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【摘 要】目的 探讨不同剂量5-HT（血清素）对雌性小鼠骨皮质和骨小梁参数的影响。方法 给予2月龄野生雌性C57BL/6小鼠皮下注射不同剂量（0，20，40，60，80，100mg/kg）的血清素，三个月后通过μCT定量分析各组小鼠第五腰椎体、股骨远端干骺端和股骨中段的相关骨参数。结果 血清素在体内可以降低小鼠骨小梁的数量，增大骨小梁分离度，降低骨小梁体积分数和面积分数，进而减少骨小梁骨矿密度和骨矿含量，也可以减少皮质骨厚度和体积分数，降低皮质骨骨矿含量。结论 血清素对骨代谢具有重要的负性调节作用，可能有助于骨质疏松症等骨丢失性疾病的预防和治疗。
【关键词】血清素；小鼠；骨皮质；骨小梁；μCT
【Abstract】Objective To investigate the effects of serotonin of different doses on cortical and trabecular bone parameters of female mice.Methods 2-month-old wild-type（wt）C57BL/6 female mice was injected with serotonin of different doses（0，20，40，60，80，100mg/kg）subcutaneously（s.c.）daily for 3 months，following which micro-CT（μCT）was used to quantitatively analyze bone parameters of the fifth lumbar bodies，distal femurs and midshafts of the femurs of each group of mice.Results Serotonin could in vivo reduce trabecular numbers（Tb.N），trabecular bone volume and surface density（Tb.BV/TV，BS/TV），increase trabecular separation（Tb.Sp），leading to a decrease of trabecular bone mineral density（Tb.BMD）and bone mineral capacity（Tb.BMC）.Besides，serotonin could caused decreased cortical bone mineral capacity（Ct.BMC）secondary to reduced cortical thickness（Ct.Th）and cortical bone volume density（Ct.BMD）in mice.Conclusion Serotonin has a significantly negative regulation on bone metabolism，which may contributes to the prevention and treatment of osteoporosis and bone loss associated diseases.
【Key words】 Serotonin；Mice；Cortical bone；Trabecular bone；μCT
骨重构是一个精确调节的生理过程，需要骨形成和骨吸收的紧密耦合，以维持正常骨量。如果骨形成和骨吸收之间的平衡被打破，就会导致一些病理状态，如骨质疏松，骨质软化等。骨量以及骨细胞的功能可以被很多因素调节，包括维生素D3、雌激素、甲状旁腺激素等激素，以及很多局部生成的生长因子和细胞因子[1-4]。
近年来，人们发现一种全身广泛存在的神经递质血清素（也称5-羟色胺，5-HT）与骨代谢有关。临床观察提示，血清素水平可能与骨量有关。选择性血清素重吸收抑制剂（SSRIs）目前常规用来治疗成人[5]以及儿童和青少年[6-8]的抑郁症。作为抗抑郁药，SSRIs能够阻止血清素转运体（5-HTT）从突触间隙回收血清素，从而提高细胞外血清素水平。报道显示，服用氟西汀的患者好像具有更高的骨折风险[9-16]。类似地，Kastelic等发现血液血清素水平与股骨颈的总骨密度以及骨小梁骨密度成负相关[8]。功能性血清素能通路在骨组织的发现[17-19]，提示血清素有可能会影响骨骼生理。这些发现意味着血清素和骨重构之间存在着重要联系。
很多研究者报道了血清素在骨组织中的作用，但是结果并不一致。Yadav等发现，血清素通过作用于成骨细胞上的5-HT1B受体抑制其增殖能力[20]，进而抑制骨形成。而其他研究人员发现血清素具有与之不同甚至完全相反的作用[18，19，21-26]。这种相互矛盾的原因还不清楚。本研究的目的就是探讨不同浓度血清素对小鼠骨代谢的生理作用。为了研究血清素在体内对骨量和骨微结构的作用，我们给36只2月龄的野生雌性小鼠皮下注射不同剂量的血清素，三个月后收集每个小鼠的第五腰椎（L5）和右侧股骨，进行μCT扫描分析。结果显示，血清素在体内骨骼生理的调节中具有重要作用。
材料与方法
1.实验动物：选取2月龄雌性C57BL/6小鼠36只（由南京医科大学实验动物中心提供，）分笼饲养于标准的动物实验室，相对湿度55±5%，温度24±2%，12h白昼循环，自由饮水及进食（啮齿动物饲料，南京医科大学实验动物中心提供）。动物购回适应性喂养1周后开始实验。本实验所有步骤均采用南京医科大学实验动物伦理委员会批准的实验程序，并且符合美国国立卫生研究所实验动物看护使用指南。
2.实验分组与给药：小鼠随机分为6组（n=6/组）：生理盐水组（正常对照组，control组）；5 mg/kg组；10 mg/kg组；20 mg/kg组；50 mg/kg组；100 mg/kg组。每组根据体重进行皮下注射相应剂量的血清素，每日一次，持续3个月。
3.μCT扫描与分析：给药3个月后，所有小鼠麻醉后处死。收集每只小鼠的腰椎和右下肢进行皮质骨和骨小梁参数分析。参考前人方法[27，28]，采用日立实验室CT扫描系统（LCT-200，日立，日本）检测骨量和骨微结构。每只小鼠分别扫描L5，股骨远端干骺端和股骨中段三个部位。L5和股骨远端用来分析骨小梁参数，包括骨小梁体积密度（Tb.BV/TV），骨表面密度（BS/TV），骨小梁骨矿密度（Tb.BMD），骨小梁骨矿含量（Tb.BMC），骨小梁数量（Tb.N），骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁分离度（Tb.Sp）[29，30]。皮质骨参数（即股骨中段）包括骨体积密度（Ct.BV/TV），皮质骨骨矿密度（Ct.BMD），皮质骨骨矿含量（Ct.BMC），皮质骨厚度（Ct.Th）等。数据分析采用LaTheta软件（日立），三维重建图像采用3D图像分析软件（TRI/3D-BONE，日本）。
4.统计分析：数据以统计软件SPSS 13.0（SPSS公司，美国）进行统计分析，各组参数以均值±标准误表示。组间差异显著性采用ANOVA和Dunnett post hoc进行分析，p＜0.05表示差异具有统计学意义。（表中*p＜0.05，** p＜0.01）
结果
1.血清素对骨小梁参数的影响：为了研究血清素对小鼠骨小梁结构的影响，我们收集每只小鼠的第五腰椎体（L5）和右侧股骨远端干骺端进行μCT扫描分析，结果见表1。结果显示，与对照组相比，5 mg/kg组的各项骨小梁参数的差异并无统计学意义（p＞0.05）。但是从10 mg/kg起，各实验组数据与对照组差异较为明显。具体为，10 mg/kg组的BV/TV、Tb.BMC比对照组显著降低，而Tb.Sp显著升高（p＜0.05）。而20-100 mg/kg各组骨小梁参数除Tb.Th外，基本都明显低于对照组。而且同一参数的各组数据显示，血清素对骨小梁的影响具有剂量依赖性（表1）。
2.血清素对骨皮质参数的影响：与骨小梁相比，血清素对骨皮质参数的影响较小。如表1所示，5-20 mg/kg组的小鼠骨皮质参数相比对照组并没有明显变化，50和100 mg/kg组相比对照组具有明显降低的BV/TV、Ct.BMC和Ct.Th（p＜0.05）。各组Ct.BMD虽然随着血清素剂量的增加有逐渐减少的趋势，但差别均无统计学意义（p＞0.05）。
3三维重建结果：为了更加直观形象的展示血清素对小鼠骨小梁和骨皮质结构的影响，我们分别选择具有代表性的对照组和实验组小鼠各一只，通过图像处理软件对它们的扫描结果进行三维重建，重建图像见图1~6。如图所示，相比对照组，血清素组的L5和股骨远端的骨小梁数目明显减少，骨小梁间距明显增加，因此小梁骨的面积分数和体积分数相应减少，导致骨矿密度和骨矿含量降低。类似的，血清素也明显降低了股骨中段骨皮质的厚度，继而降低了皮质骨体积分数和皮质骨矿含量。三维重建结果和μCT分析结果一致。
讨论
为了探讨血清素与骨重构的关系，我们给予雌性小鼠皮下注射不同剂量的血清素，然后通过影像学分析小鼠骨小梁和骨皮质参数的变化。我们的研究显示，皮下注射血清素可以明显减少雌性小鼠的骨量，改变小梁骨和皮质骨微结构。为了比较不同大小的样本，我们采用标准化了的BV/TV和BS/TV。血清素导致的骨小梁骨体积分数和骨面积分数降低，意味着细胞活性降低。这种降低以及骨小梁骨矿密度和骨矿含量的降低，可能是骨小梁数量减少和骨小梁分离度增加的缘故。而各处理组中骨小梁厚度并没有明显改变，说明血清素对单个骨小梁影响不大。这些结果共同表明，血清素具有抗骨合成或者促骨吸收的作用，从而引起骨小梁形成减少。同样，血清素可以降低皮质骨的骨矿含量，而这主要源于皮质骨厚度和骨体积分数的减少。总之，血清素可以在体内降低骨量，改变骨微结构。而这种影响在小梁骨更为显著。血清素调节骨量的精确机制还需要更多更深入的研究来探索。
我们的结果与以往的一些研究相一致。Warden等发现，5-HTT敲除的突变小鼠具有骨量降低、骨微结构改变、机械强度减弱的表型，而SSRI干预（可以提高细胞外血清素水平）的生长期小鼠的骨骼矿化能力受损[31]。肠道Tph1（编码外周血清素合成的限速酶）敲除的小鼠表现为继发于成骨细胞数量和骨形成率增加的明显高骨量表型[20]。此外，研究发现血液血清素水平与血液雌激素水平负相关[32，33]。而我们已知雌激素对于骨骼系统的维持是必不可少的。有意思的是，Gustafsson等报道长期应用血清素可以引起骨矿密度和皮质骨厚度升高，影响骨微结构。可是他们的实验动物是SD大鼠，而我们的是C57BL/6小鼠；我们的干预剂量也远高于他们（5-100mg/kg和5mg/kg）；他们用的是生长期的大鼠，我们用的是成年的小鼠；此外还可能存在遗传背景的差异。这些因素可能在一定程度上解释结果的矛盾之处。这些研究表明，虽然背后的确切机制尚未阐明，但是血清素的确与骨代谢和骨发育有着密切的联系。
骨质疏松症是一种以骨量减少、骨强度降低、骨折风险增加为特征的骨骼系统疾病[33]。作为世界上最常见的退化性疾病之一，预防和治疗骨质疏松症已经成为重要的公共健康议题。骨量降低和骨折风险增加是增强的骨吸收没有被相应增加的骨吸收补偿所致[32]。因此，针对骨质疏松症的治疗策略主要有两个方面：减缓骨丢失速度和增加骨形成速率。临床观察发现，血液血清素对骨形成具有重要调节作用。比如，外周血清素水平升高的自闭症儿童其骨皮质厚度明显降低[34，35]。一份包含275位女性的人群调查发现，校正年龄和体重后，股骨颈总BMD和骨小梁BMD，以及桡骨骨小梁厚度都与高浓度的血液血清素水平有关[36]。
本实验的结果以及前人研究的成果支持血液血清素是骨形成的负性调节物这一观点。因此，通过药物直接特意地降低外周血清素的合成或者浓度可能是一种新的治疗策略，有可能用于治疗骨质疏松症。事实上，类似的化合物LP533401已经产生，它能够抑制Tph1的活性进而抑制外周血清素的生成，而不影响中枢血清素的水平[37]。然而从临床观点来看，很多问题还有待解决。例如，还需阐明外周血清素对人体骨量的调节是否和小鼠骨量相同或类似。由于血清素受体在体内的广泛分布，循环血清素水平的变化是否会对其他部位如胃肠道、肺循环和心脏产生副作用等等。
当然，由于我们的研究还很初步，现在预测调节血清素是否具有临床应用价值还为时尚早。目前还没有相关文献报道调节血清素水平或者活性可以用来治疗骨丢失性疾病，可是我们的研究结果提示继续探索血清素在骨重构过程中的作用会是一个有价值的方向。为此，还需要更多更深入的研究和探索。
综上所述，我们研究了不同剂量血清素在雌性小鼠体内对于骨量和骨微结构的影响。我们发现，血清素在体内可以降低骨小梁的数量，增大骨小梁分离度，降低骨小梁体积分数和面积分数，进而减少骨小梁骨矿密度和骨矿含量，也可以减少皮质骨厚度和体积分数，降低皮质骨骨矿含量。血清素对于骨骼参数的这种影响，表明血清素对骨代谢具有重要的负性调节作用，可能有助于骨质疏松症等骨丢失性疾病的预防和治疗。
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论文作者:代守前
论文发表刊物:《中国医学人文》(学术版)2016年6月第15期
论文发表时间:2016/11/23
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