彭忠勇1 孙萍1 陈志斌2 修波3 敖强3 孙朝晖3 赵振强2
（1贵阳市第二人民医院神经内二科 贵州 贵阳 550081）
（2海南医学院 海南 海口 570102）
（3清华大学第二附属医院神经外科 北京 100039）
【摘要】 目的：探索大鼠嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells，OECs）移植联合督脉电针对大鼠脊髓损伤（spinal cord injury SCI）后水通道蛋白-4（AQP-4）和后肢功能的影响。方法：取Wistar大鼠150只，随机分为正常组(50只)、OECs移植组(50只)、OECs移植联合督脉电针组(50只)，OECs移植联合督脉电针组和OECs移植组用改良的Allen法制成脊髓损伤模型，造模成功后，OECs移植组和OECs移植联合督脉电针在损伤处移植嗅鞘细胞。于术后1、3、7、14、21、28天进行BBB (Basso-Beattle-Bresnahan)运动功能评分，应用免疫组织化学技术检测脊髓组织AQP-4的表达，并用图像分析仪进行定量分析。结果：术后3～28天，OECs移植联合督脉电针组的BBB评分较OECs移植组明显提高, 术后第1天，联合组和OECs移植组受损脊髓灰质、白质中AQP-4的表达明显增加；第3天时均达到高峰，但联合组低于OECs移植组(P<0.05)。第7、14、21、28天，与OECs移植组比较，联合组AQP-4表达也较低(P<0.01)。结论：OECs移植联合督脉电针使脊髓损伤后AQP-4表达减少，这可能更有利于抑制脊髓水肿、消除脊髓继发性损伤，保存了残存正常脊髓组织并促进神经轴突再生，改善其肢体运动功能。
【关键词】 脊髓损伤；嗅鞘细胞；督脉电针；BBB评分；水通道蛋白-4
【中图分类号】R681.5 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）10-0062-02
Effect of Combination Transplanted Olfactory Ensheathing Cells and Goremor Vessel Electroacupuncture on Water Channel Aquaporin-4 in Experimental Spinal Cord Injured Rats Peng Zhongyong1 Sun Ping1 Chen Zhibin2 Xiu Bo3 Ao Qiang3 Sun Zhaohui3 Zhao Zhenqiang2.1 The Second Department of Neurology the Second Peoples Hospital of Guiyang, Guiyang (550081).2 The College of Hainan Medicine, Hainan (570102).3 The Neurosurgery dpartment of The Second Hospital Affiliated to Tsinghua University,Beijing (100039)
【Abstract】 Objective To investigate effects of combination of transplanted olfactory ensheathing cells(OECs) and Goremor vessel electroacupuncture on the water channel aquaporin-4(AQP-4) expression and hind limbs function recovery in experimental spinal cord injured rats. Methods One hundred and fifty Wistar rats were divided into the normal group, the OECs grafted group(OECs group) and the OECs grafted plus Goremor vessel electroacupuncture group(OECs+EC group), with 50 rats in each group, modified Allen method was used to establish spinal cord injury model in the OECs and OECs+EC group. OECs were grafted into the transected site of spinal cord in OECs group and OECs+EC group after modelling successfully. At the 1st, 3rd, 7th, 14th 21th and 28th day after injury, the hind limbs function of rats were estimated with system of the BBB locomotion score respectively, and the AQP-4 expression in spinal cord tissue was determined by immunohistochemistry technique and quantity analysed with image analyzer. Results From 3 days to 28 days, the BBB locomotion scores of OECs+EC groups was higher than that in the OECs group(P<0.05),At the 1st day after spinal cord injury, the AQP-4 expression was significantly increased in gray matter and white matter of spinal cord in the OECs group and the OECs+EC group, which reached the peak at the 3rd day, but showed significant difference between the two groups (P<0.05), and the difference at the 7th, 14th 21th and 28th day became more significant (P<0.01). Conclusion Combination of transplanted olfactory ensheathing cells(OECs) and Goremor vessel electroacupuncture can down-regulate AQP-4 expression after spinal cord injury, inhibits pinal cord edema for alleviating secondary spinal cord lesion, so as to protect the residual normal spinal cord tissues and promote the regeneration of axons, and enhance the recovery of locomotion function.
【Key words】Spinal cord injury;Olfactory ensheathing cells; Goremor vessel electroacupuncture; BBB locomotion score; Water channel aquaporin-4
水通道蛋白-4(Aquaporin-4，AQP-4)又称为汞不敏感水通道蛋白(mercury insensitive water channel，MIWC)[1]，其主要分布在中枢神经系统包括脑和脊髓。在对鸡胚胎的脑AQP-4表达的研究中发现，AQP-4的表达与中枢神经系统的血-脑(脊髓)屏障的成熟和功能相关[2]。已有大量研究结果显示抑制脊髓损伤后AQP-4的表达有利于抑制脊髓水肿，减轻继发性脊髓损伤，改善脊髓神经功能。该实验通过观察嗅鞘细胞（OECs）移植联合督脉电针对脊髓损伤后AQP-4表达的影响，拟更深入地探寻继发性脊髓损伤后细胞分子水平的病理机制，为保护残存的脊髓神经组织探索新方法，探讨OECs移植联合督脉电针治疗脊髓损伤的作用机制。
1.材料与方法
1.1 材料
DMEM-F12 培养基(DF12)购于Hyclone公司；胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）购自 Gibico公司； 阿糖胞苷（Ara-c）、Mayer苏木素、多聚赖氨酸(PLL)购自Sigma公司；SABC免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒、Rabbit anti-Aquaporin-4均为武汉博士德生物有限公司产品；中国军事医学科学院实验动物中心提供成年Wistar大鼠，重200-250g，共150只。
1.2 实验细胞的制备
选雄性Wistar大鼠，常规消毒皮肤，由口腔入路将双侧颊部切开达颈椎，断颈，除去额部皮肤肌肉和下颌骨，将头颅从皮下取出。打开前颅，显露嗅球，将两个嗅球在显微镜下完整取出，即刻放入冰的DMEM抗菌素液中（青霉素、链霉素各100IU/ml），再剥下嗅球被膜，用加抗生素的DMEM液中将嗅球组织清洗三遍；眼科剪剪碎嗅球，加入0.25﹪的胰酶在37℃孵育箱中孵育20分钟；离心去除悬浮液，两次换液；加入含10﹪胎牛血清（fetal bovine serum FBS）的DMEM1～2ml，终止消化；100um细胞筛过细胞液；离心后除去上清液（室温，800r/min，10min）。以DMEM稀释细胞浓度至1×106/L，种植于未经包被处理的细胞培养皿中，置于5﹪CO2、37℃培养箱内培养。以改良NASH差速贴壁法培养18～20小时后，吸出悬液细胞液，再种植于包被多聚右旋赖氨酸的细胞培养皿内，加入DF12(DMEM:F12＝1:1)完全培养液3ml进行培养。为便于免疫组化观察，将多聚赖氨酸处理过的盖玻片放入培养皿中，于盖玻片上进行细胞培养。差速贴壁后第二天，加入 Ara-c（5umol/L）作用24小时，换液并用培养液冲洗三次。观察细胞生长情况，每2～3天行一次半量换液，培养14～18天。于移植前予DMEM-DF12培养液将OECs 细胞浓度调整为 5×1010个/L。
1.3 脊髓损伤动物模型制作
本实验用改良Allen方法，选Wistar大鼠，雌雄平均，雌鼠未孕，体重200～250g。腹腔注射2%戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉，将大鼠俯卧，固定在自制动物手术台上，剪去背毛，常规消毒，确定T12为中心，将背部沿正中切开，开2～3cm长切口，将T11～13棘突及全部椎板咬掉，暴露 T12脊髓，硬脊膜要完整，以重10g直径4mm的钢棒于10cm的高度呈自由落体下落撞击脊髓，制成脊髓不完全性损伤的挫伤动物模型。造模成功的标志为大鼠双下肢呈回缩性扑动，尾巴出现痉挛性摆动。正常组不处理。术后协助大鼠排便、排尿并予保温、抗感染及防褥疮等处理。
1.4 实验分组
将脊髓损伤模型大鼠150只随机分成3组，各组50只。A组为正常组，不处理；B组为OECs移植组，将OECs悬液12ul注入脊髓损伤处；C组为 OECs+EC组，按上法注入OECs悬液12ul并于术后接受督脉电针治疗。
1.5 细胞移植
造模成功后，OECs移植和联合组在脊髓损伤头尾两侧缘中线处注射细胞悬液，注射深度分别为1.75、1.25、0.75mm，每点注射2ul（时间30s），在每点注射针头留置约1min，共注射12ul，移植完成后逐层缝合。术后常规护理。
1.6 督脉电针治疗
造模成功后，OECs+EC组动物于术后第2天开始接受每日一次的督脉电针治疗，选大椎(C7棘突下)、命门 (L2棘突下)穴各刺入一枚毫针，针刺深度5mm。大椎穴接正极，命门穴接负极，电针15min，电针频率20Hz，持续脉冲电流12～15mV，强度以双下肢出现规律性收缩抖动为度。连续7天为1个疗程，疗程间隔2天。
1.7 BBB (Basso-Beattle-Bresnahan)运动功能评分
对OECs移植和OECs+EC组大鼠采取双盲法进行评分，于术后1天、3天、7天、14天、21天和28天进行，共6次。
1.8 脊髓取材
细胞移植及联合组于术后1、3、7、14、21、28天麻醉动物(每次每组取8只大鼠)，开胸术暴露心脏，以12号灌注针头沿左心室刺入主动脉，立即剪破右心耳，并用37℃生理盐水约200ml经左心室主动脉灌注冲洗血液，至右心耳流出淡红色液体后，用4℃的含4%多聚甲醛0.1mol/L磷酸缓冲液(pH=7.4)250ml迅速灌注固定，于T12为中心向头尾各1cm处横断脊髓，行连续石蜡切片，作免疫组织化学染色。
1.9 AQP-4检测
用石蜡包埋脊髓组织，将蜡块用切片机切成约5um厚的石蜡切片，作免疫组化染色检测AQP-4的表达。
1.10 染色积分光密度(integrated optical density，IOD)检测
取每只大鼠12张切片，用病理图像分析系统(3.0)行各片的IOD分析，以12张切片均值为该动物脊髓的AQP-4染色IOD。
1.11 统计学方法
采用SPSS11.0 统计软件包处理，对实验数据进行两两配对t检验或单因素方差分析。
2.结果
2.1 BBB运动功能评分
脊髓损伤术后第1天，所有大鼠后肢均不能活动；术后3天OECs移植组和OECs+EC联合组后肢运动功能均有轻微恢复；术后7天，联合组BBB运动功能评分均明显高于单纯OECs移植组，差异有显著性意义（P＜0.05），术后14天至28天，OECs移植联合督脉电针组BBB评分提高更为显著（P＜0.05），与OECs移植对照组之间BBB评分差值有增高趋势，提示OECs移植联合督脉电针促进SCI大鼠后肢运动功能恢复有更大的优势（见表1）。
2.2 损伤脊髓AQP-4的表达
2.2.1各组大鼠免疫组化染色结果 正常组大鼠第1、3、7、14、21、28天的脊髓切片中在脊髓灰质和白质均可见一定量AQP-4表达，阳性细胞胞膜呈黄褐色；阳性细胞主要位于神经胶质细胞胞膜及临近毛细血管的星形胶质细胞突起末端的脚板膜上(血脑屏障的重要组成部分之一)及白质髓鞘周围的神经胶质细胞(主要是少突胶质细胞)膜上，部分胶质界膜也有表达，而神经元膜上几乎无表达。
2.2.2AQP-4免疫组化IOD测定结果（见表2） 术后第1天，OECs+EC组和OECs移植组大鼠脊髓灰质白质中可见神经胶质细胞膜上黄褐色免疫标记明显增加，与正常组比较差异有显著性(P<0.05)；两组在第3天，AQP-4表达均达最高值，且白质中AQP-4表达强于灰质，少数神经元膜上也出现弱阳性，与正常组比较差异有显著性(P<0.01)，而OECs+EC组表达又弱于OECs移植对照组(P<0.05)；术后第3、7、14、21、28天OECs+EC组AQP-4表达与OECs移植对照组比较进一步降低(P<0.05或P<0.01)，第28天时OECs+EC组AQP-4表达部分几乎已经正常。
3.讨论
通常认为脊髓损伤后恢复困难的原因包括：①脊髓严重受损及继发性损害使脊髓神经细胞大量坏死或凋亡，但神经细胞再生能力差［3］；②损伤后脊髓暴露的抑制因子及胶质瘢痕增生抑制了轴突的生长和桥接［4］；③ 损伤后的细胞凋亡，致使神经营养因子分泌减少，使轴突再生的微环境遭受破坏［5］。
水通道蛋白是近十年来发现的一种细胞膜通道蛋白，它在水分子的跨膜流动方面起着关键性作用。在中枢神经系统中的水通道蛋白主要有AQP-4和AQP-1，以AQP-4分布最广泛。AQP-4为6次跨膜的四异聚体蛋白，主要分布于脑室系统的蛛网膜下腔、室管膜及血管周围的星形胶质细胞以及渗透压感受区，这是胶质细胞与脑脊液以及血管之间的水调节和运输的重要结构基础。AQP-4使人们从分子学水平上探寻中枢神经系统水肿的新机制。Manley，GT等[6]实验发现通过拮抗AQP-4可以减轻中枢神经系统组织水肿。为探索脑和脊髓损伤的病理机制及治疗研究拓展了新的干预手段。
嗅鞘细胞（OECs）同时具有中枢和周围两个神经系统细胞特性，能表达和分泌多种神经营养因子和细胞表面黏附分子，对中枢神经细胞轴突再生有着独特的作用［7-8］，是SCI细胞替代治疗中较理想的细胞来源。
大量实验证明针刺、一些神经营养因子和少数药物可促进神经再生，现阶段细胞移植和针刺治疗是SCI修复研究的热点，有学者应用骨髓间质干细胞(BMSCs）[9-11]、神经干细胞（NSCs）[12-13]、嗅鞘细胞(OECs)等细胞移植及督脉电针[14-16]对脊髓损伤的修复有一定优势，嗅鞘细胞被认为较理想的移植材料，实验证明其对损伤脊髓有明显的治疗作用［17-20］。在临床上已有学者将嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤[21-22]，黄红云[23]等用胚胎嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤晚期患者，评价神经功能和生存质量［24］，结果表明OECs移植能恢复部分神经功能， 改善生存质量，但疗效欠佳。或许单一、纯化的细胞移植可能并不是修复脊髓损伤的最佳选择，如何选择适当的干预手段联合应用，并使之实现从实验室走向应用研究是细胞移植策略中应重点考虑的问题。曾园山等[25-27]采用督脉电针与神经干细胞（NSCs）联合治疗大鼠脊髓损伤，结果表明联合应用多种干预手段修复脊髓损伤更有应用前景。本研究组先前的实验结果显示OECs移植能明显地抑制脊髓损伤后AQP-4的表达，促进脊髓功能的恢复［28］。
祖国医学认为脊髓损伤属于“截瘫”、“痿癖”的范畴，按经络学说认为则属“督脉损伤”，故脊髓损伤患者，实质是督脉损伤，针刺督脉能直达病所，正所谓“治病必求其本”。徐斌[29]认为电针督脉治疗脊髓损伤的机理之一为改善微循环，减轻局部水肿、血肿的压迫，减轻继发性脊髓损伤。
本实验用OECs移植联合督脉电针治疗大鼠脊髓损伤，显示联合应用多种干预策略修复脊髓损伤更有应用前景。本实验观察到，OECs联合督脉电针组在第3、7、14、21和28天大鼠BBB运动功能评分逐渐提高，与OECs移植对照组比较有显著差异（P＜0.05）。这与脊髓损伤后AQP-4表达的减少是一致的。说明OECs移植联合督脉电针通过使脊髓损伤后AQP-4表达的减少，可能抑制损伤脊髓水肿的来减轻继发性脊髓损伤，保护残存的脊髓组织并促进其神经细胞的功能恢复。
脊髓损伤涉及到瞬间的原发损伤和继而在受损部位发生一种持续组织水肿、循环受损和代谢障碍的继发损伤。此诸多因素使脊髓神经细胞受到损害和被广泛抑制，呈休克状态。本研究结果显示OECs移植联合督脉电针能更明显地抑制脊髓损伤后AQP-4的表达，促进脊髓功能的恢复。其机理可能为OECs移植联合督脉电针能通过抑制脊髓损伤后AQP-4的表达，减轻脊髓损伤部位水肿、血肿的压迫，减少脊髓继发性损伤的加重因素，从而创造能支持轴突再生的有利微环境。这可能是OECs移植联合督脉电针治疗促进脊髓损伤功能恢复的又一分子机制之一。嗅鞘细胞移植与督脉电针联合应用的优势在于：① 早期督脉电针治疗能够改善SCI后的局部微环境，为移植入的OECs发挥更大的效用提供有利的条件。② 两种干预手段对SCI的修复有相互协同作用。③ 后期的督脉电针治疗能够促进再生突触的功能重建。
表1 大鼠各阶段BBB运动功能评分结果（x-±s）
注：与正常组比较*P<0.05，**P<0.01；与模型对照组比较，△P<0.05，△△P<0.01
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基金项目:贵阳市卫生局科技项目（2011）；清华大学裕元医学科学基金（20240000540）；海南省教育科学基金（HJ2008104）
论文作者:彭忠勇1,孙萍1,陈志斌2,修波3,敖强3,孙朝晖
论文发表刊物:《医药前沿》2016年4月第10期
论文发表时间:2016/5/16
标签：脊髓论文; 电针论文; 督脉论文; 损伤论文; 细胞论文; 大鼠论文; 术后论文; 《医药前沿》2016年4月第10期论文;