姚润贤, 袁哲明[1]2013年在《冰核细菌Erwinia ananas 110冰核基因iceA的原核表达及冰核活性分析》文中研究指明为获得具有高冰核活性的基因工程菌,从冰核细菌Erwinia ananas 110扩增冰核基因iceA,将其克隆到pMD19–T载体上,转化大肠杆菌DH5α,单、双酶切鉴定并测序;阳性克隆目的片段亚克隆到表达载体pET–23a(+)上,转化大肠杆菌DH5α,单、双酶切鉴定重组质粒;阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,并经IPTG诱导表达。SDS–PAGE电泳检测表明,冰核基因iceA能够并以包涵体形式表达,相对分子质量约为180 000。冰核活性测定结果表明,重组菌BL21(DE3)pLysS/pET–ice的冰核活性与野生冰核细菌Erwinia ananas 110在–5、–4、–3、–2℃下无明显差别。
唐朝荣[2]2002年在《冰核细菌Erwinia ananas110冰核基因克隆、序列分析和促冻杀虫基因工程菌构建》文中进行了进一步梳理细菌冰核基因的应用研究已成为生物冰核领域的研究热点 ,涉及细菌细胞表面展示、报告基因、病原微生物高敏检测、作物抗寒育种等多个领域 ,显示良好应用前景。在本研究开展前 ,我国尚未克隆到细菌冰核基因 ,因此无法开展冰核基因的应用研究。冰核细菌的促冻杀虫理论确
孙福在, 赵廷昌, 王佳君, 牟丰盛, 安建勇[3]2005年在《冰核细菌在我国北方玉米上的消长动态规律》文中进行了进一步梳理研究证明,菠萝欧文氏菌(Erwinia ananas)为我国北方玉米上优势冰核细菌种类,占总体INA细菌95 %以上。采用定量定性和定期取样分离方法,首次研究INA细菌在玉米上的消长动态规律。结果表明:玉米不同生长发育阶段是影响INA细菌在玉米上数量分布和消长动态变化的重要因素,以抽雄至成熟期间分布INA细菌数量最多,高达10 7～10 8CFU/ g,比拔节至抽雄期高出2～3个数量级,比苗期至拔节期高出4～5个数量级;同时还指出,玉米不同播期,对INA细菌数量分布影响显着,差异很大,其中INA细菌分布数量消长变化,以正常播种(1.9×10 7CFU / g) >中期播种(7.9×10 5CFU/ g) >晚期播种(5 .0×10 4 CFU/ g) ;研究指出,处于抽雄至成熟期间的玉米上分布的INA细菌数量最多,因此期间(8月上旬至9月下旬) ,气温逐渐降低,昼夜温差大,田间结露多,加上玉米处于成熟阶段,抗INA细菌能力弱,这些因素有利于低温(5～2 0℃范围内生长)型INA细菌生长繁殖,故使INA细菌分布数量最多
唐朝荣, 孙福在, 赵廷昌, 李瑞峰[4]2002年在《冰核细菌Erwinia ananas 110冰核基因克隆和序列分析》文中进行了进一步梳理从作者自行分离的冰核细菌(Erwinia ananas 110)中克隆到我国第1个细菌冰核基因,并完成其序列测定和分析。所克隆基因编码区全长3921bp,编码1306aa,氨基酸序列明显分为3个区即N-端(161aa)、C-端(41aa)的单一序列区和中部的高度重复序列R区(1104aa),以16氨基酸为重复单元的R区占整个编码序列的84.5％。序列分析表明我们所克隆的基因为一个新冰核基因,将其命名为iceA,该基因已在GenBank上登录,登录号为:AF387802。
姚润贤[5]2013年在《含冰核基因重组杆状病毒构建及其应用》文中指出冰核细菌(ice nucleation activity bacteria, INA细菌)可在低温条件下催化过冷却水形成细腻规则冰晶,已在促冻杀虫、病原微生物高敏检测、作物抗寒育种、植物冻害防除、食品冷藏保鲜和冷冻浓缩等多个领域有广泛应用。冰核细菌可显着提高不耐结冰型害虫的过冷却点,增加其冻杀死亡率,但野生冰核细菌、含冰核基因工程菌难以直接防治田间越冬害虫。本文结合昆虫杆状病毒安全性好、对人畜无害；不污染环境、专一性强,对非目标生物很少杀伤；能造成疾病的流行传播,持效性强；害虫不易产生抗药性等优点,从冰核细菌Erwinia ananas110中PCR获得高冰核活性的冰核基因iceA,将其插入苜蓿夜蛾核型多角体病毒(Autographa Califonica mutiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV)多角体基因(polyhedrin,polh)下游构建重组杆状病毒AcMNPV-ice。结果如下：(1)高冰核活性iceA获得：将从冰核细菌Erwinia ananas110扩增的冰核基因iceA插入pET-23a(+),构建重组表达载体pET-23a(+)-ice,在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS经IPTG诱导表达和SDS-PAGE分析及小液滴冻结法冰核活性测定：冰核蛋白分子量约为180KD,并以包涵体形式存在；重组菌BL21/pET-ice冰核活性与野生冰核细菌Erwinia ananas110在温度-5、-4、-3℃冻滴率均为100%,在-2℃下冻滴率均为0%,经IPTG诱导的BL21在温度-5、-4、-3、-2℃下冻滴率均为0%。表明所扩增冰核基因iceA与野生冰核细菌冰核活性无明显差别,且表现为A型冰核活性。(2)重组杆状病毒Bacmid/polh-ice构建与应用：利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统将iceA基因和polh基因插入转移质粒pFASTBacTM Dual,构建重组转移质粒pFASTBacTMual-polh-ice,转化含穿梭载体(Bacmid)和辅助质粒的DH10Bac感受态细胞,经转座得到重组穿梭载体Bacmid/polh-ice;经PCR检测,iceA和polh插入位置正确。Bacmid/polh-ice经转染sf9细胞,收集重组杆状病毒(命名为AcV/polh-ice)上清,对获得的细胞沉淀进行SDS-PAGE电泳检测表明多角体蛋白条带约29KD,与预测分子量相一致；对注射AcV/polh-ice上清的20头甜菜夜蛾3龄幼虫,4天后虫体全部液化死亡,而作对照的20头未作处理甜菜夜蛾可继续继代繁殖。
唐朝荣[6]2001年在《冰核细菌Erwinia ananas 110冰核基因克隆、序列分析和促冻杀虫基因工程菌构建》文中研究表明细菌冰核基因的应用研究已成为生物冰核领域的研究热点，涉及细菌细胞表面展示、报告基因、病原微生物高敏检测、作物抗寒育种等多个领域，显示良好应用前景。在本研究开展前，我国尚未克隆到细菌冰核基因，因此无法开展冰核基因的应用研究。大量研究证明，冰核细菌促冻杀虫理论确凿无疑，但难以应用野生型冰核细菌冻杀田间和仓储越冬害虫，主要原因是这些冰核菌不能在虫体内增生定殖，易被排泄体外，无法起到促冻杀虫作用；再者，冰核细菌能在植物体上定殖，田间施用易诱发和加重植物霜冻，这已成为阻碍促冻杀虫应用的国内外难题。基于此背景，拟本研究目标：克隆细菌冰核基因，利用冰核基因构建促冻杀虫基因工程菌。主要结果如下： 根据已报道冰核基因的同源序列设计引物，通过PCR扩增从我们分离的冰核细菌Erwinia ananas 110中克隆到一个完整细菌冰核基因。克隆基因编码区全长3921nt，编码1306aa，氨基酸序列明显分为3个区即N-端（161aa）、C-端（41aa）的单一序列区和中部的高度重复序列R区（1104aa），以16氨基酸为重复单元的R区占整个编码序列的84.5%。序列比较表明所克隆的基因为新基因，将其命名为iceA，并已在GenBank上的登录，登录号为AF387802。所克隆基因同国外报道的冰核基因inaA的同源性最高，核苷酸和氨基酸的同源性均为94%。构建了所克隆基因的非融合原核表达载体pINA201，成功实现了冰核基因的原核表达，产生187KDa的冰核基因表达产物。 将iceA插到质粒pSZ21的Tn5转座子的SalI和BamHI酶切位点之间，首次成功构建了具广泛宿主接合转移和Tn5转座功能的重组质粒mob-Tn5-iceA。在该重组质粒中，iceA在Tn5转座子的新霉素磷酸转移酶基因启动子控制下实现了冰核基因的组成型活性表达，可通过接合转移将mob-Tn5-iceA导入多种革兰氏阴性菌，并进一步通过Tn5转座将插入在其上的冰核基因iceA整合到宿主菌染色体DNA上，因此该重组质粒的构建将加速冰核基因的应用研究。 首次通过接合转移将mob-Tn5-iceA导入阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae1.181和1.2022两个菌株中，并通过Tn5转座作用进一步将冰核基因iceA整合到宿主菌染色体DNA上，成功构建了冰核活性稳定的促冻杀虫基因工程菌Enc181~(ice)和Enc2022~(ice)。 0二 两株工程菌可显着提高害虫的过冷却点，在害虫肠道能有效定殖、对害虫的低温冻杀效果明显。用工程菌饲菌后7d内，玉米螟和棉铃虫的过冷却点分别从－11℃一 17℃和－10 C左右提高到－3℃一4℃，饲菌后gd，处理虫体的过冷却点有所降低，但仍在－5’C以上。在饲菌后7d内，两种昆虫肠道的工程菌数量高达10‘～105C刊u／虫体，饲菌后gd，虫体肠道内的工程菌数量有所下降，但每虫体的菌体数量仍在10‘cfu以上。将饲菌后6d的玉米螟和棉铃虫在－5’C处理6h，即有90％以上被冻死，而未经工程菌处理的对照虫体则全部存活下来；－7C处理6h，工程菌处理虫体 100％被冻死，而对照玉米螟和棉铃虫中则分别仅有7．4％和14．3％被冻死。 两株工程菌在植物体上的附生定殖能力明显低于野生型冰核细菌，大田应用冻杀害虫时会降低诱发霜冻的风险。盆栽试验显示，工程菌在玉米上的定殖能力明显比野主型冰核细菌低。在喷菌后10d，从玉米叶片上很难再分离到Enc2022‘“”，表明该菌难以在植物上定殖，Enc181‘””虽然在喷菌后20d内在玉米上始终有一定数量定殖，但与野生型冰核细菌Eal 10＋肚b则要低2个数量级以上。此外，两个工程菌间在植物上的定殖能力也存在明显差异，无论在盆栽试验的玉米上或是在小区试验的玉米和棉花上，Enc2022‘’”的定殖能力都明显低于Enclsl‘“”：在植物体上难以定殖，可排除诱发霜冻的风险，因此大田应用Enc2022‘””促冻杀虫更具应用前景。 本项研究结果，为我国冰核基因应用研究创造了新的生长点和奠定了基础，创制出了促冻杀虫新生物农药，为防除我国叁北地区重要越冬农林害虫和仓储害虫指出了一条切实可行的生防新途径。
孙福在, 赵廷昌[7]2003年在《冰核细菌生物学特性及其诱发植物霜冻机理与防霜应用》文中进行了进一步梳理就国内外有关冰核细菌生物学特性及其诱发植物霜冻机理与防霜应用的研究进展作以概述。阐述了冰核细菌种类、分布、影响冰核活性的成冰因素 ,冰核活性等级划分、冰核细菌保存方法以及冰核细菌诱发植物霜冻机理 ;简介了冰核细菌分子生物学研究进展 ;药剂和生防菌能够防除植物上冰核细菌减轻或控制霜冻危害 ,并已取得成效 ,是防御植物霜冻的一条新途径。
赵廷昌, 孙福在, 郑传临, 何松, 胡卓炎[8]2001年在《冰核细菌在食品工业中的应用》文中进行了进一步梳理Pseudomonoas,Erwinia和Xanthomnoas属的种或变种细菌产生细菌冰核，在-2～-5℃有冰核活性，能使水冻结。这一特性使得这些微生物在食品冷冻（冰核为限制步骤）中非常有用。在国外，冰核活性（INA）细菌及其胞外冰核应用于食品冷冻浓缩
刘招舰[9]2002年在《小麦上冰核细菌种类、分布及其与小麦霜冻关系的研究》文中研究指明本文从细菌学的角度来探讨霜冻发生的机理，通过冰核细菌的分离鉴定和生物学特性研究；冰核细菌表达冰蛋白特性的研究以及对冰核细菌与小麦霜冻关系的研究。揭示了小麦霜冻发生的实质，即霜冻是由低温、植物的霜敏感性和冰核细菌的存在叁个因素共同决定的，而冰核细菌在霜冻的发生过程中起了关键作用，本论文的研究结果可简述如下： 1．1999-2001年，从山东省泰安、烟台、日照、济南、聊城、淄博、荷泽等地区小麦上分离到冰核细菌22株，经鉴定为Pseudomonas属和Erwinia属的4种冰核细菌分别为：丁香假单胞菌(Psyringae)；菜豆荚斑假单胞菌(Pveridiflava)；凤梨欧文氏菌(E．ananas)；草生欧文氏菌(E．herbicola)。冰核活性的测定发现不同菌株的冰核活性存在显着差异。INA细菌与小麦霜冻关系的实验是把喷有INA细菌的小麦置于人工霜箱，设0℃、-1℃、-2℃、-3℃、-4℃、-5℃、-6℃、-7℃、-8℃、-9℃共10个温度处理，测定叶片的相对电导率和过冷却点，结果表明，INA细菌能够破坏小麦叶片的细胞膜，使原生质膜透性增大从而明显提高小麦叶片的相对电导率；INA细菌能够使小麦过冷却点4℃左右，在-3～-4℃就发生霜冻。证明INA细菌是诱发和加重小麦霜冻的重要因素。这是我国关于小麦上冰核细菌及霜冻发生机理研究的首次报道。 2．本研究采用9001、14和309叁株INA细菌，探讨了INA细菌的生长规律和不同生长阶段冰蛋白表达的特性；并阐明了不同生长温度对冰核活性的影响。生长阶段冰核蛋白表达的测定，设4h、8h、12h、16h、20h、24h、28h、32h、36h、40h、44h、48h几个处理，稀释相同的浓度测定它们的冰核活性，发现生长初期冰核活性较弱，对数期到稳定期冰核活性最强，以后冰核活性又逐渐减弱。生长温度对冰核活性的测定设10℃、15℃、20℃、25℃、30℃五个温度处理，培养36h后，配制相同浓度的菌悬液测定冰核活性，结果表明：温度对冰核活性有显着影响，20～24℃冰核活性最强，大于25℃冰核活性逐渐减弱。INA细菌冰蛋白的表达受菌龄、温度和培养基等因素的影响。 3．从山东省各地采集了25种植物霜冻害标本，并进行了冰核细菌的分离，共分离到60株冰核活性细菌，鉴定结果为：假单胞菌属有37株，其中非荧光假单胞菌(P.sp)10株，占16.7％；丁香假单胞菌(P.syringae)11株，占18.3％；荧光假单胞菌(Pfiuorescens)2株，占3.3％；菜豆荚斑假单胞菌(P.veridifiava)14株，占23.3％。欧文氏菌属有23株，其中菠萝欧文氏菌(E.ananas)21株，占35％；草生欧文氏菌(E.herbicola)2株，占3.3％，调查发现INA细菌的种类和分布受季节、环境，地域和植物种类等多种因素的影响。冰核活性的测定发现不同冰核细菌的冰核活性存在差异。该研究是我省植物上冰核细菌研究的首次报道。
赵晨心[10]2017年在《冰核细菌分离鉴定及拮抗菌筛选》文中研究说明由霜冻引发的低温冷害对农作物和植物造成很大的影响。国内外专家学者研究表明:冰核细菌的存在是诱发和加重植物霜冻灾害的重要因素,本文研究了贵州省冰核细菌的种类及分布情况,并且采集土壤,从土壤中分离能够防除冰核细菌的拮抗菌,田间防霜试验选取贵州大学基地试验田。主要得到以下实验结果:1、冰核细菌的分离鉴定2014年12月、2015年12月、2016年12月从贵州省贵阳市、遵义市、六盘水市、铜仁市、兴义市5个城市,采集了84种植物霜冻标本,用平板稀释分离法分离到1275株细菌,采用由Vali小液滴冻结法鉴定,获得11株冰核细菌,编号为:B-A、B-B、B-C、B-D、B-E、B-F、B-G、Z-A、Z-B、Z-C、Z-QCH。经形态学鉴定、生理生化反应和16s rDNA序列分析鉴定:菌株Z-A、Z-C、BD为菠萝泛菌(Pantoea ananatis),寄主植物分别是瞿麦(Dianthus superbus)、茶树(Camellia sinensis)和茼蒿(Chrysanthemum coronarium),采集地点分别为遵义市凤凰山和六盘水市水城;B-E和Z-B为成团泛菌(Pantoea agglomerans),寄主植物为柑橘(Citrus reticulata)和鸢尾(Iris tectorum),采集地点分别是贵阳市小车河公园和遵义市植物园;菌株B-B为荧光假单胞(Pseudomonas fluorescens),寄主植物为白菜(B.pekinensis),采集地点为贵阳市高坡乡;菌株B-C和B-F是丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae),寄主为白花苜蓿(Trifolium repens)和白菜(Brassica pekinensis),采集地点分别为贵阳市黔灵公园和贵阳市高坡乡;菌株B-A、B-G、Z-QCH为绿黄假单胞菌(Pseudomonas viridiflava),寄主植物分别是八角金盘(Fatsia japonica)、矮牵牛(Petunia hybrida)和芭蕉(Musa basjoo),采集地点分别为六盘水市盘县水塘镇丹霞山、贵阳市景云山和铜仁市梵净山。2、冰核细菌拮抗菌的分离鉴定与筛选从贵州省贵阳市、遵义市5个地点采集了35份霜冻植物的根部土壤,采用平板稀释法、双层平板打孔法,获得对冰核细菌有拮抗作用的拮抗菌6株。编号为XF、XD、XH、XM、XL、F1。采用形态学鉴定、生理生化反应和分子鉴定3种方法对6株拮抗菌进行鉴定,鉴定出菌株F1为暗产色链霉菌(Streptomyces phaeochromogenes);菌株XF、XD、XH、XM为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),菌株XL为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。本文初步了解了贵州部分植物上冰核细菌的种类及分布特征,对贵州预防植物霜冻打下一定的基础。
参考文献：
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[3]. 冰核细菌在我国北方玉米上的消长动态规律[J]. 孙福在, 赵廷昌, 王佳君, 牟丰盛, 安建勇. 生态学报. 2005
[4]. 冰核细菌Erwinia ananas 110冰核基因克隆和序列分析[J]. 唐朝荣, 孙福在, 赵廷昌, 李瑞峰. 微生物学通报. 2002
[5]. 含冰核基因重组杆状病毒构建及其应用[D]. 姚润贤. 湖南农业大学. 2013
[6]. 冰核细菌Erwinia ananas 110冰核基因克隆、序列分析和促冻杀虫基因工程菌构建[D]. 唐朝荣. 中国农业科学院. 2001
[7]. 冰核细菌生物学特性及其诱发植物霜冻机理与防霜应用[J]. 孙福在, 赵廷昌. 生态学报. 2003
[8]. 冰核细菌在食品工业中的应用[J]. 赵廷昌, 孙福在, 郑传临, 何松, 胡卓炎. 食品科学. 2001
[9]. 小麦上冰核细菌种类、分布及其与小麦霜冻关系的研究[D]. 刘招舰. 山东农业大学. 2002
[10]. 冰核细菌分离鉴定及拮抗菌筛选[D]. 赵晨心. 贵州大学. 2017