计数资料采用样本数（百分率）表示，差异性采用卡方检验，计量资料以均数±标准差表示，统计采用t检验，以SPSS20.0分析结果，P＜0.05有统计学意义。
2 结果
2.1一般状态
4周末时各组幼鼠无死亡，空白组幼鼠一般状态及食欲等正常；模型组幼鼠精神倦怠，动作不活泼、食欲减退，皮毛光泽变暗、眼睑可见水肿，四肢末端、耳部、尾部均呈现不同程度的苍白。中药组及坎地沙坦组上述状态略好于模型组。
2.2 体重、生化指标结果
4周末时模型组体重低于空白组，24小时尿蛋白、尿素氮、肌酐高于空白组，差异均有统计学意义（P＜0.05），中药组及坎地沙坦组体重、24小时尿蛋白、尿素氮、肌酐等指标均有所改善，与模型组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）.见表1：
注：1空白组，2模型组，3中药组，4坎地沙坦组
3 讨论
足细胞是肾小球固有细胞之一，它附着于肾小球基底膜外侧，连同和毛细血管内皮细胞一起，共同构成肾小球血液滤过屏障，该屏障的任何改变都可导致蛋白尿的发生，因此，蛋白尿产生的根本即为足细胞损伤[6]。正常足细胞可因各种免疫因子、抗体甚至血流动力学改变而受到损害，这种损害包括形态学改变如足突融合、细胞肥大、细胞凋亡等，也可能包括非形态学的改变如足细胞特异蛋白分子下调和足细胞细胞骨架成分的变化，但无论哪种改变，均会影响肾小球滤过屏障[7]。Nephrin、podocin属于肾小球足细胞裂孔隔膜蛋白[8]，其中Nephrin在肾小球足细胞表达，其减少可导致裂孔隔膜破坏，Podocin是一种支架蛋白，对维持足细胞裂孔隔膜结构和功能的完整性起重要作用，因此二者可以较好地反应足细胞损伤情况[9]。坎地沙坦为血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂，通过与血管平滑肌AT1受体结合而拮抗血管紧张素Ⅱ的血管收缩作用，从而降低末梢血管阻力，小剂量应用具有降低肾小球内压的作用[10]。当归芍药散具有养血调肝，健脾利湿之功效，可治疗肾病综合征水肿脾虚水泛证型，其临床疗效较好。
本研究结果提示，给药4周末时，模型组幼鼠一般状态差，体重低于空白组，并且眼睑可见水肿，出现大量蛋白尿，且尿素氮、肌酐均有轻微升高，Nephrin、Podocin蛋白低于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05），说明阿霉素导致的NS出现足细胞损伤，电镜下空白组可见足细胞排列，模型组足细胞消失，足突融合。而应用当归芍药散及坎地沙坦干预后，两组幼鼠症状、24小时尿蛋白、尿素氮、肌酐等指标均有所改善，与模型组相比差异有统计学意义（P＜0.05），电镜下可见足突融合缓解，可见部分完好足细胞，提示当归芍药散及坎地沙坦对阿霉素幼鼠肾病综合征存在一定程度的缓解作用，同时中药组及坎地沙坦组Nephrin、Podocin均有所上升，与模型组相比，差异有统计学意义（P＜0.05），提示当归芍药散及坎地沙坦可改善肾小球足细胞裂孔蛋白，而其对肾病综合征幼鼠的治疗作用，可能是通过这一途径实现的。
综上所述，当归芍药散对阿霉素肾病综合征幼鼠具有一定的治疗作用，这种作用可能是通过改善其足细胞裂孔蛋白Nephrin、Podocin表达水平来实现的。
参考文献：
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作者简介：张天照（1985-），黑龙江省中医医院儿科二/小儿肾病科，硕士，主治医师。
课题来源：黑龙江省自然科学基金面上项目，编号H2015106。
论文作者:张天照
论文发表刊物:《中国结合医学杂志》2019年5期
论文发表时间:2019/7/26
标签：细胞论文; 芍药论文; 当归论文; 模型论文; 肾小球论文; 空白论文; 统计学论文; 《中国结合医学杂志》2019年5期论文;