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【摘要】 目的 确定CYP2C9、VKORC1、CYP4F2（rs2108622）和EPHX1（rs2292566）基因多态性对中国汉族人群华法林剂量的影响。方法 选择连续三次国际标准化比值（INR）测量结果在治疗范围内服用华法林剂量稳定的患者181例，收集非遗传因素资料，华法林服用剂量及INR值，出血、血栓病史，用药史。抽血分离DNA并通过高分辨熔解技术（PCR-HRM）对CYP2C9，VKORC1，CYP4F2和EPHX1进行基因分型。多因素回归分析来确定遗传和非遗传因素对华法林剂量的影响。结果 除了年龄， CYP2C9、VKORC1和CYP4F2的基因多态性是影响华法林稳定剂??量的显著预测变量，能够解释剂量差异的39.7％。VKORC1和 CYP2C9基因型仍然是华法林剂量的主要预测变量，首次明确CYP4F2（rs2108622）基因型有助于确定中国汉族人口华法林的稳定剂量。结论 服用华法林的患者进行CYP2C9、CYP4F2和VKORC1基因多态性筛查，有助于确定华法林抗凝的初始剂量，减少频繁抽血检测INR的负担，可指导临床抗凝治疗及个体化用药。
【关键词】华法林；CYP2C9；CYP4F2；VKORC1；EPHX1
【中图分类号】R492.5【文献标识码】A【文章编号】1001-5213(2016)09-0253-02
华法林（warfarin）是临床上最常用的香豆素类口服抗凝药物，主要用于预防和治疗血栓性疾病。临床上使用的华法林是S-华法林和R-华法林的消旋体混合物。其中，S-华法林（左旋华法林）是消旋华法林片剂的主要有效成分，其抗凝活性是R-华法林的3～5倍，主要经CYP2C9酶催化代谢[1]。VKORC1蛋白是华法林作用靶点，华法林通过抑制维生素K环氧化物还原酶的活性从而阻碍维生素K依赖性凝血因子的活性来发挥抗凝效应。目前国内外关于CYP2C9和VKORC1基因对华法林剂量的影响已经得到证实[2]。近来，国外研究发现了很多影响华法林剂量的新候选基因[3]以及非遗传因素如年龄、性别、体重、体表面积、联合用药、饮食习惯和合并症等。国内这方面的研究尚未成熟，因此本研究选择了最新研究显示与华法林稳定剂量有明显相关性的CYP4F2基因、EPHX1基因，收集了患者的非遗传因素资料，探讨除了CYP2C9 和 VKORC1基因外，CYP4F2和EPHX1及一些非遗传因素与中国汉族人群华法林剂量的关系以确定华法林抗凝的初始剂量，减少频繁抽血检测INR的负担，指导临床抗凝治疗及个体化用药。
材料和方法
1.研究对象
选我院接受华法林治疗的房颤、深部静脉血栓形成及心脏瓣膜置换术后的中国汉族患者247例。
纳入标准：?服用华法林的时间至少4个月。?服用剂量相同的情况下连续三次国际标准化比值（INR）测量结果在治疗范围内。
排除标准：?肝功能异常、癌症、先心病、肝脏疾病、出血性疾病。?接受以下可能与华法林相互作用的药物，如抗癫痫药物、 抗结核药物、抗生素、氟康唑、巴比妥类药物和口服避孕药。?近4周内住院治疗过的患者。
依据以上标准，247例患者中66例被剔除，最后选择的181例患者收集年龄，体重，身高，性别，吸烟，喝酒，肉、蔬菜、水果摄入量，每天华法林服用剂量及INR值。自愿参加研究的患者填写知情同意书。
2.研究方法
1） 基因组DNA的提取
抽取枸橼酸钠抗凝静脉血2.7ml，在24小时内提取基因组DNA，-40℃保存。使用北京百泰克生物公司的全血基因组DNA提取试剂盒，具体操作严格按照试剂说明书进行。为了保证试验的准确性和可靠性，提取的基因组DNA在一周内进行检测。
2） 基因分型
使用Rotor—Gene 6000荧光定量PCR仪(澳大利亚Corbett Research公司)进行基因分型。PCR反应体系总体积15μL，其中Mg2+ 3.0mM； Realstart Taq DNA Polymerase 0.75U；dNTPs 0.8mM；Eva Green 0.5μL；正、反引物均为0.5μM；基因组DNA 10ng。PCR反应采用两步法45个循环扩增，预变性95℃3 min，CYP2C9*2和CYP2C9*3：95℃ 5s，62℃ 15s；CYP4F2 V433M、VKORC1 1173C/T和EPHX1：95℃ 5s，60℃ 15s，最后进行72℃ 2 min延伸。
PCR结束后进行95℃ 5s，50℃ 30s预杂交程序，然后从80℃开始熔解到90℃结束，温度变化速率为0.1℃/sec。应用软件(Rotor Gene 6000 1.7)进行实时数据检测和分析，依据熔解曲线和熔解峰进行基因分型，野生型和纯合突变型熔解峰为单峰，杂合突变型为双峰。
3.统计分析
对于遗传变量，我们编码CYP2C9、VKORC1、CYP4F2和EPHX1编码为0（野生型），1（杂合型），2（纯合型）。不同基因型分组间华法林剂量差异比较用单因素方差分析。
对于非遗传因素如年龄，身高，体重，香烟数目，每日肉、蔬菜、水果摄入量与华法林剂量间的相关性用Pearson检验，饮酒和性别与华法林剂量的相关性用t检验。
最后，遗传因素和非遗传因素对每日华法林剂量的影响使用多因素回归模型，以P<0.05有统计学意义，以上统计在SPSS 19.0软件上完成。
结 果
181例患者（女75例、男性106例，平均年龄51.34±14.17）的血液样本中分离基因组DNA，近三次INR值都在2.0到3.0的范围内，华法林每日平均剂量为2.88±0.95mg（范围1.03mg-6.56mg）。
应用PCR-HRM技术检测181例临床标本的5个SNP位点VKORC1（1173C/T rs9934438）、CYP2C9* 2（rs1799853）、CYP2C9* 3（rs1057910）、CYP4F2（rs2108622）和EPHX1（rs2292566），结果CYP2C9*2位点只有2例CT（杂合突变型），其中1例（53岁）华法林剂量为4.375 mg，另外1例（70岁）为1.875 mg，其余均为CC（野生型）。因CT型例数很少，无法进行统计学处理，有待扩大标本量进一步研究。除了EPHX1（rs2292566），其他SNP位点的不同基因型间华法林每日剂量存在显著差异。结果见表1。
CYP2C9*3和VKORC1 1173C/T与华法林的稳定剂量有明显的相关性，携带两个突变等位基因者所需华法林的剂量明显减少（CYP2C9P = 0.001，VKORC1 P = 0.002），与之前报道一致。对于CYP4F2基因，国内有研究显示其对华法林剂量影响不大，我们发现CYP4F2不同基因型对华法林稳定剂量也有明显的影响。患者野生型CYP4F2（CC）所需的华法林日平均剂量为2.80mg，而具有一个或两个变异等位基因者需要较高剂量2.84（CT）和3.52（TT）。有研究显示EPHX1（rs2292566）基因差异对华法林剂量的调整有显著的贡献，而在我们的研究中没有观察到这样的效果。
除了遗传因素，181例患者八个非遗传因素与华法林维持剂量之间的关系见表2。在这些变量中，年龄的变化对华法林每日维持剂量有明显的影响，P值< 0.031。
把p值<0.05的协变量引入回归模型进行统计，结果显示CYP2C9，VKORC1和CYP4F2的基因型和年龄共解释了华法林剂量个体差异的39.7％，其中CYP2C9占19.2％，VKORC1为14.8％，CYP4F2（rs2108622）为2.9％，年龄为2.8％，见表3。
讨 论
国内外对于影响华法林剂量的基因主要集中在CYP2C9和VKORC1。对于CYP4F2基因，国外研究发现，多态性位点V433M[rs2108622]是一种与华法林的药物遗传学相关联的新突变体[4]。但是，本研究发现CYP4F2 V433M基因型同样对中国汉族人华法林的剂量有影响，能够解释华法林剂量差异的2.9％，而且首次证实了CYP4F2 433M携带者（TT型）所需华法林剂量较高的报道。VKORC1基因变异能解释约15％的个体剂量间的差异，低于国外其他研究报告的数据（20-35％）。CYP2C9 * 3能够解释剂量差异的19％，之前的研究结果是CYP2C9多态性占剂量差异的8％和13％ [5]，本研究与其一致，并证实了CYP2C9和每日华法林的剂量之间的确切关系。CYP2C9，VKORC1，CYP4F2基因型的差异和年龄因素共解释了华法林剂量差异的39.7％。
最新的国外研究显示编码微粒体环氧化物水解酶的基因EPHX1 rs2292566，是一个新的对高加索人群华法林维持剂量有显著影响的基因[6]。但本研究显示EPHX1基因多态性与华法林剂量间无显著相关性， P值分别为0.043、0.614，可能与研究人群的种族有关。需要进一步研究EPHX1基因的其他SNP位点对中国汉族人群华法林剂量的影响。
除了遗传因素，非遗传因素中年龄作为影响华法林每日维持剂量的因素，年龄每增长十年，华法林的每日维持剂量降低8-10％，可能是由于清除率的降低和或者反应性的增加[7]本研究也证实年龄与华法林的维持剂量有相关性（P <0.05），能够解释华法林剂量差异的2.8％。但与之前的研究相比，影响相对较小，可能与本研究对象的年龄偏小有关。
理论上，大量摄入脂溶性维生素K通过抑制维生素K干扰凝血，能降低了华法林的剂量[8]，但本研究中没有发现饮食因素与华法林维持剂量之间的关系，这与之前的研究结果不一致。探讨饮食因素与华法林剂量之间的关系，还需要更多的对照研究。其他非遗传因素中，有报道显示患者的身高和体重，在调整华法林的剂量时有作用，然而，本研究无显着性差异，P值分别为0.82和0.24。
药物遗传学，一门相对年轻的学科在改善药物的安全性和有效性方面很有潜力。华法林具有非常窄的治疗指数，一直是药物遗传学的目标药物之一。迄今为止，很多研究证明了几个遗传、非遗传因素与华法林稳定剂量间的相关性。本研究显示，CYP2C9和VKORC1 1173C/T基因型突变，以及年龄仍然是预测华法林剂量的决定性因素，另外惊奇的发现CYP2C9的影响比VKORC1还大，这可以解释为平均年龄较低的影响。此外，第一次证实CYP4F2（rs2108622）基因的突变对中国汉族患者华法林的维持剂量有显著的影响。考虑到不同种族间华法林药理学的差异，本研究在华法林剂量的调整上获得的知识增加到临床指南和计算公式中有益于确定中国汉族人群华法林抗凝的初始剂量，减少了频繁检测INR的负担，并通过减少抗凝过度导致的出血风险而提高了用药的安全性。
参考文献：
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论文作者:王芳芳1 尤崇革 2李菲菲2 郜莉娜2
论文发表刊物:《中国医院药学杂志》2016年9月
论文发表时间:2016/11/2
标签：剂量论文; 基因论文; 因素论文; 汉族论文; 年龄论文; 患者论文; 差异论文; 《中国医院药学杂志》2016年9月论文;