王道杰[1]2003年在《油菜单显性核不育基因的分子标记及其辅助选择研究》文中研究表明雄性不育是杂种优势利用的主要途径之一。油菜雄性不育可分为两类：一种是由核基因控制的核不育（ＧＭＳ ｏｒ ＮＭＳ）；另一种是由核质互作控制的细胞质不育（ＣＭＳ）。核不育类型多，不育彻底、稳定，选育较为容易，所以利用核不育系配制杂交种，已成为油菜杂种优势利用的重要途径之一。找到与核不育基因紧密连锁的分子标记可以用于育种工作的辅助选择，以达到间接选择的目的。 本研究以陕西省杂交油菜研究中心培育的单显性核不育油菜分离群体为材料，对单显性核不育油菜的育性、花器性状进行了调查；对其遗传规律和利用途径进行了探讨；优化了 ＲＡＰＤ 标记程序；利用集群分离法（ＢＳＡ）分子标记策略，找到了与单显性核不育基因连锁的 ＲＡＰＤ 标记，对该不育类型的不育机理进行了推测，并探讨了此 ＲＡＰＤ 标记用于标记辅助选择的可行性。主要结果如下： １． 单显性核不育油菜不育株的花瓣较小，雄蕊严重退化，无花粉。雌蕊发育正常。 ２． 通过育性调查及多年遗传试验资料分析推断，该不育性状受一对显性核基因控制，其遗传模式如下： 不育（Ｍｓｍｓ）Ｘ 可育（ｍｓｍｓ） １ 可育（ｍｓｍｓ）：１ 不育（Ｍｓｍｓ） 可育（ｍｓｍｓ） ⊕ 可育（ｍｓｍｓ） ３． 研究了不同 ＤＮＡ 提取方法所提 ＤＮＡ 的质量及其对 ＲＡＰＤ 分析的影响，建立了可用于 ＲＡＰＤ 分析的 ＤＮＡ 快速提取方法。优化了 ＲＡＰＤ 体系，使其更经济、更稳定。 ４． 用 ３００ 个随机引物对单显性核不育油菜分离群体进行分析，只有 Ｓ２４３（５’ＣＴＡＴＧＣＣＧＡＣ ３’）１ 个引物在两集团间检测到多态性。即在不育集团中扩增出特异的 １．５Ｋｂ ＤＮＡ 片段，而在可育集团中未扩增出相应的 ＤＮＡ 片段。用引物 Ｓ２４３对分离群体的不同个体单株进行分析，与上述结果一致，而且具有很好的重复性。 ５． 用引物 Ｓ２４３ 对目前油菜中应用较为广泛的细胞质不育类型和其它核不育类型进行分析，均未扩增出上述特异性片段，从而确证引物 Ｓ２４３（ＯＰＵ－０３）所扩增出的 ＯＰＵ－０３１５００片段是与甘蓝型油菜单显性核不育基因连锁的。二者之间的遗<WP=5>传距离为 ４．２９ｃＭ。 ６． 对 ＲＡＰＤ 标记物 ＯＰＵ－０３１５００ 进行了序列测定，对此序列进行了同源性比对分析，并根据序列分析结果对该不育类型不育机理进行了探讨。该不育类型可能是因反转座子重组插入控制育性的基因内部而引起突变产生的。 ７． 探讨了单显性核不育的利用方法和途径，单基因显性核不育在轮回选择、杂交、回交和复交育种中有一定的利用价值。
王道杰[2]2007年在《油菜单显性细胞核雄性不育分子机理研究》文中研究说明本研究以单显性细胞核雄性不育油菜分离群体为材料,在对单显性核不育(MDGMS)油菜的育性、花器性状进行观察的基础上,对MDGMS及其等位可育系的小孢子发育过程及败育方式和特征进行了比较研究;利用集群分离法(BSA)分子标记策略,找到了与单显性核不育基因连锁的RAPD标记,并将其转化为稳定可靠的SCAR标记。通过比较分析分子标记DNA序列的同源序列,设计引物在MDGMS及其等位可育油菜中克隆到油菜输入蛋白α基因的genomic DNA和cDNA编码区全长序列。根据克隆的油菜输入蛋白α基因cDNA序列,构建RNAi和Antisense RNA载体并转化油菜;通过这种基因敲除的反向遗传学方法研究输入蛋白α基因在油菜生长发育中的功能。主要结果如下:1.MDGMS油菜不育株与可育株相比,雄蕊严重退化,花丝不伸长或略有伸长,花药萎缩呈丝状尖叁角,花粉囊中空干瘪,无花粉,自交不能结实。而雌蕊具有正常的形态,少部分的柱头有一定的弯曲。用正常花粉给不育花授粉,能正常结实,表明不育花雌蕊是正常可育的。通过无性繁殖对应植株在温室和大田育性比较研究表明,该不育系完全由遗传效应决定,不受环境因素的影响。2.对MDGMS育性分离群体中可育株和不育株小孢子发育过程进行石蜡切片比较观察发现,不育系小孢子败育发生在减数分裂前,并且不能形成四分体,小孢子解体于绒毡层解体之前,最后花药成为干瘪的空壳,表明MDGMS雄性不育不是由于绒毡层细胞给小孢子营养供应不良造成,而是小孢子功能缺陷,自身不能继续发育引起的。3.对同一时期MDGMS不育及等位可育系的花蕾蛋白质表达差异分析表明,可育系花蕾中表达的蛋白质点数要高于不育系。可育系中表达的特有蛋白质分子量主要分布在60kD以下小分子区域,30kD尤为丰富;不育系中表达的特有蛋白按分子量分布相对均匀。两者表达特有蛋白都相对集中在pI6.0-7.5之间。4.利用集群分离法(BSA)对MDGMS不育基因进行了RAPD分析,找到了与MDGMS不育基因连锁的RAPD标记OPU-031500。将RAPD标记OPU-031500 DNA片段克隆、测序并进行Blast分析表明,该标记DNA序列与拟南芥基因核输入蛋白α高度同源,根据同源的拟南芥序列及其该基因在物种间的保守性,设计特异性引物SCP1/SCP2,在MDGMS不育及等位可育系中都扩增到2.3 kb的单一特异片段。根据突变位点设计引物SCP3/SCP4,在等位可育系中扩增到约1.5kb的单一特异片段,但在不育系中未扩增到任何带,从而将RAPD标记转化为稳定可靠的SCAR标记。5.在油菜MDGMS不育和等位可育系中克隆到包括起始密码子ATG和终止密码子TGA在内的油菜核输入蛋白α基因编码区全长genomic DNA和cDNA。二者genomic DNA全长分别为2620bp和2614bp。不育和可育系genomic DNA序列之间多个位点存在突变差异。cDNA全长分别为1629bp和1623bp,不育和可育系cDNA序列之间只有2个位点存在突变差异。genomic DNA和cDNA比较表明,油菜输入蛋白α基因(BIMP a)包含10个外显子和9个内含子。6.根据克隆到的MDGMS不育和可育系输入蛋白αcDNA序列推导出二者对应的氨基酸序列。油菜输入蛋白α由542个氨基酸组成,而突变不育系只有540氨基酸。比较发现不育系由于碱基缺失突变,导致其肽链氨基酸序列组成上有1个位点缺少2个谷氨酰胺(QQ),并进一步导致该蛋白二级结构的变化:α-螺旋和β-转角在突变不育系MDGMS中明显减少。对推导的氨基酸序列进行结构域分析表明,油菜输入蛋白α结构域包括1个与输入蛋白β结合的N-末端结构域(IBB)、8个ARM重复单元(ARM repeat)和2个HEAT重复单元(HEAT repeat),组成完全与输入蛋白α结构域一致,从而将其命名为BIMP a(Brassica-napus Importinα, BIMP a)。7.通过构建油菜输入蛋白αRNAi和Antisense RNA载体并转化油菜表明,油菜输入蛋白α不仅控制雄配子的发育,也控制雌配子的发育,同时与植株的长势及抗病性相关。转基因植株长势较差,不能结实且易感病。
刘俊[3]2008年在《甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育基因与恢复基因的精细定位》文中研究说明Rs1046AB是派生于宜3A的纯合型甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育系,具有败育彻底、不育性稳定和恢复源广泛等特点。1985年,李树林等经过大量的遗传分析后,提出甘蓝型油菜显性核不育材料宜3A的育性受两对显性基因互作控制的遗传假说,其中一对为显性不育基因,另一对为显性上位抑制基因,当显性不育基因单独表达时可以导致雄性不育,而当显性上位抑制基因存在时,育性又可以恢复正常。最近宋来强等(2006)通过遗传分析表明利用一对复等位基因控制的模式来解释Rs1046AB的遗传更加合理,即Ms为显性不育基因,Mf为等位显性恢复基因,ms为正常可育位点,并且具有Mf＞Ms＞ms的显性遗传效应。以Rs1046AB为主要材料,洪登峰(2006)已利用一个192株的F_2群体对Rs1046AB的不育基因和恢复基因进行了初步定位。以此为基础,本研究中通过不育系Rs1046A和恢复系195-14A(温敏型细胞质雄性不育两用系)杂交构建F_(2:3)家系和F_2全不育株群体,利用分子标记技术筛选与不育基因Ms和恢复基因Mf连锁的分子标记,进一步开展显性核不育基因与恢复基因(Ms/Mf)的精细定位研究,取得的主要结果和结论如下:1.将3个AFLP标记E3M10、E1M13和S5T5(洪登峰,2006)成功转化为SCAR标记(依次命名为:SCD2、SCD7和SCD8)。,并结合SCAR标记SCE3(陆光远,2003)和SCHDF(洪登峰,2006),进一步分析708个单株构成的F_(2:3)家系和987个单株的F_2全不育株群体,结果表明:SCD2、SCE3、SCD7和SCD8 4个SCAR标记全部位于目标基因一侧,距目标基因(Ms/Mf)的遗传距离依次为2.0cM、1.7cM、1.5cM、0.1cM,另外一个SCAR标记SCHDF位于目标基因的另一侧,且距目标基因的遗传距离为2.3cM,实现了对目标基因的准确定位。2.应用BSA法,结合AFLP技术,继续筛选了512对AFLP的引物组合,获得了4个与目标基因紧密连锁的AFLP标记。其中2个标记(P1M1、P1M4)为共显性标记,被定位于SCAR标记SCD7与SCD8之间。另外2个标记(P3M2、P12M6)为显性标记,与恢复基因连锁,分别位于目标基因两侧,前者被定位于SCAR标记SCD7和SCD8之间,后者被定位于标记SCHDF与目标基因之间,使目标基因的遗传距离进一步缩小。3.通过比较测序,将Song et al.,(2006)在甘蓝型油菜显性核不育系609AB中获得的不育基因两侧最近的SCAR标记SC6和SC9进行整合,并成功转化为既与不育基因连锁又与恢复基因连锁的SCAR标记,重新被命名为SC6D和SC9H。前者被定位于AFLP标记P12M6与目标基因之间,后者被定位于AFLP标记P3M2和P1M1/P1M4之间,且分别距目标基因的遗传距离均为1.0cM。结合上述AFLP标记和SCAR标记,在本研究中实现了对目标基因(Ms/Mf)的精细遗传定位。4.利用DH群体TN(Tapidor×Ningyou7)的遗传图谱将目标基因Ms/Mf定位于甘蓝型油菜的N8连锁群,并在N8连锁群上成功开发出一个与Ms/Mf基因连锁的共显性SSR标记HUA348,实现了目标基因精细定位图谱与已公布的甘蓝型油菜图谱的整合。5.根据目标基因区段与对应拟南芥同源区的信息(洪登峰,2006),在目标基因两侧标记之间,设计18对特异引物(DFN1-DFN18)对目标区段进行扩增,结果除了DFN03、DFN12、DNA14和DFN18等4对引物外,其余14对引物都同时扩增出不育基因和恢复基因,对这14对引物进行比较测序分析之后再次设计引物,结果仍然没有开发出新的分子标记。6.以与目标基因紧密连锁的SCAR标记SCD8为探针进行Southern杂交,筛选甘蓝型油菜Tapidor BAC文库,获得了29个具有强杂交信号的BAC克隆。7.利用DFN1、DFN5、DFN8、DFN16和SCD8共5对引物通过PCR分析的方法对所获得的29个BAC克隆进行阳性验证,结果依据其中的18个克隆形成了可能覆盖Ms/Mf基因的BAC克隆重迭群。利用限制性内切核酸酶HindⅢ完全酶切29个BAC克隆,构建其指纹图谱,进一步验证了利用PCR分析法构建的BAC克隆重迭群。
洪晓敏[4]2009年在《甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育相关基因2-I05功能研究》文中研究表明本研究在获得了甘蓝型油菜细胞核雄性不育相关基因2-I05 cDNA(GenBank登录号EU306599)的基础上,利用生物信息学方法对其进行分析,然后构建反义抑制载体并转化拟南芥和甘蓝型油菜以明确该基因的功能和对拟南芥和甘蓝型油菜植株生长和育性的影响。所做工作及主要结论如下:1.对雄性不育相关基因2-I05基因(GenBank登录号EU306599)进行了生物信息学分析。2-I05的cDNA编码357个氨基酸。其编码蛋白质主要位于细胞核内,在拟南芥中检索到与之同源的RAD23-like蛋白,该蛋白是一种参与DNA核苷酸切除修复的蛋白质。对来自不同植物的9个RAD23-like蛋白质氨基酸序列的系统进化分析结果表明:RAD23-like在氨基酸序列上的进化与植物的进化基本保持一致,同科植物来源的RAD23-like蛋白质较科间植物来源的遗传变异小。2.构建了基因2-I05反义抑制植物表达载体并对拟南芥进行了遗传转化。成功构建了2-I05反义抑制植物表达载体,并通过农杆菌介导的花序浸染的方法将基因2-I05反义序列导入拟南芥Columbia中,收获的种子经30mg/L的潮霉素(Hyg)的抗性筛选,获得了具有潮霉素抗性的T_1代阳性植株23株。但因培养条件差,最终只有4株T_1代拟南芥存活下来;经PCR检测验证,其中有2株为阳性植株。3.对T_2代拟南芥进行了潮霉素(Hyg)的抗性筛选、抗性植株PCR检测、UV处理和RT-PCR检测。RT-PCR结果表明:在组成性启动子的作用下,2-I05反义抑制基因能够在花蕾、叶片中抑制野生型拟南芥中编码RAD23-like蛋白质的同源基因。UV处理结果表明,相对Columbia野生型而言,T_2代拟南芥对UV更为敏感,说明2-I05基因其功能主要是参与了植物体UV损伤修复。实验结果并未证实前人的这一假设即,参与植物体UV损伤修复的2-I05基因能引起植株不育;但该基因可能参与了雄蕊长度的调控。4.尝试了用2种转基因方法将基因2-I05反义抑制植物表达载体导入甘蓝型油菜中。但因载体本身带有潮霉素(Hyg)的抗性基因,Hyg又对甘蓝型油菜外植体毒性过大,所以导致在对甘蓝型油菜转化后外植体的筛选过程中一直未找到合适的筛选浓度;后续工作就未能进行下去。但对所使用的2种转基因方法进行了比较和分析。
龚慧明, 贺浩华[5]2006年在《作物显性核不育的研究和利用进展》文中研究说明从显性核不育的恢复性机制、不育基因定位、细胞学特征、败育过程的生理生化变化以及显性核不育在常规育种和杂种优势中的利用等方面对作物显性核不育的研究和利用进行了综述,并对萍乡显性核不育水稻的研究和应用前景进行了展望。
参考文献：
[1]. 油菜单显性核不育基因的分子标记及其辅助选择研究[D]. 王道杰. 西北农林科技大学. 2003
[2]. 油菜单显性细胞核雄性不育分子机理研究[D]. 王道杰. 西北农林科技大学. 2007
[3]. 甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育基因与恢复基因的精细定位[D]. 刘俊. 华中农业大学. 2008
[4]. 甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育相关基因2-I05功能研究[D]. 洪晓敏. 华中农业大学. 2009
[5]. 作物显性核不育的研究和利用进展[J]. 龚慧明, 贺浩华. 安徽农业科学. 2006