刘保安[1]2002年在《肝癌细胞同步化及其与胞外基质的粘附特性初探》文中指出恶性肿瘤是一类严重威胁人类健康和生命的疾病，其基本特征就是癌细胞失控的增殖、侵袭和转移。现代细胞生物学、分子生物学、免疫学的长足进步使得对癌细胞侵袭和转移机理的认识有了很大提高。但是，对于癌细胞侵袭转移所涉及到细胞流变学特性的研究还做得不够深入。因此本文从不同角度对癌细胞本身特性及其行为进行研究和比较，对于阐明癌细胞侵袭和转移的机制以及防治，都具有理论和实际应用的意义。本文的主要研究内容和结果如下：（1）论证了细胞周期同步化方法的可行性。采用以胸腺嘧啶核苷阻断后释放，进而以秋水仙碱阻断后释放培养的办法获得同步于G1期细胞，并保证了在实验要求的时段内的同步率对于HCC基本稳定在60%以上，对于CBRH7919基本稳定在55%以上；采取以胸腺嘧啶核苷双阻断法获得同步于S期细胞，并保证了在实验时段内的同步率对于HCC和CBRH7919基本稳定在95%以上。（2）应用微管吸吮技术对于CBRH7919细胞与胶原I的粘附特性进行了研究。并分别从与胶原I粘附的浓度、时间以及同步化处理CBRH7919细胞与胶原I的粘附作用进行了考察。实验表明CBRH7919与胶原I粘附具有浓度依赖性，且粘附力在检测时间内随时间延长而增大，但后期增长幅度不大。从周期角度看，G1期粘附力较S期大，反映了G1期具有较高的转移潜能。（3）对于HCC细胞进行了与胞外基质胶原IV的粘附性实验，结果表明：HCC细胞对于胶原IV的粘附具有浓度和时间依赖性。HCC细胞在较高浓度有趋近饱和的粘附力数值，且在初期粘附行为极不稳定。同步化处理后S期HCC细胞与胶原IV的粘附力较G1期小，分析这可能与G1期有较活跃的胞质化学反应相关联。（4）对近年来我院应用微管吸吮技术进行的癌细胞与胞外基质的粘附行为研究结果进行了分析和比较。结果表明就已进行的肺癌、肝癌实验而言它们都具有浓度依赖性，即使不同种属的癌细胞也反映了这一事实。它反映胶原作为胞外基质主要成分对于癌细胞粘附的重要性，即胶原既是癌细胞侵袭的屏障，又是其移动的支撑点。
吴静[2]2008年在《重组人ADAM15去整合素结构域蛋白的制备及其作用机理》文中指出ADAM (A Disintegrin And Metalloproteinase)是一类含有七个功能结构域并在细胞间相互识别和相互作用中发挥重要作用的跨膜糖蛋白家族。ADAM15作为该家族唯一在去整合素结构域(disintegrin)含有RGD(Arg-Gly-Asp)基序的成员,在细胞外基质降解、细胞粘附、细胞内信号转导和肿瘤的病理变化等过程中发挥重要作用,但是其抗肿瘤机理需进一步阐释。本文在成功获取高表达水平的重组人ADAM15去整合素结构域蛋白片段(rhddADAM15)的基础上,以小鼠黑色素瘤细胞(B16)为研究模型,研究rhddADAM15对B16细胞体外增殖、粘附和迁移等细胞行为的影响,通过筛选rhddADAM15特异结合的12肽以及rhddADAM15在B16细胞上相互作用的靶点蛋白,探讨rhddADAM15干预肿瘤细胞行为的生理机制。主要研究结果如下:1)为获得大量具有生物活性的rhddADAM15蛋白,在详尽分析目标蛋白的cDNA序列的基础上,(1)选择能为大肠杆菌稀有密码子提供额外tRNA的大肠杆菌Escherichia coli Rosetta(DE3)作为宿主菌,将目标蛋白以GST(Glutathione-S-transferase)融合蛋白形式表达,在最佳诱导表达条件下融合蛋白GST-ADAM15浓度为298 mg/L,最佳凝血酶酶切条件下,rhddADAM15浓度为42 mg/L; (2)采用PCR体外定点突变技术将凝血酶识别序列附近稀有密码子GGA(Gly)替换为GGC,同时消除Pro-Glu-Phe残基,构建突变表达质粒,提高凝血酶酶切效率。在相同的表达和酶切条件下获得GST-△-ADAM15和rhddADAM15蛋白浓度分别为326 mg/L和68mg/L,比野生型分别提高9.4%和61.9%。这一结果表明,在充分认识目标蛋白特性的基础上定向选择表达宿主并改造表达质粒能实现外源蛋白高水平表达;2)采用MTT法测定rhddADAM15对B16、MCF-7/W以及HMEC-1细胞体外增殖的作用,采用创伤愈合实验、Matrigel基质胶以及Transwell侵袭小室法观察rhddADAM15对B16细胞体外迁移、粘附和侵袭的影响;采用台盼蓝染色法分析细胞活力、流式细胞仪检测rhddADAM15对B16细胞周期的影响。结果表明rhddADAM15对肿瘤细胞和正常内皮细胞生长均有一定的抑制作用(其IC50分别为9.5、11.8和14.9μg/mL),且明显抑制B16细胞的体外增殖、迁移、粘附和侵袭。台盼蓝染色法表明低剂量的rhddADAM15并不能导致B16细胞出现坏死,且rhddADAM15并不导致B16细胞出现典型的凋亡峰,而是将细胞阻滞于G2/ M期,并且这种作用呈剂量依赖关系;3)采用亲和甄别磁珠技术筛选rhddADAM15在B16细胞上的结合蛋白。将rhddADAM15采用蛋白生物素化方法标记生物素,借助生物素-亲和素系统,将生物素化的rhddADAM15固定于亲和素标记的免疫磁珠。从B16细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白,经浓缩富集后,采用双向电泳分离技术分离获得主要的结合蛋白点,然后对这些蛋白点进行电喷雾串联质谱技术(ESI-MS)分析,在蛋白数据库中检索,共鉴定了8个蛋白质,按功能可分为如下叁类:(1)临床应用的肿瘤标志物(苹果酸脱氢酶、磷酸甘油醛脱氢酶和谷氨酸脱氢酶);(2)能量代谢相关蛋白(烯醇酶、磷酸丙糖异构酶、原肌球蛋白和血红蛋白);(3)信号转导通路成员(p38MAPK激酶)等。在此基础上通过分子对接软件molsoft ICM模拟计算获得rhddADAM15与p38激酶相互作用的最佳模式和重要的结合位点;4)采用噬菌体展示技术筛选与rhddADAM15特异性相互作用的多肽序列。采用噬菌体随机十二肽库对固定有rhddADAM15的亲和磁珠系统进行生物淘洗,获得4条与rhddADAM15特异结合的12肽。将获得的12肽与蛋白质库进行序列比对,发现细胞周期相关蛋白如Cdc25和p53,信号通路相关蛋白/受体,如整合素αvβ3的胞外区,丝裂原活化蛋白激酶p38α等与所获得的4条12肽具有高度同源性;5)基于上述研究所获得的rhddADAM15在B16细胞上潜在的靶点蛋白,进一步研究rhddADAM15与p38MAPK激酶的体外相互作用,结合rhddADAM15对B16细胞行为的抑制作用,采用蛋白点杂交和激酶活性测定方法分析rhddADAM15在体外与重组p38激酶蛋白的结合情况,同时研究不同剂量rhddADAM15对B16细胞中p38MAPK激酶磷酸化水平的影响,并观察rhddADAM15对p38激酶活性受到部分抑制的B16细胞的增殖和细胞周期抑制作用的变化。发现:(1)rhddADAM15在离体低温条件下能够和重组p38激酶蛋白结合,但rhddADAM15(0-10μg/mL)在体外对p38MAPK激酶活性没有影响;(2)同样剂量的rhddADAM15作用于B16细胞24 h后,细胞中p38MAPK激酶的磷酸化水平提高(被激活);(3)p38激酶的特异性抑制剂SB203580(0.5 mmol/L)预处理B16细胞30 min后,rhddADAM15对细胞增殖的抑制作用减弱(IC50由未经处理的9.5μg/mL增加到11.4μg/mL),对细胞周期的阻滞作用也减弱(G2/M期细胞比率从未经处理的的28.77%降到16.59%)。上述结果表明,p38MAPK信号转导通路参与了rhddADAM15对B16细胞增殖和细胞周期的抑制作用,同时也表明生理条件下rhddADAM15与p38MAPK激酶相互作用的复杂性。
吴琼[3]2014年在《小鼠CD147蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及生物活性的初步研究》文中指出恶性肿瘤因其具有增殖迅速，易浸润和转移的特点，成为目前威胁人类生存的重大疾病之一。由基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)引起的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)成分降解是肿瘤发展的最关键步骤之一。蛋白质糖基化作为一种重要的蛋白质翻译后修饰，与肿瘤细胞黏附、浸润和转移有着密切的关系。CD147，属于免疫球蛋白超家族（immumoglobulinsuperfamily，IGSF），是一种广泛表达的高度糖基化跨膜蛋白，尤其在肿瘤细胞中高表达。CD147又称细胞外基质金属蛋白酶诱导剂（EMMPRIN），主要通过诱导MMPs参与多种生理过程，如炎症、组织重构、精子发生、血管发生和肿瘤转移等。CD147的组成包括2个胞外Ig结构域，1个跨膜结构域和1个胞内结构域。CD147胞外区有3个N-糖基化位点（Asn44，Asn154，Asn190），目前广泛认为其糖基化程度影响CD147对MMPs的诱导活性，但其具体机制和作用尚无定论。本实验旨在通过构建小鼠CD147野生型及突变体原核表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中表达并纯化，检测CD147野生型及突变体原核表达蛋白对MMP-2和MMP-9的诱导活性，为进一步探索在体外实现重组CD147蛋白糖基化提供原料蛋白，为探明CD147糖基化对细胞生物学功能的影响奠定基础。方法：1.利用PCR获取小鼠CD147野生型及叁种糖基化位点突变体DNA片段，将目的基因插入到原核表达载体pET-29b(+)中，构建野生型及叁种突变型重组原核表达载体。2.将构建成功的小鼠CD147野生型及叁种糖基化位点突变体原核表达载体转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞，用诱导剂IPTG诱导目的蛋白表达，并用Westernblot方法检测。将纯化蛋白进行Ni-NTA亲和层析纯化，SDS-PAGE检测纯化效果。3.纯化后野生型及叁种突变体蛋白分别处理Hca-F细胞，设立对照组，收集培养上清，提取细胞蛋白，分别用明胶酶谱和Western blot检测MMP-2、MMP-9的活性及表达量。结果：1.限制性内切酶Nde I和XhoI双酶切和DNA序列测定结果表明，成功构建小鼠CD147野生型及叁种糖基化位点突变体原核表达载体。2. Western blot结果表明，小鼠CD147野生型及叁种糖基化突变体蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中可溶性表达。SDS-PAGE结果表明，纯化后蛋白无明显杂蛋白，分子量为30kD，与预期相同。3.Western blot和明胶酶谱结果表明，小鼠CD147野生型及叁种糖基化位点突变体不同程度促进小鼠高淋巴道转移潜能肝癌细胞Hca-F表达MMP-2和MMP-9，这种促进作用与CD147糖基化位点有关。结论：1.成功构建小鼠CD147野生型及叁种突变体重组原核表达载体。2.实现小鼠CD147野生型及叁种突变体原核载体在大肠杆菌中表达及纯化。3.小鼠CD147野生型及叁种突变体原核表达蛋白不同程度促进Hca-F细胞表达MMP-2和MMP-9。
浦涛[4]2015年在《果蝇胚胎石蜡切片方法的改良及CAMR1/2在果蝇早期胚胎发育中的表达定位》文中认为黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)是生物学中重要的模式生物之一。果蝇胚胎也是发育生物学研究重要模型之一,优点很多,但其在制作石蜡切片时存在固定液等试剂难以渗入,导致包埋制片失败,为后续的实验带来困难。CAMRs调控着机体很多重要的生理进程,其在动物早期胚胎发育过程中的表达和分布研究较少。本研究首先以黑腹果蝇胚胎为模型,对传统制备果蝇胚胎的石蜡切片方法进行了改良,探索出适合果蝇胚胎石蜡切片制作的一整套方法流程,并采用苏木精—伊红染色和碘酸六胺银染色比较了不同包埋辅佐剂(如明胶,琼脂糖,石蜡)对染色的影响,并利用改良方法制备切片HE染色显示出不同发育时期果蝇胚胎的组织结构,进而得出更适合于果蝇胚胎切片制作的包埋辅佐剂。利用改良方法成功进行了CAMR1和CAMR2两个同源基因在果蝇胚胎发育各时期的定位和表达,结果显示在果蝇早期发育过程中,CAMR1和CAMR2的表达分布极其不同,预示这两个基因的功能在果蝇早期胚胎发育中已经开始了分化。结果如下：(1)渗透化处理改良后的石蜡聚集法更有利于高脂含量的果蝇胚胎石蜡切片制备胚胎HE染色结果显示,未渗透化处理组胚胎出现空腔和碎片,而渗透化处理组胚胎形态结构保持完好,说明渗透化处理对固定液等试剂的渗入起着重要作用。HE染色结果显示,琼脂糖聚集法切片和石蜡聚集法切片胚胎轮廓清晰,结构保存完整,内部着色良好且背景清晰,表明,琼脂糖和石蜡具有良好的结构稳定性及通透性,在脱水、包埋等过程中不会对胚胎造成明显挤压；PASM染色结果显示,相较于前两种方法。石蜡聚集法切片的染色背景洁净,且胚胎形态轮廓清晰正常,结构完整,综上表明,琼脂糖聚集法和石蜡聚集法对胚胎结构的保存都起到良好效果,石蜡更适用于做碎小样品包埋辅佐剂。本实验应用改良渗透化处理的石蜡聚集法包埋技术,完成了果蝇胚胎各时期切片的制作,并通过HE染色获得了胚胎各时期的发育形态图,能够清楚的观察到果蝇胚胎发育的整个过程,为后续研究果蝇胚胎发育各类基因表达、mRNA定位和兴趣蛋白的免疫组织细胞定位奠定了基础。(2) CAMR1和CAMR2调控果蝇胚胎发育中的功能分化首先,我们以RT-PCR和Western Blot方法检测到在果蝇早期胚胎中,CAMR1和CAMR2在mRNA水平和蛋白水平上均有表达。随后,我们以免疫组化的方法对CAMR1和CAMR2在果蝇早期胚胎发育过程中的表达模式变化进行比对。结果显示,CAMR1在整个胚胎发育过程中均广泛表达,且在细胞化(cellularization)过程中,在囊胚细胞中表达量较高,随原肠胚作用的进行,出现在外周分裂旺盛的胚层细胞中,在头端腹侧外胚层表达量较高,后期呈现在神经系统,中肠,表皮,肌肉高度分化的部位。实验表明,CAMR1在果蝇早期胚胎发育及分化中都起着重要作用。作为参与Ca2+信号通路调控,细胞周期调节的蛋白,CAMR1极有可能参与调控果蝇早期胚胎发育的功能分化过程和大脑神经等器官发育密切相关。CAMR2在果蝇早期胚胎发育过程中的表达模式变化与CAMR1有明显不同。CAMR2在合胞体时期表达较弱,在细胞化进程完成后,主要分布在囊胚上皮细胞基部而在囊胚上皮细胞中几乎没有可检测到的表达,并且在卵黄囊中依然呈现基本无表达的状况。在上述细胞基部的表达出现明显的极性分布状态,在胚胎头端表达最弱,尾端表达最强,差异性分布极为明显,从头端至尾端阳性表达强度呈递增至最强的程式,在额切面上呈左右对称、从头至尾的渐强式分布特征；在原肠胚期时,在背部和腹部已经分化明显,腹部的多细胞层上皮和背部单细胞上皮中CAMR2表达较弱,而仅在原肠胚后期的胚胎内部分化而成的器官结构中表达丰富。随胚胎器官进一步形成,该蛋白在各部位的表达也呈现出差异化。我们的实验结果明确表明CAMR2参与到果蝇早期胚胎发育的功能分化,并且可能与CAMR1的作用方式不同。
梁铁军[5]2007年在《胆汁酸衍生物对大鼠免疫性肝纤维化的阻抑作用及机制探讨》文中研究说明研究背景及目的：肝纤维化(hepatic fibrosis)是诸多慢性肝病发展至肝硬化过程中所共有的病理组织学改变，是影响慢性肝病预后的重要环节。其特征是以胶原为主的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)各成分因合成增多、降解相对不足而在肝内过量沉积。肝纤维化为一动态过程，属可逆性病变。但若进一步发展致肝小叶结构改建、假小叶形成(肝硬化阶段)则不可逆。迄今为止，临床上还缺乏公认的确切有效的抗肝纤维化药物问世，肝纤维化的防治研究在今后一定时期内仍是国内外的热点与难点课题。胆汁酸衍生物——熊去氧胆酸(UDCA)是人机体内源性第叁步合成的胆汁酸，能拮抗疏水性胆酸的细胞毒性作用，保护肝细胞膜；调节免疫功能；抑制细胞凋亡；清除自由基和抗氧化作用以及抑制炎症等作用。临床上对慢性肝病伴肝内胆汁淤积、原发性胆汁性肝硬化等疾病具有显着的疗效。有研究表明UDCA可能还具有抗肝纤维化的作用。为了进一步探讨其对肝纤维化的影响，本实验采用了经典的实验性肝纤维化的动物造模方法——猪血清诱发肝纤维化，并选择秋水仙碱作为治疗参照药物，观察UDCA在动物整体环境下阻抑免疫损伤性肝纤维化的疗效；进一步研究UDCA对TGFβ1诱导肝星状细胞(HSC)增殖和Ⅰ型胶原分泌的影响以及UDCA对TGFβ1／Smad信号转导通路的影响，探讨UDCA阻抑肝纤维化的可能分子机理，为临床上防治肝纤维化提供初步的基础理论与动物实验依据。方法：1．Wister大鼠120只，雌雄各半，随机分成6组：肝纤维化模型组(B组)20只，给予猪血清腹腔注射，0.5ml／次，每周2次，持续12周，诱导大鼠肝纤维化；正常对照组(A组)20只，给予等量生理盐水腹腔注射；UDCA大中小剂量组(C、D、E组)各20只，猪血清处理同模型组，同时将UDCA(30mg·kg(-1)·d~(-1)、15mg·kg~(-1)·d~(-1)、7·5mg·kg~(-1)·d~(-1)用普通饮用水配至成8g/L、4g/L、2g/L的浓度，给大鼠自由饮用，持续12周；秋水仙碱组(F组)20只，猪血清处理同模型组，同时将秋水仙碱(0.1mg·kg~(-1)·d~(-1))用普通饮用水配成秋水仙碱水溶液，给大鼠自由饮用，持续12周。实验结束时称重后处死全部大鼠，剖开腹壁，观察大鼠肝脏和脾脏情况：采用HE染色法和Masson染色法观察大鼠肝组织病理形态改变及纤维化程度分级；随机抽取样本电镜下观察超微结构改变；用自动生化分析仪测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、T-谷氨酰转肽酶(GGT)、总胆汁酸(TBA)和白蛋白(Alb)指标；采用放射免疫分析法检测血清透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅳ型胶原(CⅣ)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)；采用免疫组化法检测大鼠肝组织Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、TGFβ1表达，并用图像分析半定量法检测其平均灰度值；逆转录——聚合酶链反应(RT-PCR)法检测肝组织Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、TGFβ1mRNA的表达，并用图像分析法计算其曲线下峰面积与GAPDHmRNA积分值之比值。2．用不同剂量(0.25、0.5、1.0mmol/L)的UDCA处理经5ng／ml TGFβ1诱导的HSC-T6 24h及48h。MTT比色法检测UDCA对HSC-T6细胞增殖的影响；流式细胞术(FCM)检测细胞周期分布；免疫细胞化学染色法检测各组细胞Ⅰ型胶原、cyclinD_1、cyclinE蛋白的表达：RT-PCR法检测各组细胞Ⅰ型胶原mRNA的表达。3．用不同剂量(0.25、0.5、1.0mmol/L)的UDCA处理经5ng／ml TGFβ1诱导的HSC-T6 24h及48h。以蛋白印迹法观察UDCA对TGFβ1Ⅰ型受体(TβRⅠ)、Smad3、Smad4、Smad7蛋白表达的影响；RT-PCR法检测各组细胞Smad3、Smad7、CBPmRNA的表达。结果：1．UDCA各剂量组大鼠体重较模型组明显增加(P＜0.05～0.01)，肝重和脾重均较模型组明显减轻(P＜0.05～0.01)；UDCA各剂量组肝纤维化病理分级较模型组明显改善(P＜0.05～0.01)：UDCA各剂量组大鼠血清ALT、AST、GGT活性和TBA水平较模型组明显降低(P＜0.05～0.01)，UDCA大剂量组血清Alb含量较模型组明显升高(P＜0.05)；UDCA各剂量组大鼠血清中HA、LN、CⅣ和PCⅢ水平较模型组明显下降(均P＜0.01)；UDCA各剂量组大鼠肝组织Ⅰ型胶原及其mRNA表达较模型组明显降低(P＜0.05～0.01)，而且呈剂量依赖关系：Ⅲ型胶原及其mRNA表达较模型组明显降低(P＜0.05～0.01)；UDCA大剂量组大鼠肝组织TGFβ1mRNA表达较模型组明显降低(P＜0.05)，但其TGFβ1蛋白表达与模型组比较无差异(P＞0.05)；电镜显示UDCA各剂量组大鼠肝组织超微结构较模型组显着改善。2．UDCA对TGFβ1诱导HSC增殖有明显的抑制作用，而且这种作用呈剂量、时间依赖关系；UDCA使HSC G_0／G_1期细胞明显升高(P＜0.05～0.01)，对HSC细胞周期有明显的阻滞作用，而且这种作用呈剂量、时间依赖关系；UDCA显着抑制Ⅰ型胶原及其mRNA表达(P＜0.05～0.01)，而且这种作用呈剂量、时间依赖关系；大剂量UDCA可显着抑制cyclinD_1、cyclinE蛋白表达(P＜0.05)。3．经外源性TGFβ1诱导后，大鼠肝HSC TβRⅠ、Smad3、Smad4、Smad7蛋白表达均显着增加(P＜0.05～0.01)，Smad3、Smad7、CBPmRNA表达亦显着增加(P＜0.05～0.01)：UDCA对TGFβ1诱导HSC TβRⅠ蛋白表达及Smad4蛋白表达无影响(P＞0.05)；UDCA能够显着减少TGFβ1诱导HSC Smad3蛋白及其mRNA表达(P＜0.05～0.01)，而且这种作用呈剂量、时间依赖关系；显着减少CBPmRNA表达(P＜0.05～0.01)，而且这种作用呈剂量依赖关系；显着增加Smad7蛋白及其mRNA表达(P＜0.05～0.01)。结论：1．UDCA可显着增加免疫损伤性肝纤维大鼠体重，降低大鼠肝重和脾重；显着改善大鼠肝纤维化病理程度；显着降低大鼠血清ALT、AST、GGT、TBA，升高Alb，保护肝细胞，改善肝功能；显着降低大鼠血清透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅳ型胶原(CⅣ)和Ⅲ型前胶原(PCⅢ)水平，从而减轻肝纤维化：显着抑制大鼠肝组织Ⅰ型胶原表达，而且呈剂量依赖关系；显着抑制大鼠肝组织Ⅲ型胶原表达：大剂量UDCA能显着抑制大鼠肝组织肝纤维化细胞因子TGFβ1mRNA表达，在一定程度上阻抑肝纤维化的发展。2．UDCA对TGFβ1诱导HSC细胞增殖有显着的抑制作用，其抑制作用呈剂量、时间依赖关系；UDCA对HSC细胞周期有明显的阻滞作用，而且这种作用呈剂量、时间依赖关系；显着抑制Ⅰ型胶原分泌，呈剂量、时间依赖关系；大剂量UDCA对cyclinD_1、cyclinE蛋白有显着的抑制作用。3．UDCA对TGFβ1诱导HSC TβRⅠ蛋白及Smad4蛋白表达无影响；UDCA能够显着减少HSC Smad3蛋白及其mRNA表达，而且这种作用呈剂量、时间依赖关系：显着减少CBPmRNA表达，而且这种作用呈剂量依赖关系：显着增加Smad7蛋白及其mRNA表达，从而有效地减弱了TGFB 1的信号转导，可能是其干预TGFβ1／Smad信号转导通路，发挥阻抑肝纤维化作用的重要分子基础。
周静[6]2010年在《蛋白酶激活受体2在食管癌细胞EC109增殖及侵袭转移过程中的作用研究》文中研究指明目的:蛋白酶激活受体-2(Proteinase-actived receptors 2,PAR-2)是一种细胞膜表面受体,属于与G蛋白相耦联的蛋白酶激活受体超家族成员,广泛分布于各个系统和组织中,可被胰蛋白酶等丝氨酸蛋白酶激活。大量研究表明,PAR-2在多种消化系统肿瘤及其微环境中都有表达,且强度高于正常组织细胞,与肿瘤的增殖、侵袭和转移密切相关。食管癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一,进展较快,易发生转移,预后较差。近期研究表明,PAR-2在食管癌及食管肠上皮化生组织中表达,且其表达部位主要分布于食管腔内。据此我们推测PAR-2有可能被消化道反流液中的胰蛋白酶激活参与食管癌的进展。然而,目前并无相关的研究报道。本研究中我们采用人食管癌细胞株EC109为靶细胞,观察该细胞中蛋白酶激活受体-2(Proteinase-actived receptors 2,PAR-2)的表达情况;研究内源性PAR-2激动剂胰蛋白酶和人工PAR-2激动肽SLIGKV对该细胞增殖、侵袭转移的影响;以及胰蛋白酶及PAR-2激动肽作用前后MMP-2、MMP-9表达的改变,探讨PAR-2受体介导的食管癌细胞增殖及侵袭转移的可能分子机制。方法:1 RT-PCR法和免疫细胞化学染色法检测EC109细胞中PAR-2 mRNA及蛋白的表达情况。2细胞生长曲线、MTT法检测胰蛋白酶和PAR-2激动肽作用前后食管癌细胞EC109增殖情况。3流式细胞术(FCM)检测胰蛋白酶和PAR-2激动肽作用前后细胞周期改变情况。4 Transwell小室法检测胰蛋白酶和PAR-2激动肽作用前后细胞侵袭和迁移能力的变化。5 RT-PCR法检测胰蛋白酶和PAR-2激动肽作用前后PAR-2、MMP-2、MMP-9 mRNA表达的变化。6明胶酶谱法检测胰蛋白酶和PAR-2激动肽作用前后MMP-2、MMP-9明胶酶活性的变化。结果:PAR-2在食管癌细胞EC109中的表达1免疫细胞化学染色法结果显示,EC109细胞与抗PAR-2多克隆抗体有很强的结合反应,PAR-2蛋白表现为棕黄色,着色主要在胞膜和胞浆中。2 RT-PCR检测PAR-2的mRNA表达:结果显示EC109细胞在基因水平表达PAR-2。分别用胰蛋白酶、PAR-2激动肽SLIGKV作用于EC109细胞后发现,PAR-2mRNA表达量分别为(0.781±0.045)、(0.653±0.029),均较对照组(0.491±0.032)显着增高(P<0.05),而PAR-2反激动肽VKGILS组PAR-2 mRNA表达量为(0.463±0.036),与对照组(0.46±0.032)相比差异无统计学意义(P>0.05)。PAR-2激动剂对食管癌细胞EC109增殖的影响1 MTT及细胞计数试验检测PAR-2激动剂(胰蛋白酶和SLIGKV)对EC109细胞增殖的影响,其结果显示当作用时间相同时,SLIGKV在5-50μmol/L、胰蛋白酶在0.1-10 nmol/L浓度范围内食管癌细胞的增殖与药物浓度呈正相关,且呈浓度依赖性。当药物浓度一定时,在1-60 h时间范围内,食管癌细胞增殖与作用时间呈正相关,且呈时间依赖性。而PAR-2反激动肽始终对EC109细胞增殖无明显影响。2流式细胞术发现:在一定浓度的胰蛋白酶及PAR-2激动肽作用下食管癌细胞EC109的细胞周期显着加快,处于G0/G1期细胞的百分比明显降低,S期、G2/M期细胞百分比、细胞增殖指数(PI)明显增加,与对照组相比有显着差异(P<0.05)。而PAR-2反激动肽无此作用。PAR-2激动剂促进食管癌细胞EC109侵袭转移1 Transwell小室试验检测EC109侵袭及迁移能力的变化:在迁移试验中,一定浓度的胰蛋白酶及PAR-2激动肽作用后,EC109细胞经变形运动通过微孔膜的细胞数明显多于对照组与PAR-2反激动肽组(80.8±10.9)(62.6±8.9) vs (41.3±7.2)(45.8±8.5),(P<0.05)。在细胞侵袭试验中,药物作用后EC109细胞发挥破坏Matrigel基质胶作用,进入微孔膜内的细胞数也显着高于对照组(72.5±9.2) (59.4±8.7) vs (31.6±6.6) (36.2±9.8),(P<0.05)。2 RT-PCR、明胶酶谱检测MMP-2、MMP-9mRNA表达变化:结果显示一定浓度的胰蛋白酶及PAR-2激动肽作用后细胞MMP-9mRNA的表达量明显高于对照组及反激动肽组(0.719±0.034) (0.466±0.042) vs (0.341±0.032) (0.370±0.021),(P<0.05),细胞水解明胶的能力也明显高于对照组及反激动肽组(75.6±6.1) (60.4±4.6) vs (44.9±4.2) (39.3±5.2),(P<0.05)。而对MMP-2的mRNA表达和水解明胶的能力无明显影响(P>0.05)。结论:1食管癌细胞EC109在基因及蛋白水平表达PAR-2受体。并且,PAR-2激动剂(胰蛋白酶和PAR-2激动肽SLIGKV)可在基因水平上调PAR-2表达。2PAR-2激动剂可通过加快细胞周期促进食管癌细胞EC109增殖,其促增殖作用呈现浓度-时间依赖性。3 PAR-2激动剂可促进食管癌细胞EC109侵袭及迁移,其促侵袭迁移作用可能与上调MMP-9有关,而与MMP-2无关。
张翼[7]2009年在《1.上皮来源肿瘤中TGF-β和EGFR信号转导通路相互作用关系研究 2.新型紫杉烷类化合物Syl611和NBP071逆转肿瘤多药耐药活性及机理研究》文中认为表皮生长因子受体(EGFR)信号转导通路和转化生长因子β(TGF-β)信号转导通路是调节肿瘤发生发展的关键因素。上皮来源的恶性肿瘤中常伴随有EGFR的过表达。转化生长因子(TGF-β)是一种多功能多肽类生长因子,TGF-β及其信号转导通路对肿瘤的发生发展起重要的调节作用,我们在研究以EGFR为靶点的抗肿瘤药时发现,当EGFR活性被抑制后,试验动物的肺部出现了不同程度的纤维化,而TGF-β正是介导多种器官纤维化的重要介质,由此提示我们,在上皮来源的肿瘤中这两种信号转导通路可能存在着一定的作用关系。TGF-β1蛋白对上皮来源的肿瘤细胞具有生长抑制作用：当在培养的人肺腺癌细胞A549中加入TGF-β1蛋白时,A549的增殖受到了明显的抑制,且出现了形态学上的变化,其外观更类似于成纤维细胞。TGF-β1蛋白对上皮来源的肿瘤细胞中EGFR信号转导通路具有抑制作用,当给予人表皮癌细胞A431和人卵巢癌细胞SKOV3以TGF-β1蛋白刺激时,EGFR信号通路相关蛋白EGFR、ERK和AKT出现了不同程度的表达抑制。TGF-β信号转导通路下游Smad2/3蛋白与ERK蛋白具有直接的作用关系,我们通过免疫沉淀法观察到了A431细胞中Smad2/3和ERK蛋白一起沉淀下来,并且当在A431细胞给予TGF-β1蛋白刺激时,随Smad2/3沉淀的ERK蛋白量增多。以上结果表明,在上皮来源的肿瘤中EGFR和TGF-β信号传导通路存在着相互制约的作用关系,TGF-β1配体蛋白能抑制EGFR信号转导通路的功能,并且TGF-β下游信号蛋白Smad2/3能与ERK蛋白直接作用,提示EGFR和TGF-β信号传导通路的相互制约关系可能在于Smad2/3与ERK蛋白的直接作用。TGF-β对于肿瘤的作用也可以归纳为由多种细胞因子介导的肿瘤微环境对肿瘤生长的影响,是一种多因素多条件的复杂作用,成纤维细胞是这些调控因子中的关键因素。我们采用同组织来源的肿瘤细胞和成纤维细胞的共培养模型来观察不同培养比例条件下对肿瘤细胞生长的影响以及在共培养条件下EGFR和TGF-β信号传导通路的作用关系。研究表明,在体外共培养条件下当人肺腺癌细胞A549和人胚肺成纤维细胞HELF以2：3的比例混合时,共培养体系总体细胞的生长、肿瘤细胞集落形成能力都受到了最大程度的抑制,在此条件下,细胞培养液中TGF-β1蛋白的含量最高,并且由间接免疫荧光试验表明此条件下的EGFR的活性也相对较低,提示这种抑制作用可能来源于EGFR和TGF-β信号传导通路的拮抗关系。在体内共培养条件下,随着共同与小鼠Lewis肺癌细胞接种的小鼠上皮成纤维细胞的增加,Lewis肺癌荷瘤率降低,并且瘤重受到了一定程度的抑制；免疫组化试验结果发现,随着共同接种的小鼠上皮成纤维细胞的增加,肿瘤组织中TGF-β1表达量增加,EGFR信号转导通路相关蛋白表达有一定程度的降低,以上结果提示,体内共培养模型的抑制作用也可能来源于EGFR和TGF-β信号传导通路的拮抗关系。综上所述上皮来源的肿瘤中存在着EGFR和TGF-β信号传导通路的拮抗关系,TGF-β信号可能通过其配体,下游Smad2/3蛋白产生对EGFR信号通路的干扰。但是这是一种多种因素决定的复杂作用,大量的文献数据表明在不同来源的、不同发展程度的肿瘤中存在着不同程度亦或是相反的作用关系。本研究探索和发现了TGF-β与EGFR信号转导通路在上皮来源的肿瘤中的干扰及机制,初探了成纤维细胞介导的肿瘤微环境与肿瘤发生发展的关系及其内在的TGF-β的作用,将为探索更为安全有效的肿瘤治疗手段提供理论依据和实验数据。近50年来,随着现代癌症研究的深入和科技的进步,出现了大量的新型抗肿瘤药物,但随之出现的肿瘤药物耐药性却成为癌症治疗的最大障碍,其中化学药物导致的多药耐药(Multidrug Resistance, MDR),致使肿瘤患者缺乏有效的治疗药物,为现代肿瘤治疗及抗肿瘤药物开发提出了严峻的挑战。机制研究表明,肿瘤多药耐药产生的机制非常复杂,用以克服肿瘤多药耐药是目前肿瘤化学治疗的一个难点,极富挑战性,其中MDR逆转剂已成为重要的治疗手段。在MDR逆转剂研发中,以P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)为靶点的药物研究最为丰富。以维拉帕米、环孢素A为代表的第一、二代P-gp抑制剂虽然具有良好的逆转活性,但是严重的心脏毒性限制了他们的临床应用。目前,新型P-gp抑制剂或具有新作用机制的MDR逆转剂成为克服多药耐药策略的重要研究方向。Taxinine是一种非紫杉醇类紫杉烷化合物(Non-Paclitaxel Taxanes),其抗肿瘤活性远远低于紫杉醇,大量的研究表明,此类化合物具有一定的MDR逆转活性。Sinenxan A是从人工培养的Taxus yunnanensis经过生物合成的一类紫杉烷类化合物,具有来源丰富等特点。本所化学合成室尹大力研究员和生物合成室戴均贵研究员以Sinenxan A为原料,对其进行了有目的的结构改造,合成了一系列全新的紫杉烷化合物。我们通过体外逆转活性筛选得到了两个具有细胞毒性低,逆转活性强的化合物Syl611和NBP071。通过MTT法测定耐药肿瘤细胞在单独给予紫杉醇(Paclitaxel)和Paclitaxel与逆转剂合用条件下的耐药肿瘤细胞A549/Paclitaxel存活率,以逆转倍数(Reversal Folds, RF)表示的逆转剂活性结果表明,在34个Syl系列及42个NBP系列紫杉烷类衍生物中,Syl611和NBP071具有强于阳性对照药Verapamil的逆转活性。在初步逆转活性筛选的基础上,我们还观察了Syl611和NBP071对其他两对耐药肿瘤细胞的逆转活性,结果显示,Syl611和NBP071对不同种类的耐药肿瘤细胞具有不同强度的逆转活性,且均强于Verapamil,并且我们还观察到Syl611和NBP071对这3对耐药细胞的逆转活性程度不同,Syl611对Be17402/5-FU的逆转倍数最高(RF=107.13),而NBP071对A549/Paclitaxel的逆转倍数最高(RF=300.41)。由于此类紫杉烷类逆转剂是同抗肿瘤药物共同作用于耐药细胞,逆转剂本身是否具有细胞毒性决定了逆转剂的成药性和开发潜力。在利用MTT法检测Syl611和NBP071对3对耐药肿瘤细胞及其亲本及一株正常细胞的细胞存活率时,我们发现Syl611和NBP071具有极低的细胞毒性,由此Syl611和NBP071与Paclitaxel合用时所导致的细胞存活率显着降低并不是由其本身的毒性所引起的。Pacltaxel主要通过与肿瘤细胞微管蛋白β结合,促进微管聚合抑制微管解聚从而阻滞细胞于G2／M期,诱发肿瘤细胞凋亡或坏死而达到抗肿瘤效果。为了更直观地观察逆转剂与Paclitaxel合用后对细胞凋亡的影响,我们采用AO/EB双染法通过荧光显微镜观察了逆转剂对耐药肿瘤细胞A549/Paclitaxel细胞凋亡的影响,结果表明,Syl611和NBP071都能明显地促进肿瘤细胞的凋亡,且比Verapamil的逆转作用更强,但其自身则不能明显促进肿瘤细胞的凋亡,从而进一步证明了Syl611和NBP071具有低毒和高逆转耐药作用的特点。为了探索Syl611和NBP071逆转肿瘤耐药的作用机制,我们观察了Syl611和NBP071对耐药肿瘤细胞周期分布、药泵相关蛋白的mRNA表达、药泵P-gp蛋白表达、通过罗丹明123(Rhodamine123, Rh123)为指示的细胞内药物浓度、UV-HPLC检测的细胞内Paclitaxel药物浓度以及Caco-2单层细胞膜模型药物跨膜转运能力的影响来探讨Syl611和NBP071的逆转耐药作用机制。研究发现,Syl611对耐药肿瘤细胞A549/Paclitaxel和KB／V的细胞周期分布无明显影响,但是NBP071能显着地增加KB／V细胞S期的细胞比例,减少G2／M期的细胞比例,提示了它们可能具有不同的逆转耐药作用机制。在以RT-PCR检测逆转剂对耐药肿瘤细胞药泵相关蛋白的mRNA表达的结果发现,Syl611和NBP071自身及与Paclitaxel合用时均不能影响叁类药泵蛋白mRNA的表达(MDR1、BCRP和MRP),此外以中度P-gp表达的KB／V为模型检测P-gp的表达量也不会被Syl611和NBP071所影响,由此Syl611和NBP071对耐药肿瘤细胞药泵自身无影响,其逆转耐药的作用靶点不在于影响药泵蛋白本身,预示了它们可能具有较低的毒副作用。Rh123蓄积试验发现,作为P-gp底物的Rh123在肿瘤细胞KB／V给予逆转剂Syl611后,细胞内Rh123的含量增加,且比阳性对照药Verapamil的作用更强,但是NBP071不能增加耐药肿瘤细胞KB／V内的Rh123的蓄积量。此试验结果提示,Syl611可通过类似于Verapamil的作用来抑制P-gp的药物外排泵的功能从而增加药物在细胞内的蓄积量而达到逆转肿瘤耐药的作用。为了进一步验证Syl611的P-gp功能抑制作用,我们采用UV-HPLC检测了KB／V细胞内的Paclitaxel的蓄积量,得到了类似于Rh123蓄积试验的结果,由此说明Syl611的逆转耐药作用机制在于对P-gp药物外排功能抑制。在Caco-2单细胞膜跨膜转运模型试验中,我们意外地发现Syl611能增加Paclitaxel从细胞模型的基底BL侧到肠腔AP侧的转运和AP侧到BL侧的转运,且具有明显的剂量依赖关系和时间依赖关系,而阳性对照药Verapamil却能明显地抑制这种转运作用。但是Syl611的这种增加作用,由BL侧到AP侧转运量和AP侧到BL侧转运量的比值来看,Syl611能剂量和时间依赖性地降低该比值,而该比值的量反应了药物在细胞内蓄积的数量,比值越小表示细胞内的药物浓度越高,因此该试验结果与Rh123蓄积和HPLC检测细胞内药物含量试验的结果一致,并且说明Syl611的逆转耐药机制与Verapamil不尽相同。由于介导药物的跨膜转运除P-gp外还有多种作用形式,因此Syl611可能通过其他途径增加细胞内药物的含量,并不是单纯地抑制P-gp的功能。正常细胞也存在P-gp的表达,是正常生理功能的介导因素,由于Verapamil等多药耐药逆转剂对P-gp功能的抑制作用,致使临床使用时出现广泛的多器官的毒副作用,而Syl611不具备此特点,因此可以初步推测Syl611将不具有P-gp抑制剂的毒性特征。综上所述,我所开发的新型紫杉烷类化合物Syl611和NBP071具有结构新颖,原料来源丰富,较强的逆转肿瘤多药耐药活性和极低的细胞毒性等特点,其中Syl611的作用机制与Verapamil抑制P-gp的功能有所不同,因此推测Syl611可能具有较低的毒副作用。NBP071未观察到对P-gp药物外排功能的影响,但是其能明显地改变肿瘤细胞周期分布,为此我们推测NBP071的逆转肿瘤多药耐药活性在于改变耐药肿瘤细胞的周期分布,使耐药细胞更多的处于抗肿瘤药物的有效作用阶段,从而增加耐药肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性,但是具体作用机制还需进一步探讨。Syl611和NBP071具有广阔的药物开发前景和经济价值,将为肿瘤耐药患者的治疗带来福音。
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