孙莉静[1]2002年在《金雀异黄素对高糖培养的大鼠系膜细胞生长及细胞外基质作用的实验研究》文中研究指明背景：系膜细胞（MC）的增殖、肥大及细胞外基质（ECM）分泌过多是糖尿病肾病（DN）发展的重要环节，转化生长因子β（TGF-β）在DN基质形成中起了重要作用。采取相应措施抑制TGF-β表达，减少基质的生成，有助于延缓病变的发生发展。多年来，人们一直进行着关于DN最佳治疗方案的探索。近年在DN大鼠模型的研究中发现：大豆蛋白替代动物蛋白能减轻DN动物肾脏高滤过和蛋白尿的程度。进一步研究发现大豆蛋白的这些有益作用可能与其中所含的多酚类混合物（大豆异黄酮）有关。金雀异黄素是大豆异黄酮的主要活性成分，有多种生理功能，如调节雌激素受体、抗氧化作用、抑制酪氨酸蛋白激酶（PTK）活性等。研究认为金雀异黄素对细胞生长的影响可能与其本身浓度和雌激素受体相关。又有文献报道金雀异黄素可抑制肾小球MC Ⅳ型胶原的合成，减少ECM的聚积，可延缓肾小球疾病的进展。非肾研究显示金雀异黄素可抑制TGF-β的活性。目前关于金雀异黄素对DN影响的研究鲜有报道，但许多间接证据提示它对DN可能具有良好的治疗作用。目的：为了研究金雀异黄素对高糖培养下大鼠MC生长及ECM分泌的影响，我们通过观察不同浓度的金雀异黄素对高糖培养下大鼠MC增殖、凋亡的影响，初步探讨其影响细胞生长的可能机制，如高糖环境下NF-κB活性变化及金雀异黄素作用后活性的改变，以及细胞上雌激素受体的分布；同时了解金雀异黄素对ECM合成、TGF-β分泌及TGF-βmRNA表达的影响。为明确金雀异黄素在肾脏疾病治疗中的地位及意义提供实验依据。方法：本实验主要通过体外培养的大鼠MC进行研究。设立低糖对照组（葡萄糖浓度100mg/dl，不加金雀异黄素）和高糖实验组（葡萄糖浓度450mg/dl＋0、1、5、10、30、50μmol·L-1金雀异黄素），分别培养12、24、36、48小时。MTT法检测不同金雀异黄素浓度作用下大鼠MC的OD值，描绘生长曲线。DNA琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪、HE染色和TUNEL末端标记法四种方法检测细<WP=8>胞凋亡情况，并用流式细胞仪检测细胞的凋亡指数（AI）。ELISA法检测细胞培养液上清Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白、TGF-β的分泌情况，RT-PCR法检测金雀异黄素对TGF-βmRNA表达的影响，明确量效关系。绿色荧光蛋白真核表达质粒瞬时转染大鼠MC，按最佳转染条件将NF-κB报告基因瞬时转染大鼠MC，荧光素酶检测仪检测低糖和高糖环境下NF-κB的活性，及加入不同浓度金雀异黄素后NF-κB的活性变化，免疫组化法检测大鼠MC上雌激素α、β受体的分布。 结果： MTT实验结果显示：实验48小时内，高糖（0μmol·L-1）可刺激MC的增殖（与对照组相比p<0.05），低浓度金雀异黄素（1μmol·L-1）抑制细胞生长作用不显着，5μmol·L-1组细胞生长受到较轻的抑制作用，高浓度金雀异黄素（>5μmol·L-1）可明显抑制细胞生长，且同一浓度随着作用时间的延长，抑制率升高。DNA琼脂糖凝胶电泳显示：作用24小时，对照组、0μmol·L-1组、1μmol·L-1组表现为基因组DNA，5μmol·L-1组出现模糊不清的条带，提示已有凋亡的存在，高浓度组（10μmol·L-1、30μmol·L-1、50μmol·L-1）呈现明显的梯形条带。流式细胞仪证实高浓度金雀异黄素能促进细胞的凋亡，且存在时间依赖和剂量依赖效应，凋亡图象出现亚二倍体峰。HE染色显示10μmol·L-1作用大鼠系膜细胞12小时，大部分细胞形态正常，但细胞贴壁功能稍有下降；作用24小时，部分细胞脱落，变小变圆，少量细胞胞浆空泡形成、染色体浓缩；作用36小时，部分细胞染色体浓缩，胞核固缩；作用48小时，大部分细胞核膜破裂，核固缩，胞浆空泡化。TUNEL末端标记法显示金雀异黄素作用24小时，对照组、0μmol·L-1组、1μmol·L-1组基本无棕染棕黄色颗粒出现，5μmol·L-1组少量出现，而高浓度组则出现较多的棕染棕黄色颗粒。ELISA法显示高糖能促进细胞合成Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白及分泌TGF-β，具有时间依赖和剂量依赖效应。10μmol·L-1组、30μmol·L-1组、50μmol·L-1组能明显抑制ECM的合成与TGF-β的分泌。RT-PCR法显示高浓度金雀异黄素可抑制TGF-βmRNA的表达。绿色荧光蛋白0.2μg与脂质体1.8μg结合时转染效率最高，按此条件将NF-κB报告基因瞬时转染大鼠系膜细胞，经荧光素酶检测仪检测发现在高糖条件下NF-κB活性较低糖增高，加入金雀异黄素后NF-κB活性受<WP=9>到抑制，且金雀异黄素浓度越高，抑制作用越强。免疫组化方法提示大鼠MC上以雌激素β受体分布为主，几乎没有α受体的表达。 结论：在体外高糖条件下，大鼠MC在48小时内以增殖为主。一定浓度的金雀异黄素（>5μmol·L-1）可促进大鼠MC的凋亡、抑制其增殖，并减少ECM的合成。金雀异黄素可在蛋白和基因水平抑制TGF-β的分泌，具有时间依赖、剂量依赖效应。在高糖作用下，NF-κB活性增高，金雀异黄素可抑制高糖引起的NF-κB的活性增高；大鼠MC上雌激素受体分布以β受体为主，我们初步认为金雀异黄素对细胞生长的影响可能与抑制NF-κB的活性有关，与雌激素受体的关系尚难明确。
刘楠梅[2]2004年在《金雀异黄素对系膜细胞表型转换和细胞外基质作用的实验研究》文中研究表明背景：系膜细胞(MC)的肥大表型转换、细胞外基质(ECM)分泌增加、降解减少是糖尿病肾病(DN)发生发展的重要环节。糖尿病(DM)的饮食治疗一直广为重视，多年来人们也一直进行着关于DN最佳饮食治疗方案的探索。近年在DN大鼠模型的研究中发现：大豆蛋白替代动物蛋白可减轻DN动物肾脏高滤过和蛋白尿的程度。进一步研究发现大豆蛋白的这一有益作用与其中所含的多酚类混合物(大豆异黄酮)有关。金雀异黄素(genistein)是大豆异黄酮的主要生理活性成分，它可通过抑制酪氨酸蛋白激酶(PTK)、核糖体S6激酶等多种酶的活性发挥生理作用，它还可通过作用于雌激素受体发挥雌激素样作用和拮抗雌激素作用，此外尚具有抗氧化作用。有文献报道DN的MC表型转换标志物非肌肉型肌球蛋白重链(SMemb)的表达与PTK活性密切相关。又有文献报道金雀异黄素可以抑制肾小球MC纤连蛋白(Fn)的合成，减少ECM的积聚。非肾研究显示金雀异黄素可以调节基质金属蛋白酶降解系统的平衡，有助于ECM的降解。目前关于金雀异黄素对DN影响的研究鲜有报道，但许多间接证据提示它对DN可能具有良好的治疗作用。 目的：为了研究金雀异黄素对DN环境下大鼠MC肥大表型转换标志物SMemb和ECM分泌及降解的影响，我们拟在细胞水平以不同浓度的金雀异黄素作用于高糖培养下大鼠MC，在动物水平以同一浓度的金雀异黄素作用于DM大鼠不同时间，观察细胞表型转换标志物SMemb、ECM主要成分Fn、ECM降解酶系统基质金属蛋白酶—2(MMP-2)／基质金属蛋白酶抑制剂—1(TIMP-1)表达的变化，同时观察金雀异黄素对DM大鼠肾脏病理及影响肾脏病进展的糖脂代谢紊乱的影响，并进一步探讨金雀异黄素发挥作用的可能机制；为明确金雀异黄素在DN治疗中的地位及意义提供实验依据。 方法：本课题分为体外实验和体内实验。体外实验设立低糖对照组(6％小牛血清的低糖DMEM，不加金雀异黄素)、高糖组(6％小牛血清的高糖DMEM，不加第_军医人学2001级硕卜毕业论文中文摘要金雀异黄素)和高搪+不同浓度金雀异黄素组(分别5、10、50、100、200umol/1)，培养12、24、48小时。半定量RT一PCR法检测金雀异黄素对SMemb mRNA、MMP一2mRNA、TIMP一1 mRNA表达的影响，ELISA法检测细胞培养液上清Fn分泌情况，明确量效关系，流式细胞仪进一步检测MC内PTK活性的变化，并确认其与上述物质表达量的相关关系。体内实验建立实验性DM大鼠模型，将大鼠分为正常对照组、DM组、DM+GEN灌胃组，分别于4周、8周末处死大鼠，留取血、尿标本及肾组织。常规生化法检测大鼠肾功能、血脂、血糖，ELISA法测定尿白蛋白浓度，计算尿白蛋白排泄率，放免法检测胰岛素水平，HE染色进行肾脏病理分析，采用RT一PCR法测定肾组织内SMemb mRNA、MMP一2 mRNA、TIMP一1 mRNA的表达水平，ELISA法检测肾组织匀浆中Fn分泌量，免疫组化法观察肾组织内MMP一2、T工MP--l表达强度。 结果: 1.体外实验: RT~PCR实验结果显示，含6%血清的高糖DMEM组大鼠MC可表达SMemb mRNA，金雀异黄素可浓度、时间依赖性的下调其表达。ELISA法检测Fn的含量表明，高糖组与低糖组相比Fn的分泌显着增加，具有时间依赖性关系，金雀异黄素可浓度依赖性地抑制高搪刺激下MCFn的分泌。RT一PCR检测结果显示，与低糖组相比，高糖可抑制MMP一2 mRNA表达，促进TIMP一1 mRNA表达;加入金雀异黄素后可逆转高糖对MMP一2 mRNA表达的抑制作用，仅具有浓度依赖效应;但它可以浓度、时间依赖性地抑制TIMP一1 mRNA的表达;进一步比较金雀异黄素对MMP一2mRNA/T工MP一1 mRNA比值的影响，发现高糖可下调MMP一2 mRNA/TIMP一1 mRNA的水平，金雀异黄素可浓度时间依赖性地上调其比值。流式细胞仪检测MC内PTK活性结果显示低糖组PTK相对表达量较低，高糖组明显增加，具有时间依赖性，金雀异黄素可减少MC内PTK的相对表达量，低浓度(5、10umol/1)时PTK的相对表达量下降较弱，随浓度增高作用逐渐增强。进一步比较PTK活性与SMemb mRNA、枷P一2 mRNA/T工MP一1 mRNA水平以及细胞上清液中Fn分泌量之间的相关性表明:PTK活性与SMemb、Fn分泌量之间具有正相关关系，但与咖P一2 mRNA/TIMP一1 mRNA之间不具有负相关关系。 2.体内实验:第_军医人学2001级硕卜毕业论文中文摘要 SD大鼠血糖检测结果提示，通过STZ腹腔注射成功建立DM大鼠模型，DM大鼠的血糖明显高于正常对照组，而胰岛素敏感指数则显着降低，给予金雀异黄素则可改善高血糖状态，增加胰岛素敏感性。各组大鼠肾功能及尿白蛋白排泄率的检测结果提示DM组大鼠的尿素氮、肌醉、尿白蛋白排泄率显着高于正常对照组，外源性给予金雀异黄素可以保护肾功能，减少尿白蛋白排泄率。随时间延长，DM组大鼠血脂有所升高，加入金雀异黄素后在实验周期内可以显着降低血清胆固醇水平。病理观察发现，随时间延长DM组大鼠肾小球体积增大伴硬化、部分坏死、球囊粘连，肾小管空泡变性，肾小动脉壁增厚伴玻璃样变;外源性金雀异黄素可减轻肾小球肥大，肾小管及小动脉损伤。RT一PCR检测发现，金雀异黄素灌胃可以减少DM大鼠肾小球局部SMemb的表达。金雀异黄素尚可从蛋白水平
朱松柏[3]2006年在《金雀异黄素对转化生长因子β1诱导大鼠肾系膜细胞结缔组织生长因子表达的影响》文中进行了进一步梳理目的了解金雀异黄素(genistein,Gen)对转化生长因子(transforming growth factor ,TGF)β1诱导大鼠肾系膜细胞(mesangial cells ,MCs)结缔组织生长因子(connective tissue growth factor ,CTGF)表达的影响。进一步探讨金雀异黄素抑制肾纤维化的机制。方法将体外培养的MCs分为4组:①正常对照组,未加任何刺激因素;②Gen组, Gen的终浓度分别为50、100μmol/L;③TGF-β1组,终浓度为5ng/ml;④TGF-β1+Gen组,TGF-β1和Gen的终浓度分别同前。刺激MCs24h后,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞内CTGFmRNA的水平,Western blot法测定细胞内CTGF蛋白的表达。结果与对照组比较,Gen组CTGFmRNA的水平和蛋白的表达无显着性差异(P>0.05),而TGF-β1组CTGFmRNA的水平和蛋白的表达明显增加(P<0.01);与TGF-β1组比较,50μmol/L和100μmol/L的Gen能明显抑制TGF-β1诱导的CTGFmRNA的水平和蛋白表达,以100μmol/LGen效果最显着(P<0.01)。结论TGF-β1可诱导体外培养的肾系膜细胞细胞CTGF的基因和蛋白高表达;而Gen能部分抑制TGF-β1诱导CTGF的基因和蛋白的表达,提示金雀异黄素可能通过阻抑CTGF表达减少细胞外基质的积聚,具有潜在的抗肾纤维化作用。
参考文献：
[1]. 金雀异黄素对高糖培养的大鼠系膜细胞生长及细胞外基质作用的实验研究[D]. 孙莉静. 第二军医大学. 2002
[2]. 金雀异黄素对系膜细胞表型转换和细胞外基质作用的实验研究[D]. 刘楠梅. 第二军医大学. 2004
[3]. 金雀异黄素对转化生长因子β1诱导大鼠肾系膜细胞结缔组织生长因子表达的影响[D]. 朱松柏. 华中科技大学. 2006