孙德宇, 李光, 何文贵, 陈琦[1]2005年在《X射线照射对脐血淋巴细胞增殖和NK细胞活性的影响》文中研究说明[目的]观察X射线照射对脐血淋巴细胞增殖和NK细胞活性的影响。[方法]①采用3H-TdR掺入法检测不同剂量(0.25Gy～16Gy)X射线辐射对脐血淋巴细胞增殖活性的影响。②采用3H-TdR释放法检测不同剂量(0.25Gy～16Gy)X射线照射对脐血NK细胞活性的影响。[结果]0.25Gy～16Gy剂量范围X射线照射抑制淋巴细胞增殖活性,抑制程度与辐照剂量呈正相关(r=0.839,P<0.05),其中4Gy～16GyX射线照射未发现其明显的增殖活性;0.25Gy～2GyX射线可引起脐血NK细胞活性的显着增高,4GyX射线保持NK细胞活性,6Gy～16GyX射线可引起脐血NK细胞活性显着性降低。[结论]4GyX射线照射完全抑制脐血淋巴细胞的增殖的同时仍呈现脐血NK细胞抗肿瘤活性。因此,在进行供者淋巴细胞输注或混合脐血移植时,应用4GyX射线照射脐血细胞,再进行过继性细胞免疫治疗可能降低移植物抗宿主病效应,同时不影响移植物抗白血病效应。
孙德宇[2]2003年在《X射线照射对脐血淋巴细胞增殖和NK细胞活性的影响》文中指出前言 幼稚性及表型不成熟的脐血造血细胞和免疫细胞，降低了脐血移植(CBT)的移植物抗白血病(graft versus leukemia，GVL)效应，增加了脐血移植复发几率。采用同供者淋巴细胞输注(Donor Lymphocyte Infusion，DLI)可治疗脐血移植后的肿瘤复发，但由于存在较高的移植物抗宿主病(GVHD)发生率、高死亡率限制了它的应用范围。为增加脐血移植(CBT)的成功率及降低疾病复发率可采用混合脐血移植，但混合脐血移植可能会增强移植物抗宿主病(GVHD)的发生程度和发生率。本研究观察了不同剂量电离辐射对脐血淋巴细胞增殖活性和NK细胞体外抗肿瘤活性的影响，以初步探讨电离辐射在脐血移植中的临床应用价值。 实验材料与方法 一、材料 K526细胞：辽宁省肿瘤研究所 ~3H-TdR：购自中国原子能研究院 刀豆蛋白A(ConA)购自美国Sigma公司 脐血采自中国医大二院、空军463医院 Varian 6MV X线直线加速器，来自辽宁省肿瘤医院 二、方法 无菌条件下穿刺脐静脉采集37-42周龄足月正常分娩的新生儿脐带血，体外肝素抗凝(20IU/ml)。采血6小时内应用常规密度梯度离心法分离脐血单个核细胞(MNC)，RPMI1640培养液（Hyclone）洗涤2次，最后加入含10％胎牛血清的 RPMI1640培养液，计数并调整细胞浓度。 （1）脐血淋巴细胞增殖的测量 取已分离的单个核细胞，调至细胞浓度二X10Vml，以10P牙Inl刀豆蛋白 A（Con A）刺激增殖，37T，5％CO卜饱和湿度条件下培养24 ／J’时。接受不同剂量N．25 Gy，0．5 Gy，IGy，2 Gy，4 Gy，6Gy，8 Gy，16Gy以射线照射。照射后立即置于 96孔培养板，取 4个平行样本，每孔加1皿…，继续培养56小时后加h－＊dRO卜＊y孔）再培养8小时后用多头细胞收集器收集细胞，置于49型玻璃纤维膜上，静置过夜，将干燥的滤纸加人液烁瓶中，用Beckman液体闪烁计数器计数放射性核素每分钟闪烁数＊PM值人淋巴细胞的增殖反应用刺激指数瞩I）评价，SI＝实验孔CPM均血对照TLCPM均值，通常SI＞2即有意义。 ＊）脐血NK纲胞活性的测量 ①取传代培养48小时的K562细胞为靶细胞，台盼蓝拒染试验测定细胞活力，应达到 98％以上。调整浓度 IX 106／nd，加人V－TdRO 乃7T，5％COh饱和湿度条件下培养，孵育 6 ／J’时，洗涤 2次去除游离的’H－TdR，再制备成 5 X 105／d细胞悬液备用。 ②脐血单个核细胞洗涤2次后，调整纲胞浓度为 IX 10Vrnl作为效应细胞（效靶比20：U，予以上述不同剂量X射线照射。将效应细胞与制备好的靶细胞每孔各加 100gi置于 96孔培养板，设4个平行样。同时设靶细胞对照组。于37 t，5％CO”饱和湿度条件下继续培养18小时后收集细胞，置于49型玻璃纤维膜上，静置过夜，将干燥的滤纸加人液闪瓶中，用Becklnan液体闪烁计数器计数放射性核素CPM值。 ·2· 实验结果 0．25叶 Gy剂量范围X射线照射抑制淋巴细胞增殖活性，抑制程度与辐照剂量呈正相关卜＝0．839，P＜O．仍L其中4叶6呵射线照射未发现其明显的增殖活性；0．25－2 GyX射线可引起脐血NK细胞活性的显着增高，4GyX射线保持NK细胞活性，6－16GyX射线可引起脐血 NK细胞活性显着性降低。 讨 论 提高移植物抗白血病GVL效应、降低疾病复发率是目前脐血移植研究的重要目标。如何控制脐血移植后供者淋巴细胞输注和混合脐血移植的移植物抗宿主病（GVHD）也是急待解决的一个问题。张立成等认为 7．SGyX射线照射供者淋巴细胞后输注能减轻移植物抗宿主病（GVHD）发生的同时保留抗白血病作用。Waller等报道了异体骨髓移植复发的患者接受7．SGy照射的供者淋巴细胞输注，疗效满意，移植物抗宿主病（GVHD）发生亦明显降低。小于3岁婴幼儿的淋巴细胞功能相对幼稚，表现出对辐射更强的敏感性，其增殖活性也与脐血相似。 本研究表明：应用 4Gyx射线照射完全抑制脐血淋巴细胞增殖的同时仍保持NK细胞抗肿瘤活性。因此，在进行供者淋巴细胞输注或混合脐血移植时，4GyX射线照射脐血细胞，再进行过继性细胞兔疫治疗可降低移植物抗宿主病做发生同时保持移植物抗白血病效应。脐血移植复发的患者接受 4Gy照射的供者淋巴细胞输注，可以减轻移植物抗宿主病（GVHD）的发生程度，降低发生率，同时不降低移植物抗白血病GVL效应。 ·3· 结 论 4GyX射线照射完全抑制脐血淋巴细胞的增殖的同时仍呈现脐血NK细胞抗肿瘤活性。因此，在进行供者淋巴细胞输注或混合脐血移植时，应用4GyX射线照射脐血细胞，再进行过继性细胞免疫治疗可能降低移植物抗宿主病效应，同时不影响移植物抗白血病效应。
张志军[3]2007年在《低剂量辐射诱导人骨髓间充质干细胞兴奋性及信号机制的体外研究》文中提出1980年,Luckey发现低剂量辐射(LDR)可以刺激细胞的代谢活性,比如DNA和蛋白的合成,他把这种现象叫做兴奋性。到目前为止,整个前期实验表明,暴露在LDR的体内或者体外实验能够提高细胞的代谢活性,包括DNA、RNA和蛋白的合成,DNA的损伤修复、抗氧化活性以及促进骨髓细胞的向外周血的动员等。有关LDR诱导血液系统细胞的生物学反应研究较少,所以LDR在造血系统中的生物学效应并不十分清楚。本研究首次应用体外培养的人源骨髓MSC进行LDR照射,并按照25mGy、75 mGy和200 mGy叁种剂量观察照射后4h、24h、48h和72h四个时间点的细胞增殖的变化,发现在众多剂量和时间点中,75mGy照射后24h细胞的增殖是最明显的,而体外K562则不具有上述增殖效应。本研究在观察LDR诱导MSC增殖的信号传导效应方面首次发现LDR是通过P38MAPK途径引起P21、P53表达下降从而介导MSC细胞的增殖反应的,75mGy照射后4h-24h磷酸化P38MAPK表达均上调,其中以12h表达最明显,抑制P38MAPK激酶活性后细胞增殖程度下降,同时P21、P53恢复到对照组水平。本研究首次发现LDR诱导的细胞增殖最佳时间点和诱导细胞磷酸化P38MAPK表达的最佳时间点并不一致,照射后磷酸化P38MAPK表达的高峰期比细胞增殖高峰期要早,这说明LDR是通过P38MAPK信号途径调节细胞核内的相关基因后再引起细胞增殖兴奋性效应的。
吴明媛[4]2005年在《脐血衍生的树突状细胞体外诱导调节因素及其生物学功能研究》文中研究表明树突状细胞(Dendritic eells,DCs)是目前所知的机体内功能最强的专职性APC,能够有效地摄取、加工及提呈抗原,通过其表面B7、MHC-Ⅱ和ICAM-1等分子的表达,刺激CD4~+T细胞的活化增殖,促进IL-2的分泌,在双信号刺激下,最终活化CD8~+T细胞,产生免疫应答效应。脐血中富含的CD34~+造血祖细胞与骨髓和外周血相比,数量更多,具有更强的增殖潜能,是DCs的理想来源。体外,不同细胞因子联合可诱导CD34~+造血祖细胞分化为DCs,在肿瘤免疫、移植免疫和抗感染免疫等方面发挥效应。脐血CD34~+造血祖细胞来源的DCs分化发育和成熟经历了一系列复杂而精细的调节过程,探讨DCs分化发育、成熟过程的调节因素及其生物学功能,将有助于开展以DCs为佐剂的生物治疗。 本研究优化了体外扩增、诱导CD34~+造血祖细胞产生DCs的方案,首次系统分析脐血CD34~+造血祖细胞来源DCs分化成熟过程中共刺激分子的表达及其相互作用,比较CD40、TNF-α和4-1BBL叁条信号途径对DCs分化成熟和生物学功能的影响,探讨脐血贴壁细胞来源DCs相关抗原和共刺激分子的表达及其生物学功能,以期扩大DCs的来源,通过干预CD40/CD40L、4-1BB/4-1BBL、PD-1/PD-L1/PD-L2等几对重要的共刺激分子来调节脐血衍生的DCs生物学功能,为肿瘤免疫和移植免疫的临床应用提供实验和理论依据。 第一部分 脐血CD34~+造血祖细胞体外诱导树突状细胞的优化方案及其调节因素 目的:体外定向诱导CD34~+造血祖细胞产生髓系DCs,比较不同细胞因子组合对CD34~+造血祖细胞扩增效率及其生物学功能的影响,建立体外扩增诱导脐血CD34~+造血祖细胞产生DCs的优化方案。
苑小星[5]2007年在《低剂量辐射激活的脐血干细胞重建造血功能的体内研究》文中研究说明自20世纪80年代以来，低剂量辐射(LDR)的兴奋效应和适应性反应日益受到人们的关注。近年来发现LDR对造血系统也存在兴奋效应，体外实验已有报道LDR可促进骨髓造血干／祖细胞增殖，诱导T.B细胞成熟，抗肿瘤转移和复发作用。造血干细胞的临床应用前景日益广阔，除应用于血液系统及其他系统恶性肿瘤治疗外，现已应用于多种遗传病、自身免疫性疾病、局部血管病变等相关性疾病的治疗。脐带血(UCB)因其来源丰富且制备便利，已成为用于临床移植的造血干／祖细胞(HS／PCs)的重要来源，脐血干细胞移植(UCBT)近年来受到国内外学者的高度重视。可以预见LDR激活后的脐血用于临床，在刺激造血、增强免疫力和抗肿瘤方面，均可优于活化前的脐血。那么，LDR能否作为一种新的优化方法而应用于临床呢?主要取决于LDR激活的脐血HS／PCs是否具有快速重建造血的能力，为证实这一问题，我们进行了LDR激活的脐血干细胞重建造血性能的研究，从而为LDR作为一种优化脐血干细胞移植的新方法奠定理论和实践基础。我们提取脐血单个核细胞作为移植物，采取经胫骨骨髓腔移植方法，通过对脐血和(或)移植后小鼠进行低剂量辐射而将其兴奋效应引入体内。实验中依LDR应用方式将87只NOD／SCID小鼠随机分组如下：照射对照组：小鼠经350cGy亚致死剂量照射后不进行任何处理；实验组：①CB-MNC组：小鼠经350cGy亚致死剂量照射后于4～6h内输注CB-MNC：②CB-MNC+LDR组：小鼠经350cGy亚致死剂量照射后4～6h内输注CB-MNC，约12小时后给予75mGy低剂量辐射；③LDR CB-MNC组：脐血经75mGy低剂量辐射后于4-6h内分离获得MNC，输注给经350cGy亚致死剂量照射后小鼠；④LDR CB-MNC+LDR组：脐血经75mGy低剂量辐射后4-6h内分离获得MNC，输注给经350cGy亚致死剂量照射后小鼠，约12小时后给予75mGy低剂量辐射。其中LDR CB-MNC在脐血分离前4小时内进行，LDR-Mice在移植后约12小时进行，对于第④组LDR CB-MNC和LDR-Mice间隔时间约为24小时。为保证LDR效应的观察时间一致性，②③④组的第一取材时间点为末次LDR后48h，而后各组均在移植后7d、14d、21d时处死小鼠(对于每个取材时间点，每组各取5只小鼠进行检测)。结果表明，移植组小鼠存活率为95％。存活小鼠骨髓、脾脏、外周血细胞均可以检测到人类基因组中特异性Alu基因的表达(+21d)。各组小鼠骨髓细胞均有人CD34和CD45分子表达，且高于移植前脐血中含量；+21d时应用LDR各组小鼠骨髓中CD34~+CD45~+细胞比率高于单纯移植组。移植后，而应用LDR各组小鼠骨髓中CD49d~+细胞比率起初为较低水平(+3d，p＜0.05)，而后开始上升；+21d时，各组差异无统计学意义(p＞0.05)。受鼠外周血象水平均有大幅度下降，+10d~+14d时血象达最低，而后开始上升。应用LDR各组叁系恢复均早于CB-MNC移植组，在血象恢复期，实施LDR各组WBC、Plt计数和Hb含量均明显高于单纯移植组(p＜0.05)：+21d时LDR各组白细胞计数恢复正常，而CB-MNC移植组尚未达到正常水平；此时各组Hb和Plt均恢复正常。+21d时脾脏明显增大，脾指数明显增加，与单纯移植组相比，应用LDR各组更为明显(p＜0.05)。上述结果表明：植入人源细胞后后受鼠骨髓能够腾出“龛位”供脐血干细胞植入，并且提供HS／PCs分化的造血微环境，UBSCs在小鼠骨髓中积极的增殖分化、发挥造血功能：LDR行使其对造血系统的兴奋效能：LDR后在受鼠体内造血干／祖细胞有更强的增殖和分化能力，而且移植前对脐血细胞LDR和移植后对小鼠进行LDR二者协同发挥了兴奋放大效应，为LDR作为一种优化脐血移植的新策略奠定理论和实践基础。
田雪莲[6]2008年在《青蒿水提物对人髓系白血病细胞株K562的增殖抑制作用及机理研究》文中研究表明目的慢性粒细胞白血病(CML)是一种起源于多能造血干/祖细胞恶性增殖性疾病,在我国发病率约0.36/10万,占各类白血病的20%。目前治疗方法主要以干扰素、骨髓移植、酪氨酸激酶抑制剂为主,但存在费用昂贵、骨髓来源受限、疗效不理想、耐药性等问题。从祖国医学宝库中寻找出既能抑制白血病细胞恶性增殖,副作用相对较小的天然药物已成为治疗白血病的重要途径。青蒿素是传统中药分离提取的含特殊过氧基团的倍半萜类化合物,它是被世界卫生组织认定为治疗恶性疟疾唯一有效药物,也是我国医学领域中为数不多的被国际认可的一类新药。近年研究证明:青蒿素的衍生物有150多种,人们仅对其中几种衍生物的抗肿瘤作用进行了研究,但这些衍生物大多属于脂溶性或醇溶性药物,在实际应用中带来诸多不变,并且大大影响其用药效果。据此,课题组从青蒿中提取到一种水溶性成分,观察它对人慢性髓系白血病细胞株K562、人脐血单个核细胞和移植性人白血病模型小鼠的药理作用,探讨其作用机理,为寻找出具有抗癌活性而毒副作用低的水溶性青蒿素衍生物提供理论与实验依据。方法1.采用MTT比色法检测青蒿水提物对K562细胞增殖抑制的作用;光、电镜下观察青蒿水提物作用后的K562细胞形态学变化特征;流式细胞术AnnexinV-FITC加碘化丙啶(PI)双染定量检测在不同浓度、不同时间作用下青蒿水提物诱导K562细胞和正常人脐血单个核细胞的细胞凋亡率和胀亡率。2.采用荧光分光光度计检测青蒿水提物作用下的K562细胞膜流动性变化;激光扫描共聚焦显微镜技术检测青蒿水提物作用下的K562细胞内游离[Ca2+]变化,细胞线粒体膜电位变化。3.采用尾静脉移植K562细胞的方法在SCID小鼠建立白血病模型。在成功建立人类移植性白血病模型的基础上,给予模型小鼠腹腔注射青蒿水提物的治疗。通过比较发病情况、生存期、外周血象和骨髓象分析,检测bcr-abl癌基因的表达等方面观察青蒿水提物对荷瘤小鼠的影响。结果1.青蒿水提物对K562细胞有一定的促进分化和明显的增殖抑制作用,24h、48h、72h的半数抑瘤浓度IC50 (μg/ml)分别为65.17、31.63、10.51。青蒿水提物主要引起K562细胞的凋亡和胀亡变化,其凋亡率与胀亡率无明显差别。一定浓度的青蒿水提物对脐血单个核细胞无明显抑制作用。2.青蒿水提物可增加K562细胞膜流动性,有明显量效、时效关系;青蒿水提物可使K562细胞内的游离[Ca2+]升高,并有一定剂量依赖性;当增加细胞外液[Ca2+]浓度后,K562细胞内[Ca2+]增加;在细胞外液中加入钙离子抑制剂以后,胞内[Ca2+]降低。一定浓度的青蒿水提物引起K562细胞线粒体膜电位的下降。3.采用尾静脉移植K562细胞的方法在SCID小鼠建立白血病模型,接种第四周就可在外周血涂片中观察到白血病细胞。在小鼠的肝、脾、肾、外周血、骨髓等检测到人白细胞浸润,部分小鼠有实体瘤生成。4.移植性白血病模型小鼠给予青蒿水提物腹腔注射治疗,小鼠的一般状况较对照组明显改善,体重较对照组降低程度变轻,生存期延长;小鼠的外周血白细胞数明显减少;骨髓象粒细胞中成熟粒细胞比例增加;仅在小鼠外周血检测有bcr-abl表达,骨髓细胞、肝、脾等未检测到bcr-abl表达。结论1.青蒿水提物对体外培养的K562细胞的增殖抑制作用有促进细胞凋亡和胀亡两种方式,且两种方式作用比较无差别。2.≤50μg/ml浓度的青蒿水提物对人脐血单个核细胞无明显抑制作用。3.青蒿水提物对K562细胞的增殖抑制主要作用于细胞膜,可促进细胞膜通透性改变,进一步引起细胞内钙离子浓度增高,线粒体膜电位下降,从而诱发K562细胞凋亡和胀亡。4.通过尾静脉注射K562细胞到SCID小鼠的方法可以成功建立人类移植性白血病模型。5.青蒿水提物对移植性白血病模型鼠有一定的治疗作用。
张永卓[7]2005年在《人胎盘组织源造血干/祖细胞的初步研究》文中进行了进一步梳理研究目的:随着造血干细胞的研究进展,造血干细胞移植已成为恶性血液病和某些实体瘤病人的一种有效治疗手段。骨髓、外周血和脐血是目前造血干细胞的理想来源,但是由于骨髓和外周血来源的造血干细胞存在易受病毒感染和随着年龄的增长而造血干细胞的增殖和分化的能力下降的缺陷,而脐血造血干细胞移植受到单份脐血数量少的限制等因素,不能满足日益增长的造血干细胞的临床需求,寻找新的造血干细胞来源已成为一个亟待解决的问题。近年来国内外有在胎盘中寻找到造血干细胞的报道,本实验旨在系统探讨足月胎盘组织源单个核细胞(human placenta tissue-derived mononuclear cells,hPTMNCs)中CD34~+细胞体外增殖、分化能力,寻找新的造血干/祖细胞来源供基础研究和临床造血干细胞移植应用。 对象和方法:(1)胎盘组织和与其对应的脐血10份:在无菌的条件下,分别采集足月健康顺产分娩孕妇的胎盘及与其对应的脐血。(2)单个核细胞制备:剪切胎盘组织呈1～2mm~3大小的组织块,用酶消化的方法经100目的细胞筛过滤制备胎盘组织源单个核细胞悬液;用淋巴细胞分离液分别分离脐血源和胎盘组织源单个核细胞。(3)分别采用流式细胞仪、造血干/祖细胞集落培养、体外无细胞因子长期培养的方法测定胎盘组织源和脐血源CD34~+细胞及亚群和集落形成单位在培养前、培养过程中数量变化。(4)用统计学分析软件包SPSS10.0进
参考文献：
[1]. X射线照射对脐血淋巴细胞增殖和NK细胞活性的影响[J]. 孙德宇, 李光, 何文贵, 陈琦. 中国肿瘤. 2005
[2]. X射线照射对脐血淋巴细胞增殖和NK细胞活性的影响[D]. 孙德宇. 中国医科大学. 2003
[3]. 低剂量辐射诱导人骨髓间充质干细胞兴奋性及信号机制的体外研究[D]. 张志军. 吉林大学. 2007
[4]. 脐血衍生的树突状细胞体外诱导调节因素及其生物学功能研究[D]. 吴明媛. 苏州大学. 2005
[5]. 低剂量辐射激活的脐血干细胞重建造血功能的体内研究[D]. 苑小星. 吉林大学. 2007
[6]. 青蒿水提物对人髓系白血病细胞株K562的增殖抑制作用及机理研究[D]. 田雪莲. 重庆医科大学. 2008
[7]. 人胎盘组织源造血干/祖细胞的初步研究[D]. 张永卓. 郑州大学. 2005