(荆门市第一人民医院神经内科,湖北448000)
【摘要】 目的：探讨在单纯疱疹病毒性脑炎中柯里拉京对PD-1及其相关分子表达的影响并检测其相应的病理改变。方法：采取颅内注射1型单纯疱疹病毒的方法在Balb/c小鼠中诱导单纯疱疹病毒性脑炎的动物模型。 本实验分为4组：生理盐水组，病毒感染组，地塞米松组，和柯里拉京组。采用Western-blot法检测脑组织中PD-1, PD-L1, 和Foxp3的表达变化，并且采用HE染色法检测相应的神经病理。结果：与生理盐水组相比，小鼠脑组织中PD-1，PD-L1和Foxp3的表达量在病毒感染组中明显降低（P<0.05）。与病毒感染组相比，柯里拉京组这三个分子的表达量均升高（P<0.05）。此外，柯里拉京组脑内的病理变化如出血和坏死等与病毒感染组相比均明显减轻。 结论：在单纯疱疹病毒性脑炎小鼠动物模型中，PD-1，PD-L1和Foxp3的表达下调；而柯里拉京治疗可以升高这三个分子的表达并改善相应的病理改变。
【关键词】 单纯疱疹病毒脑炎，PD-1， PD-L1, Foxp3，柯里拉京。
The Effect of Corilagin Treatment on the PD-1/PD-L1 expression in Herpes Simplex Encephalitis in Mice
Liangyan Pei, Department of Neurology, The First People’s Hospital of Jingmen, Jingmen, 448000.
【Abstract】 Objective: To investigate the effect of corilagin treatment on the expression of PD-1, PD-L1, and Foxp3 in the herpes simplex encephalitis (HSE) in mice, and to determine the associated neuropathology. Methods: HSE was induced by intracranial injection of herpes simplex virus type 1 (HSV-1) in Balb/c mice. Mice were allocated into four groups: the saline-treated group, the HSV-1-infected group, the dexamethasone-treated group, and the corilagin-treated group. Western-blotting was used to detect the expression of PD-1, PD-L1, and Foxp3 in the brain lesions of mice. In addition, HE staining was used to determine the HSE-associated neuropathology. Results: The protein level of PD-1, PD-L1, and Foxp3 in the brain lesions of the HSV-1-infected group were significantly decreased compared with the saline-treated group (p<0.05), and were markedly increased in the corilagin-treated group (p<0.05). Moreover, the HSE-associated neuropathology, such as hemorrhage and necrosis, was also attenuated after corilagin treatment. Conclusions: Corilagin treatment could significantly up-regulate the expression of PD-1, PD-L1, and Foxp3 and improve the associated neuropathology in HSE in mice.
【Key words】: herpes simplex encephalitis, Corilagin, PD-1, PD-L1, Foxp3.
前 言
单纯疱疹病毒性脑炎(Herpes simplex virus encephalitis，HSE)是一类常见的散发性致死性脑炎,在我国具有较高的发病率 [1]。据统计，大约90%的患者是由脑内1型单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus type 1, HSV-1）感染引起。尽管目前临床上阿昔洛韦等抗病毒药物的使用，在HSE患者中仍有高达20%的死亡率，而在幸存的患者中，仅仅有38%的病人能够恢复正常的功能[2]。因此，因此HSE具有病情严重，高死亡率，和高致残率的特点，而研究HSE的发病机制或者寻找能够改善病情的药物具有重要的意义。
柯里拉京(Corilagin)为叶下珠等植物的有效成分之一，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、溶栓、抗动脉硬化、保肝及抗高血压等多种功效。我们前期的一系列实验也证明柯里拉京在单纯疱疹病毒性脑炎中具有改善病情的作用，但是其具体的机制尚未明确。
程序性死亡受体-1(programmed death-1,PD-1), 是新发现的共抑制分子。PD-1与其配体结合后抑制免疫反应，在炎症反应中发挥着负向调控作用。PD-1在体内广泛表达，在脑内主要表达在小胶质细胞和星形细胞上[4]。目前研究发现，PD-1及其相关分子在多发性硬化，脑血管疾病等疾病中具有重要的作用。而在单纯疱疹病毒性脑炎中，关于PD-1及其相关分子的研究还未报道。
本实验的主要目的是研究在单纯疱疹病毒性脑炎中PD-1及相关分子的表达及使用柯里拉京治疗后对其表达的影响。本实验对探讨柯里拉京的作用机制具有一定的意义。
材料与方法
1材料
1.1 HSV-1由武汉协和医院病毒室提供。
1.2动物 3周龄Balb/c雄性小鼠20只，体重11-13g，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心。
1.3药物 柯里拉京(corilagin)标准品购自国家药品与生物制品检定所(北京)。地塞米松购自浙江仙琚制药股份有限公司（浙江）。
2方法
2.1动物模型 小鼠10%水合氯醛(3.5 ml/kg)腹腔注射麻醉后，从右侧眼角与外耳道口连线中点处进针2-3mm直接颅内注入HSV-1制造HSE模型。感染组及治疗组均注入100LD50(10-3/20ul)病毒悬液20μl，生理盐水组注入细胞培养上清液20μl。
2.2 动物分组及给药 实验小鼠20只，随机分成生理盐水组、感染组、地塞米松组 (20ug/只)、柯里拉京组 (0.4mg/只)，每组5只。实验小鼠于造模后第一天起开始灌胃给药，灌胃前后12h所有动物均禁食不禁水，连续用5d。感染组及生理盐水组都给予等体积的生理盐水灌胃，连续用5d。第5天断头取脑组织进行病理切片及提取蛋白质做Western-blot。
2.3蛋白提取．用剪刀剪取约0.5mg组织，置于组织匀浆器中，加入1ml总蛋白提取液，匀浆5min~20min直到组织充分破碎,然后冰上放置10~20min后，再匀浆5min~20min,将匀浆液吸出放到1.5ml离心管中。超声3次，每次3s，9000rpm，离心10min，取适量上清置于新的1.5ml离心管中，-20℃冻存备用。
2.4脑组织总蛋白的提取进行12%SDS-PAGE电泳，然后用半干式转移槽将胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上然后做免疫反应。首先用10%脱脂奶粉封闭1 h再用PBS洗涤2次接着加各目的蛋白的一抗室温摇床上2 h，用PBST在摇床上反复洗4次加酶标的二抗室温作用2 h，用PBST在摇床上反复洗4次，做化学发光（ECL），采用光密度图像扫描仪对得到的胶片进行扫描，再用Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析，测其累积光密度（integrated optical density, IOD）值。
1.2.5统计学分析：所有的数据均用SPSS 13.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差（mean±SD）表示。采用单因素方差分析（one-way analysis of variance, one-way ANOVA）进行检验，以P<0.05表示为差异具有统计学意义。
2结果
2.1 小鼠生存状况
各组小鼠在HSV-1感染后的14天内作为生存率的观察，对照组的小鼠到第14天结束时均存活，病毒组的小鼠在病毒感染后的第3天开始发病，表现为精神萎靡不振、耸毛、蜷缩、抽搐、低反应性，症状在第4-5天达到高峰，最后死亡，14天结束时病死率为100%。
2.2脑组织切片HE染色
与生理盐水相比，感染组PD-1,PD-L1,Foxp3的表达都降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。
*表示P<0.05,与感染组相比，地塞米松组和柯里拉京组PD-1,PDL1,Foxp3的表达都增加，具有统计学差异，且柯里拉京组比地塞米松组增加更明显。
讨论
单纯疱疹病毒性脑炎又称急性出血坏死性脑炎，是病毒性脑炎中常见的一类。单纯疱疹病毒是一类嗜神经病毒，它可沿神经分布或血液循环直接进入中枢神经系统，引起神经元或神经胶质细胞的破坏，以及神经细胞的脱髓鞘改变和血管的损伤，导致脑组织的缺血、缺氧和脑细胞的损伤；同时导致脑组织的免疫损伤，表现为小胶质细胞的活化、巨噬细胞的浸润以及特异性的T淋巴细胞的聚集，释放大量的细胞因子。这表明HSE的发生发展不仅与病毒的直接损伤有关，而且还与病毒诱导的自身免疫损伤有着密切关系。
PD-1 又称CD279，和PD-1配体（PD-L1）隶属于B7-CD28家族，是目前新发现的共抑制分子。PD-1与其配体结合后抑制免疫反应，维持自身免疫耐受。PD-1是一个Ⅰ型跨膜的糖蛋白，分子量为55KD，在许多细胞上都有表达，如CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK T细胞，激活的单核细胞[3]。PD-L1属于B7家族，又称为B7-H1，它的分子量约为40KD，主要表达在B细胞，巨噬细胞，树突状细胞和T细胞的表面。还表达在一些非血液来源的细胞上如肾小球上皮细胞，心肌细胞，肿瘤细胞，神经胶质细胞，胰岛细胞和发炎的肌肉细胞以及角质细胞，并且在一些免疫特惠区，如眼部及胎盘也有表达。PD-1及其配体在正常的脑组织中也有表达，主要表达在小胶质细胞和星形细胞上[4]。本实验结果示在生理盐水组的小鼠脑组织中也有PD-1和PD-L1的表达，证实了这一观点。
目前关于PD-1/PD-L1的研究主要集中在自身免疫系统疾病、慢性病毒感染、肿瘤及移植免疫等方面。在HBV，HCV，HIV等感染时，有效而强大的T细胞免疫是清除病毒的关键，但是病毒感染的持续性和慢性化使PD-L1表达明显增高，导致T细胞功能减弱，甚至耗竭，尤其是CD8+T细胞，造成病毒的持续感染，患者的预后不良 [5]；但是，PD-1/PD-L1的表达的上调可有效防止炎症反应造成的免疫损失[6]。在实验性自身脑脊髓炎的小鼠模型中（一种广泛应用的多发性硬化的实验动物模型），阻断PD-1/PD-L1的通路后，疾病更严重[7]，在非肥胖型糖尿病小鼠模型（是一种人类1型胰岛素依赖型糖尿病模型）中，通过阻断PD-1/PD-L1的通路后，小鼠形成糖尿病的速度加快；在移植免疫中，研究发现增加PD1/PD-L1的表达在延长移植物的存活方面有很好的作用，这为移植免疫提供了一个新的治疗靶点[8]。
最近研究表明，在急性感染中PD-1/PD-1配体抑制性信号途径的作用更复杂。急性感染中效应T细胞和记忆性T细胞的产生有四个步骤：①T细胞特异性识别抗原阶段；②T细胞的活化，增值和分化阶段；③效应T细胞的产生和效应阶段；④记忆性T细胞的产生。抑制性信号如PD-1/PD-L1在每个阶段都起着一定的作用[9]。在正常的中枢神经系统中也有PD-1和PD-L1表达，主要在小胶质细胞和星形细胞上，它参与维持中枢神经系统的免疫耐受。例如在急性感染狂犬病毒的小鼠，PD-1/PD-L1的相互作用降低CD8+T细胞的作用，从而减轻了小鼠脑组织的免疫病理损伤。本实验示当实验小鼠感染单纯疱疹病毒后，小鼠脑组织中PD-1和PD-L1表达量下降，并且H-E染色显示脑组织中大量炎性细胞的浸润，血管破坏和组织坏死，这说明小鼠在急性感染单纯疱疹病毒后下调PD-1和PD-L1的表达，这是HSE免疫损伤的一个作用机制。当给予柯里拉京治疗，可以通过上调PD-1和PD-L1的表达，减轻脑组织的病理损伤，改善预后。
调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）具有介导免疫耐受和抑制有功能的T细胞的作用，同时也有抑制免疫诱导的组织损伤的作用。它主要分为两类:自然形成的调节性T细胞（nTreg）和诱导形成的调节性T细胞（iTreg）。nTreg主要在胸腺中产生，iTreg主要在周围组织中产生。Foxp3（factor forkhead boxp3）是Treg细胞的一个表面分子[10]。在HIV中Foxp3是疾病严重性和预后不良的标志。PD-1/PD-L1可通过抑制Akt/mTOR的信号通路让Foxp3持续表达和升高，导致T细胞功能减退。本实验说明当小鼠感染单纯疱疹病毒后，脑组织中Foxp3表达下降，当给予柯里拉京干预，通过升高PD-1和PD-L1的表达量，同时Foxp3的表达量也升高，减轻脑组织免疫损伤，这是柯里拉京改善单纯疱疹病毒脑炎的一个作用机制。
本实验的初步研究证明在单纯疱疹病毒性脑炎动物模型中PD-1, PD-L1, 和Foxp3的表达降低，而使用柯里拉京干预后这三个分子的表达升高，同时脑组织的免疫病理损伤减轻，上调PD-1等相关分子的表达可能是柯里拉京发挥保护作用的潜在机制。
参考文献
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10 Fontenot J.D., Gavin M.A., Rudensky A.Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nat. Immunol.2003.4:330–336.
论文作者:裴良艳
论文发表刊物:《中国医学人文》2015年第9期供稿
论文发表时间:2015/11/6
标签：细胞论文; 小鼠论文; 脑炎论文; 疱疹论文; 组织论文; 免疫论文; 病毒论文; 《中国医学人文》2015年第9期供稿论文;