熊红[1]2003年在《阿克拉霉素对骨髓增生异常综合征细胞株（RAEB型）细胞作用的体外实验研究》文中指出众所周知，骨髓增生异常综合征(Myelodysplastic syndrome，MDS)难治，尤其是高危MDS。原因可能与MDS恶性克隆对药物作用的敏感性降低有关。目前，MDS的治疗目的是消除或减少瘤细胞克隆，部分或完全重建正常造血，或诱导异常细胞向正常细胞分化成熟。为研究MDS细胞对药物治疗的反应，我们引进了对各种常用的分化诱导剂均无反应的MDS-RAEB型细胞株MUTZ-1。已有研究表明，以拓扑异构酶Ⅱ为作用靶点的第二代蒽环类抗肿瘤药物——阿克拉霉素(aclacinomycin，ACM)治疗某些MDS患者有效。体外实验研究表明，与其它的抗肿瘤剂相比，更不容易产生耐药性，其机理尚不明确。本文旨在研究ACM对MDS-RAEB型细胞株MUTZ-1细胞的体外治疗效应及其新的作用机理。试图证明ACM可诱导MUTZ-1细胞凋亡及(或)向成熟分化，以减少MDS恶性克隆；并试图阐明ACM抗MDS细胞的又一分子机制，从而为克服MDS细胞对化疗药物的耐受寻找新的治疗靶点，为设计新的治疗策略拓宽思路。 采用MTT比色法检测结果显示，0.05μmol/L ACM处理48h，即明显抑制MUTZ-1细胞的增殖，与空白对照组相比，差别有统计学意义(p＜0.05)。ACM作用48h的半数抑制浓度(IC_(50))为0.46μmol/L。为探讨这种抑制作用的机制，我们从细胞凋亡及细胞分化两个层面作了进一步的研究。 在体外，本研究采用瑞特-姬姆萨染色，光学显微镜观察ACM作用前后MUTZ-1细胞形态，结果显示，0.5μmol/L ACM处理后，MUTZ-1细胞出现凋亡细胞典型的形态学特征， 浙江大学博士学位论文如胞浆空泡化，细胞体积缩小，核染色质固缩，核边聚，染色质断裂，出芽，凋亡小体形成等（图I－2）。 为了对细胞凋亡现象进行准确地定性或定量分析，我们采用多种经典、特异而敏感的实验指标，并利用近年来发展起来的流式细胞分析技术研究了细胞DNA含量、亚二倍体及磷脂酞丝氨酸（PS）转位。结果显示，0．25Pmol／L－0．SPmol／L ACM作用 48h，可见典型的 DNA梯形条带：采用 DNA片断原位末端（TLINEL法）标记方法证明，在一定的作用时间点，随ACM浓度的增加，TUNEL阳性细胞也增加；一定的药物浓度范围内，随ACM作用时间延长，TUNEL阳性细胞增加。从生物化学角度进一步证明，在体外，ACM能诱导MUTZ—l细胞凋亡，且呈剂量一，时间一效应依赖关系。 采用流式细胞仪分析技术探讨了ACM作用前后MUTZ－1细胞DNA含量及亚二倍体的改变。结果显示，0．in mol／L l．2卜mol／L ACM处理后，MUTZ－1细胞周期 G。／M期细胞增多，GllG。期细胞减少，细胞被阻滞于GZ／M期。同时亚二倍体细胞增多，MUTZ－l细胞亚GI期峰更明显（图1．小表明，ACM可能通过阻滞MUTZ－l细胞于细胞周期的GZ／M期，最终导致MUTZ－l细胞凋亡。进一步采用AnnexinV－PI双标记法流式细胞仪分析，结果显示，o．印（、！几＊＊M作用36h，早期凋亡细胞百分数（2！．83叨高于空白对照组（3．n叨；晚期凋亡细胞在处理组仅稍高于空白对照组（厂9％VS 2．65％）。表明，一定浓度 ACM作用一定时间，主要是诱导MUTZI细胞发生早期凋亡（图1．8）。 为研究ACM诱导MUTZ－！细胞凋亡的可能机制及信号传导途径，本研究采用转染报告基因载体pNF。B－SEAP后化学发光测定法分析ACM作用前、后核转录因子NF。B活性水平，并用 RT－PCR法在转录水平检测其调控的靶基因 clAPI及 clAPZ mRNA表达的改变；WCstern blot法检测 ACM作用前、后 NF。B抑制蛋白质 I。B a水平表达的改变，并探讨了ACM较少产生耐药性的可能原因。 研究结果显示，一定浓度 ACM（0．5 u mol／L）处理 MUTZ－l细胞不同时间（3h、6h、12h、24h），导致了抗凋亡基因 clAP－l、cIAPZ mRNA表达水平以时间依赖的方式降低，并与MUTZ－l细胞TUNEL阳性细胞百分数呈负相关（rs－0．991，－0．975）；不同浓度ACM（0叁卜mol／L十0 u mol／L）处理 24h，可引起 MUTZ－l细胞 cIAPI、cIAPZ mRNA表达以浓度依赖的方式下调，并与其TUNEL阳性细胞百分数呈负相关（，－0．984，－0．951）。说明ACM诱导MUTZ－l细胞凋亡与抗凋亡基因 clAPI、cIAPZ mRNA表达下调有关。 3 浙江大学博土学位论文 迢过瞬时转染报告基因载体pNF。B－SEAP后化学发光法检测培养上清液中报告基因表达产物 SEAP活性，其活性代表相应转录因于 NF。B活性。结果显示，0．sapOUL ACM作用 3h，MUTZ一！细胞 SEAP活性（8．72土 2．88）较同一时间点空白对照组（1184士 3．11）的为低（cd．2 12，Pq）刀42）；0．SPmol／L ACM作用 6h时，MUTZ—l细胞 SEAP活性与在相应时间点的空白对照间的差异非常显着（P＜0刀1），0．5卜m＊儿＊＊M作用至24卜时，细胞％AP活性己降至相应空白对照组的二．9％。因此，0．5卜mol／L ACM作用 MUTZ—l细胞 3－24h，以时间依赖方式抑制报告基因SEAP活性，当0门卜mol／L ACM处理24h，MUTZ—l细胞SEAP活性（11．84士2．67?
丁伟荣[2]2004年在《骨髓增生异常综合征患者骨髓血管新生及抗血管新生药物作用机理研究》文中指出血管新生是指从已存在的血管床中产生的新生血管系统。此过程是一个极为复杂的病理生理过程，受到许多正性及负性血管新生调节因子的共同调控。大量研究表明，肿瘤的发生和发展都伴有新的毛细血管生成，抗血管新生治疗可以使肿瘤进入休眠状态或停止进展。近年来研究表明，血液肿瘤性疾病和实体瘤一样，存在血管新生，并日益受到关注。 骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes，MDS)属造血系统异质性克隆增殖性疾病。在疾病演变过程中，部分MDS发展为急性白血病。MDS患者骨髓中是否也存在血管新生，已引起少数学者的关注。国外已有文献报道，MDS患者骨髓微血管数明显高于正常对照组。但对于MDS患者骨髓微血管数是否低于急性髓性白血病，研究结果并不一致。 在多种参与肿瘤血管形成的细胞因子中，血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是作用最强、特异性最高的促血管新生因子，在肿瘤的血管形成中起着重要的作用。MDS患者体内VEGF和bFGF水平是否增高?多篇国外文献报道了相互矛盾的结果，尚未得出明确的结论。 1994年，福尔克曼工作组报道，肽咪哌啶酮(Thalidomide，反应停)能抑制血管新生。有人认为，该药通过产生氢氧基等发挥抗血管新生作用，但其具体作用环节尚不完全清楚。该药已在临床用于治疗难治性、复发的多发性骨髓瘤和MDS，临床疗效尚佳。但其作用的确切机制尚不清楚，可能在一定程度上应归功于其抗血管新生作用。肽咪哌啶酮是通过抑制骨髓原始细胞增殖及其促血管新生基因表达，还是通过抑制骨髓微环境中血管内皮细胞增殖及其血浙江大学博士学位论文管新生相关基因表达，从而发挥其抗血管新生作用。目前尚未见报道。 本研究共分叁部分:一、骨髓增生异常综合征患者骨髓血管新生初步研究:二、骨髓增生异常综合征促血管新生因子研究;叁、抗血管新生药物作用机理的体外研究。 为探讨MDS患者骨髓是否存在血管新生，及其与患者临床特征的关系，我们采用免疫组织化学方法(兔抗人凝血因子vm相关抗原多克隆抗体，Factor姗一related Antigen，vonwillebrand Faetor，vWF)标记了38例MDS、15例急性髓细胞性白血病(AML)和15例正常人骨髓组织内血管内皮细胞。在光学显微镜下(X 400视野)计数骨髓切片全片中微血管数，计算平均值，表达为微血管数/x400视野，结果显示，肋S组骨髓微血管数(17士2支/X400视野)高于正常人对照组(7士2支/x400视野)(P<0.001)，但低于胡L组(24士4支/x400视野)(P<0.001)，其中MDS低危组与高危组骨髓微血管密度差异无统计意义(P>0.05)。MDS患者骨髓微血管数与骨髓原始细胞百分数、外周血白细胞、血小板数及血红蛋白水平等无明显相关关系(P值均>0.05)。研究结果表明，MDS患者骨髓存在明显的血管新生。提示血管新生在MDS发病机制中可能起到重要的作用。 为探讨MDS患者骨髓微血管数与促血管新生因子VEGF和bFGF基因表达水平的关系，对MDS患者骨髓单个核细胞VEGF mRNA和bFGF mRNA、骨髓浆液和骨髓单个核细胞培养上清的VEGF和bFGF蛋白质含量等进行了检测和分析。 采用RT一PCR方法检测了37例MDS骨髓单个核细胞VEGF mRNA表达水平。结果显示，33例阳性(8 9.2%)，4例阴性(均为RA类型)。15例正常人中n例(7 3.3%)骨髓单个核细胞VEGF mRNA表达阳性，4例阴性。两组间骨髓单个核细胞VEGF mRNA阳性表达频率的差异无统计意义(P>0.05)。且MDS和正常对照组骨髓单个核细胞vEGF mRNA相对表达量的差异无统计意义(I .06士0.70 vs 1.10士1.07，P>0.05)，MDS高危组和正常对照组骨髓单个核细胞VEGF mRNA相对表达量，差异亦无统计意义(1.30士0.67 vs 0.92士0.69，P>0.05)。 同时，采用RT一PCR方法检测了37例MDS患者骨髓单个核细胞bFGF mRNA表达情况。结果显示，32例(8 6.5%)阳性，5例阴性〔均为RA类型);15例正常人中12例(8 0.0%)阳性，3例阴性:两组间骨髓单个核细胞bFGF mRNA阳性表达频率无明显差异(P>0.05)。进一步分析结果表明，MDS患者骨髓单个核细胞bFGF mRNA相对表达量高于正常对照组，差异具有高度统计意义(0.84士0.65 vs 0.38士0.25，P二0.006)。研究结果表明，MDS骨髓单个核细浙江大学博士学位论文胞bFGF mRNA呈过表达。提示，bFGF基因表达在MDS患者骨髓血管新生调控中可能起着重要的作用。 采用ELISA法检测了39例MDS骨髓浆液VEGF蛋白质表达水平，结果显示，姗S和AML患者骨髓浆液VEGF蛋白质表达水平分别为1 10.9士85.3 pg/ml、256.4士164.6 pg/m1，均明显高于正常对照组(44.6士32.gpg/ml)(P值分别为0.003和0.000)，且MDS组低于AML组(P=0.000);但MDS低危组(224.0士98.spg/ml)和高危组(88.4士50.gpg/ml)之间的差异无统计意义(P>0.05)。同时检测了这些MDS患者骨髓浆液bFGF蛋白质表达水平，结果显示:MDS和ALML患者骨髓浆液bFGF蛋白质表达水平分别为43.1士52.0 pg/ml、32.3士25.lpg/ml，均明显高于正常对照组(15.8士7.3pg/ml)(P值分别为0.003和0
参考文献：
[1]. 阿克拉霉素对骨髓增生异常综合征细胞株（RAEB型）细胞作用的体外实验研究[D]. 熊红. 浙江大学. 2003
[2]. 骨髓增生异常综合征患者骨髓血管新生及抗血管新生药物作用机理研究[D]. 丁伟荣. 浙江大学. 2004