贾伟利 郭光辉 刘雄伟
（深圳市龙岗中心医院检验科 广东深圳 518000）
【摘要】目的：在宫颈癌患者血清中筛选差异表达的microRNA（miRNA）,寻找早期诊断宫颈癌的血清标志物。方法：采集50例宫颈癌患者和30例健康妇女血清标本，提取血清中RNA，利用Microarray基因芯片方法在病例组20例和对照组20例混合血清样本中筛选差异表达的miRNA，采用实时荧光定量PCR对差异表达的miRNA验证，并绘制ROC曲线分析这些miRNA在诊断宫颈癌的价值。结果：Microarray芯片检测结果显示在宫颈癌患者血清中存在miRNA差异表达，其中表达上调的5个，分别为miR-21、miR-25、miR-205、miR-486-5p和miR -148a，表达下调的2个，分别为miR-143和miR-372。实时荧光定量PCR验证筛选出的miRNA，与芯片筛选的结果一致。选取差异表达最显著的3个miRNA（miR-25、miR-205、miR-486-5p）作为诊断宫颈癌的候选标志物，其ROC曲线下面积分别为0.972、0.949和0.944，通过最佳临界值分析，其诊断宫颈癌的灵敏度和特异性分别为92%、93.3%，90%、96.7%和90.0%、90.0%。结论：宫颈癌患者血清中存在miRNA表达异常，miRNA是诊断宫颈癌的潜在的血清标志物。
【中图分类号】R730.4 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2015）11-0078-02
宫颈癌是女性最常见恶性肿瘤之一，病死率居发展中国家女性肿瘤之首位。全球每年大约有50万新发宫颈癌病例，其中80%以上的病例发生在发展中国家[1]，我国每年新发病例约3万，约占世界宫颈癌新发病例的28.8%，并呈年轻化及上升趋势[2]。因此急需选取一种比较适合发展中国家的实验室筛查方法，以早期诊断宫颈癌。microRNA（miRNA）是一组长约22个核苷酸的非编码小分子RNA，通过转录后水平调控细胞的增殖、分化、凋亡等生命活动[3，4]。近几年的研究发现 microRNA 表达具有明显的组织细胞特异性，且与肿瘤的发生和发展有着密切联系。最近在外周血中也检测到miRNA的存在，且发现循环miRNA的表达与肿瘤也有一定的相关性，这提示miRNA可作为一种新型的血清肿瘤标志物。因此本文通过miRNA芯片筛选出宫颈癌特异的miRNA，再经过荧光定量PCR（RT-qPCR)验证已筛选出的特异miRNA，最后通过荧光定量PCR检测血清中这些miRNA，利用受试者工作特征曲线(ROC)来评估候选miRNA在宫颈癌诊断中的价值。
1.资料与方法
1.1 临床资料
2012年6月至2015年1月在深圳龙岗中心医院治疗的50例宫颈癌患者为研究对象（病例组），病理诊断均为鳞状细胞癌，年龄26～68岁，并选择同期体检健康妇女30例作为正常对照组，年龄27～69岁。两组年龄差异无统计学意义（P＞0.05）。
1.2 标本收集
所有病例组血液标本均在治疗前清晨空腹采集，对照组在清晨体检时一并留取，2000r/min离心10min后取上清，-70℃保存备用。
1.3 Microarray芯片筛选
分别将20例病例组血清混合与20例对照组血清标本混合，提取总RNA，通过Microarray芯片进行miRNA表达检测，利用U6snRNA进行校正比较两组miRNA的差异表达，筛选出差异表达≥2倍的miRNA，进一步验证。
1.4 实时荧光定量PCR
1.4.1 miRNA使用天根生化科技(北京)有限公司的miRcute miRNA提取分离试剂盒(离心柱型)，按试剂说明书 A 方案进行操作。
1.4.2 miRNA反转录反应 参照 One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit 合成 cDNA，-70℃保存。
1.4.3实时荧光定量PCR 检测 使用7300型序列检测系统(ABI公司产品)，每个反应孔为20μL反应体系，包括1μL逆转录产物、0.33μL miRNA Taqman引物、18.67μL体系混合物Ⅱ。反应体系在PCR仪上温度设定为:95℃15 s，60℃1min，进行 40个循环。
1.5 数据分析
以 miR-let7 作为内参，miR-16建立标准曲线，参照Chen 等[5]描述绝对表达量计算方法，计算出差异表达 miRNA的绝对含量。Ct值为反应过程中实时荧光强度到达设定的阈值时所经过的扩增循环数，此时扩增呈对数增长，Ct值与标本起始拷贝数成反比。
1.6 统计学分析
采用 SPSS 19.0软件进行处理。组间比较采用配对t检验，相关性分析用 χ2检验。以 P＜0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1 Microarray芯片杂交结果
Microarray芯片杂交结果显示病例组和对照组分别检出385和378个miRNA的表达，筛选出在病例组中有5个表达上调的miRNA（miR-21、miR-25、miR-205、miR-486-5p和miR -148a），2个下调的miRNA（miR-143和miR-372）
2.2 RT-qPCR验证Microarray芯片筛选出的miRNA
在病例组50例患者和对照组30例的血清样本中，利用 RT-qPCR方法逐个验证上述7个miRNA，并计算绝对含量。结果发现，miR-21、miR-25、miR-205、miR-486-5p和miR -148a 在病例组中表达上调，miR-143和miR-372表达下调（见表1），与芯片结果一致，其中 miR-25、miR-205、miR-486-5p明显上调，作为候选的宫颈癌标志物，并利用ROC曲线评估其在在宫颈癌诊断中的价值
表1 两组血清中miRNA表达差异比较
图1 3种miRNA的ROC曲线
2.3 miR-25、miR-205、miR-486-5p 的ROC曲线分析 RT-qPCR检测50例病例组和30例对照组血清中miR-25、miR-205、miR-486-5p的浓度结果见表1，并运用SPSS软件进行ROC分析（见图1），miR-25、miR-205、miR-486-5p的ROC曲线下面积(area under the ROC curve，AUC)分别为0.972、0.949和0.944。通过最佳临界值分析，得到这3个miRNA 的最佳临界值分别为:35.11fmol/L、59.05fmol/L、7.00fmol/L，其诊断宫颈癌的灵敏度和特异性分别为92%、93.3%，90%、96.7%和90.0%、90.0%。
3.讨论
宫颈癌目前仍然是世界各地妇女死亡的主要原因之一，尤其是在发展中国家，许多宫颈癌妇女的死亡都与晚期诊断和治疗失败有关。而及时发现早期宫颈癌，及时恰当的处理，治愈率几乎达100%。因此急需选取一种有较高灵敏度与特异性的实验室筛查方法，满足人们的需要。目前宫颈癌的常用筛查方法有宫颈的细胞学检查、HPV病毒学检测、阴道镜检查等，尤其是液基薄层细胞技术和HPV DNA检测技术的应用提高了宫颈癌检出率，但是仍然缺乏足够的特异性和敏感性。
近年来，在肿瘤的辅助诊断方面，肿瘤标志物(tumor marker，TM)的研究十分活跃。尤其外周血肿瘤标志物的检测具有微创伤、可重复、可于同一时间点进行检测多项指标等优点，是肿瘤诊断和随访的理想手段[5，6]。而目前已发现的宫颈癌肿瘤标志物如鳞状上皮细胞癌抗原(SCC)、癌胚抗原(CEA)、细胞角质素19(CYFRA21-1)、癌抗原125(CA-125)、糖链抗原1929 (CA19-9)等存在敏感性太低和特异性不高。miRNA作为非编码的小分子RNA，在肿瘤细胞代谢、增殖、分化和凋亡等生物学过程中发挥着重要的调节作用。目前通过分析不同肿瘤组织与正常组织microRNA表达谱的差异，已发现一些可作为特定肿瘤分子标志物的microRNA，而且在弥漫性大B细胞淋巴瘤、前列腺癌、卵巢上皮癌等肿瘤患者血清中也存在miRNA明显差异表达[7-9]。又因为miRNA在血清中可长期稳定存在，耐RNA酶降解，煮沸、反复冻融、酸碱环境、长期保存等各种处理方法均不会造成血清miRNA的损失，因此血清中的miRNA有潜力作为一种有价值的肿瘤标志物。
我们通过对宫颈癌患者和对照组人群血清进行Microarray 初筛和RT-qPCR进一步验证，确定了7个miRNA（miR-21、miR-25、miR-205、miR-486-5p、miR-148a、miR-143和miR-372） 在病例组的差异表达，对其中三个上调最明显的miRNA进行ROC 曲线分析，这3个miRNA 的 AUC 分别是0.972、0.949和0.944，通常认为AUC大于0.7，该指标才具有诊断价值。得到这3个 miRNA的最佳临界点分别为35.11fmol/L、59.05fmol/L、7.00fmol/L，其诊断宫颈癌的灵敏度和特异性分别为92%、93.3%，90%、96.7%和90.0%、90.0%。
总之，我们利用芯片杂交方法发现宫颈癌患者血清中存在异常表达的miRNA，并分析了miR-25、miR-205、miR-486-5p在诊断宫颈癌中的价值，经进一步研究，miRNA可能成为新一代宫颈癌的血清标志物。
【参考文献】
[1] Sankaranarayanan R，Ferlay J.Worldwide burden of gynaecological cancer:the size of the problem.Best Pract Res Clin Obsetet Gynaecol，2006，20(2):207-25.
[2] 乔友林，章文华，李凌等.子宫颈癌筛查方法的横断面比较研究[J].中华医学科学院学报，2002，24(1):50-3.
[3]Jackson RJ，Standart N.How do microRNAs regulate gene expression[J].Sci STKE，2007(367):rel.
[4]Stefani G，Slack FJ.Small non-eoding RNAs in animal development[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2008，9(3):219-230.
[5]王维林，白鑫，屠红.肝癌血清标志物研究的新进展[J].肿瘤，2009，29(4):389-393.
[6]DLJFFY MJ.Role of tumor markers in Patients with solid cancers:A critical review[J].Eur J Intern Med，2007，18(3):175-184.
[7]Mitchell PS，Parkin RK，Kroh EM，et al. CirculatingmicroRNAs as stable blood-based markers for cancerdetection.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105: 10513-8.
[8]Lawrie CH，Gal S，Dunlop HM，et al.Detection of elevatedlevels of tumour-associated microRNAs in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma. Br J Haematol，2008，141: 672-5.
[9]Resnick KE，Alder H，Hagan JP，et al.The detection ofdifferentially expressed microRNAs from the serum of ova-rian cancer patients using a novel real-time PCR platform.Gynecol Oncol，2009，112: 55-9.
论文作者:贾伟利,郭光辉,刘雄伟
论文发表刊物:《心理医生》2015年11期供稿
论文发表时间:2016/4/28
标签：宫颈癌论文; 血清论文; 病例论文; 肿瘤论文; 差异论文; 分别为论文; 特异性论文; 《心理医生》2015年11期供稿论文;