李涛[1]2003年在《草原兔尾鼠卵透明带3（ZP_3）DNA疫苗免疫不育的研究》文中研究说明草原兔尾鼠是一种只分布在新疆北部地区荒漠草地的重要害鼠之一，它种群密度高，终年活动，在食物缺乏的季节，啃食植被的根皮，严重影响了新疆农牧业的可持续发展。因此，如何有效地控制草原兔尾鼠的种群数量已成为新疆畜牧业发展的一个重要因素。然而，传统的机械捕杀和化学毒杀等方法，都没有从根本上解决这个问题。随着生殖免疫技术的发展，科学家们发现哺乳动物免疫系统和生殖系统之间存在着密切而又复杂的联系，通过免疫不育技术就可以达到抗生育的目的。使鼠类等有害动物的种群控制进入了一个新的时期。动物种群的免疫不育控制实质上是阻断和破坏动物的正常生殖过程，使其丧失生殖能力。免疫不育技术除能使动物个体不能或降低生殖外，还能使动物继续占有配偶，巢域，消耗资源，保持社群紧张，抑制种群生长，能够起到长期压低种群数量，抑制其超补偿性增殖的作用。在免疫不育技术的运用中，靶抗原的选择是非常关键的。研究者发现所有哺乳动物的卵子外均被卵透明带(ZP)所包被，鼠的卵透明带是由ZP_1、ZP_2和ZP_3这叁种主要的糖蛋白组成。其中ZP_3蛋白是生殖过程中介导精卵结合的关键因子。而抗ZP_3抗体可以阻断精卵的相互作用，因此ZP_3可被用作免疫不育控制有害动物种群数量研究的重要靶抗原。本研究以本实验室克隆的新疆草原兔尾鼠的ZP_3基因为靶抗原构建了重组真核表达质粒DNA疫苗，探讨了用此DNA疫苗免疫草原兔尾鼠，激发草原兔尾鼠体内免疫应答和产生不育的可能性。研究工作主要包括IZP_3表达载体的构建、融合蛋白的表达及免疫不育的初步实验等。 为了免疫草原兔尾鼠制备抗血清，首先构建了真核表达重组质粒pCMV4-1ZP3。方法是：经DNAMAN等生物分析软件分析了连接在测序载体上的1ZP3全长序列和真核表达载体pCMV4的酶切位点后，用KpnI和HindIII双酶切PMD18-T-1ZP3和真核表达载体pCMV_4，回收酶切目的片段，混合连接并鉴定新疆大学生命科学与技术学院硕士学位论文正确后，将此重组质粒pCMV4叫 导入体外培养的Hela细胞中，RT干CR法检测到pCMV4－IZP3质粒DNA在Hela细胞瞬时表达系统中能够特异性地表达IZPa蛋白。这说明构建的pCMV4－IZP3质粒DNA能够进一步地作为DNA疫苗，进行草原兔尾鼠免疫不育的实验。大量制备重组质粒PCMV4－IZP3。将雌性草原兔尾鼠随机分为两组，经盐酸普鲁卡因处理24小时后分别在一侧后肢股四头肌肌肉处注射构建的真核表达重组质粒pCMV4－IZP3及对照质粒pCMV4。注射的DNA量为每次每只草原兔尾鼠50Ug／50UL。分别于1、3、5周免疫H次，每次免疫前一天，于草原兔尾鼠眼后底眶取血，收集抗血清。 为了进一步检测抗血清，根据己测序的连接在pMD＊载体上的IZP3核心片断（IZP3Cf）和原核表达载体GST4TI的多克隆位点序列，分析读码框，确定共用酶切位点 EcoRI和 Sail，将它们双酶切后，混合连接。经双酶切和快速 PCR法鉴定重组质粒GST－IZP3Cf构建正确后，将该质粒转化进入表达菌株大肠杆菌BL21中，经IPTG诱导后，裂解细胞，用沁S－PAGE鉴定裂解物，检测融合蛋白的表达，纯化融合蛋白，用ELISA法检测制备的IZP3抗血清。结果显示经叁次免疫后，实验组草原兔尾鼠产生了明显的抗IZP3抗体。 免疫六周后，将经pCMV4－IZP3真核表达重组质粒免疫的实验组雌性草原兔尾鼠和对照组雌性草原兔尾鼠分别与未免疫的雄性草原兔尾鼠合笼以检测pCMV4－IZP3质粒DNA疫苗免疫后草原兔尾鼠生育情况。抗生育实验结果表明，接受DNA疫苗的9只雌鼠，有2只在实验中没有生育，而其它7只能生育的草原兔尾鼠产下了正常大小的仔鼠和未成形的胚胎，免疫组平均每只产2．9只正常幼鼠。与此相比较，接受对照质粒pCMV4免疫的草原兔尾鼠全部可生育，且平均每只产5．4只幼鼠。免疫组和对照组之间存在着显着差异（P＜0．05）。研究结果表明IZP3抗体水平的高低与草原兔尾鼠能否产生不育效果有着直接的联系，IZP3可做为控制草原兔尾鼠种群数量的 DNA不育疫苗。为了说明免疫后不育的直接原因，取免疫组和对照组雌性草原兔尾鼠的卵巢，制备石蜡切片进行显微观察。结果表明经重组质粒 PCMV4－IZP3，DNA疫苗免疫后，实验组卵巢结构 第6贞共86页 新疆大学生命科学与技术学院硕士学位论文发生变化，直接影响了生殖能力。 本研究结果表明，利用基因免疫不育技术，以草原兔尾鼠ZP3基因为靶抗原，能在草原兔尾鼠这一物种中降低繁殖率，为进一步利用dP3作为靶抗原制备免疫不育疫苗控制草原兔尾鼠种群数量，保护草原植被，促进新疆的经济发展奠定了科学理论基础。
张爱莲[2]2004年在《免疫不育疫苗控制草原兔尾鼠生育的研究》文中认为免疫不育疫苗控制草原兔尾鼠生育的研究 草原兔尾鼠(Lagurus lagurus) 属啮齿目仓鼠科田鼠亚科兔尾鼠属的鼠类,分布面积广阔,繁殖力强, 种群密度高, 终年活动,对草场植被的发育和更新带来严重的危害,是新疆畜牧业发展的重要危害鼠种,严重制约着新疆畜牧业的发展。目前鼠害控制多用传统的机械捕杀、化学毒杀等方法, 这些方法存在专一性差、灭效短、种群恢复快等缺点, 而且化学毒杀方法对环境的危害较大。随着公众对环保和动物权益等方面意识的增强,许多国家开始转变鼠害防治的策略, 把免疫不育控制鼠害当作一项重要的研究内容。免疫不育技术在控制野生动物种群数量方面显示出了诱人的前景,并且已经成为一种当前国际上最有潜力的种群控制技术。哺乳动物的透明带(zona pellucida,ZP)是由卵母细胞合成和分泌的,由ZP1、ZP2、ZP3 叁种硫酸化的糖蛋白组成, 是受精过程中精子必须穿过的障碍。其中ZP3 在受精过程中有两个重要作用: 一是与精子专一性地结合;二是在与精子结合以后诱导精子的顶体反应。大量实验证明, 阻断精子与ZP3 的结合就可以阻断小鼠、猪等哺乳动物的生殖过程, 因此, ZP3 是利用免疫不育技术控制有害动物种群数量的理想靶抗原。本研究主要利用实验室已经克隆到的草原兔尾鼠卵透明带3基因(LZP3)开展草原兔尾鼠的抗生育研究。研究内容主要包括:草原兔尾鼠卵透明带3基因的原核表达、抗血清的制备以及DNA疫苗免疫小鼠和草原兔尾鼠的免疫学检测和抗生育实验。首先,利用原核系统简单、快速、方便等特点,选择在GST系统中表达LZP3融合蛋白。为了提高LZP3的表达量,将LZP3除去N 端信号肽和C 端跨膜区的核心片段构建到原核表达载体pGEX-4T-1中,经序列分析和酶切鉴定表明已经正确构建了pGEX-4T-LZP3。将构建正确的pGEX-4T-LZP3原核表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE鉴定,发现在63kDa处有融合蛋白的表达。通过不同条件诱导,得到最佳表达条件,然后大量诱导,超声裂解细胞,用谷胱苷肽琼
涂亦娴[3]2011年在《分子佐剂通过粘膜免疫途径增强草原兔尾鼠卵透明带3DNA疫苗抗生育效果的研究》文中提出草原兔尾鼠(Lagurus lagurus)属啮齿目仓鼠科田鼠亚科兔尾鼠属,是新疆荒漠草场的一种野生害鼠,对新疆荒漠草场造成巨大的损害,严重威胁着新疆畜牧业的发展。化学毒杀、诱捕、射杀等传统方法时效短、物种专一性差,对环境造成破坏,不能有效控制害鼠的种群数量。采用免疫不育技术降低有害动物的生育率是一种更人道的、物种专一性更强的防治有害动物的方法。免疫不育疫苗主要以精子或卵子蛋白以及在受精和胚胎早期发育过程中发挥重要作用的蛋白或激素为抗原。肌肉和皮下接种等免疫不育疫苗传统接种方式很难在野外施用以控制有害动物种群数量,而口服饵料等粘膜免疫方式可以对有害动物进行大量接种,是切实可行的方法。鼠卵透明带3(Zona pellucida 3)主要由3种糖蛋白(ZP1、ZP2、ZP3)组成, ZP3作为精子的初级受体,诱发顶体反应,其抗体可以阻止精卵结合,在生殖过程中起重要作用,因此成为免疫不育疫苗的理想靶抗原。DNA疫苗既能激发体液免疫,又能诱导细胞免疫,且具有制备简单、易于贮存运输等诸多优点,已被广泛地应用于免疫不育疫苗的研究中。由于DNA疫苗存在免疫原性不强,免疫效果不佳等原因,因此需要通过添加佐剂,改变发送途径,优化载体等方式来提高DNA不育疫苗的抗生育效果。为了筛选出能有效提高LZP3DNA不育疫苗抗生育效果的分子佐剂,本研究选用小鼠白细胞介素31、白细胞介素15、白细胞介素33和非细胞因子FAI3作为分子佐剂,通过粘膜免疫途径,增强草原兔尾鼠LZP3DNA不育疫苗抗生育效果。并进一步探讨细胞因子和非细胞因子FAI3作为佐剂对草原兔尾鼠卵透明带DNA不育疫苗的免疫调节作用。白细胞介素31主要由活化的Th2细胞生成,在T细胞介导的免疫反应中起重要作用,它参与了炎症和变性皮肤疾病。在遗传过敏性皮炎和接触性过敏性皮炎患者中,IL-31表达水平的增高与IL-4和IL-13具有一定的相关性。细胞因子白细胞介素33(interleukin 33,IL-33)是IL-1家族的新成员。IL-33通过IL-1受体ST2发挥其生物学功能,活化NF-kB和MAP激酶,在体外促进TH2细胞产生TH2相关细胞因子。人IL-33的表达仅限于支气管、小气道的上皮细胞、成纤维细胞以及平滑肌细胞,这暗示IL-33有可能参与了黏膜免疫。DC细胞通过ST2直接对IL-33产生应答,被IL-33活化的DC细胞触发了一种非典型的Th2型免疫反应,生成IL-5和IL-13。IL-33与DC细胞的相互作用可能代表了一种引发Th2型免疫反应的新途径。白细胞介素15是一个促炎症细胞因子,通过诱导淋巴细胞的活化、增殖,细胞因子的释放来增强体液和细胞免疫反应。IL-15充当佐剂时,能提高抗体滴度,促进DC细胞成熟。FAI(Fbrinogen/ albumin/ IgG,纤维蛋白原/白蛋白/免疫球蛋白G受体)是来自C群链球菌的一种多配基结合蛋白,它能同时结合纤维蛋白原、白蛋白和免疫球蛋白G。位于415bp-702bp处的fai3基因片段具有粘膜佐剂活性。首先克隆获得了小鼠细胞因子白细胞介素33基因、白细胞介素31基因和白细胞介素31突变体。成功构建了pcD- mIL-15、pcD- mIL31、pcD- muIL31、pcD- mIL33和pcD- fai3五种重组质粒,这五种质粒均能在真核细胞中表达相应的佐剂分子。用壳聚糖chitosan作为发送载体,chitosan同时或单独包裹DNA疫苗pcD-Lzp3和重组质粒pcD-mIL-15、pcD-mIL31、pcD-muIL31、pcD-mIL33和pcD- fai3形成不同的chitosan-DNA复合物。在第0, 14, 28和42d,分别用不同的chitosan-DNA复合物通过滴鼻免疫途径免疫ICR小鼠。间接ELISA检测血清中抗LZP3特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体,以及阴道洗液和粪便中的特异性IgA抗体。结果显示:滴鼻共免疫chi-(pcD-Lzp3+pcD-mIL-31)或chi-(pcD-Lzp3+pcD-muIL-31)都能诱导机体产生较高水平的血清IgG,降低了雌鼠的平均窝仔数。这两个共免疫组都产生较强的淋巴细胞增殖活性,激发Th1型免疫反应。共免疫chi-(pcD-Lzp3+pcD- muIL-31)不育小鼠的卵巢形态异常;在chi-(pcD-Lzp3+ pcD-mIL-31)组,不育小鼠卵巢中卵泡数量明显减少。Chi-(pcD-Lzp3+pcD-mIL-15)产生较强的淋巴细胞增殖活性。chi-(pcD-Lzp3+pcD-mIL-15)共免疫组小鼠的卵巢组织具有各级形态发育正常的卵泡,无卵巢炎的发生。滴鼻共免疫chi-(pcD-Lzp3+pcD-mIL-33)诱导产生了最高水平的血清IgG和粘膜sIgA,生育率和平均窝仔数显着降低。Chi-(pcD-Lzp3+pcD-mIL-33)共免疫组不育小鼠的卵巢组织出现了卵泡萎缩、卵母细胞丢失等异常现象。这些研究结果表明, mIL-33作为分子佐剂与DNA不育疫苗pcD-Lzp3滴鼻共免疫小鼠,能显着提高DNA不育疫苗抗生育效果,并能够诱导机体产生较强的系统体液免疫反应和粘膜免疫反应。Chi-(pcD-Lzp3+pcD-fai3)滴鼻共免疫也诱导机体生成了抗Lzp3特异性血清IgG和黏膜sIgA,生育率和平均窝仔数显着降低。共免疫组小鼠的卵巢组织具有各级形态发育正常的卵泡,无卵巢炎的发生。结果显示,fai3作为分子佐剂与DNA不育疫苗pcD-Lzp3滴鼻共免疫小鼠增强了体液免疫反应和黏膜免疫反应,提高了DNA不育疫苗的抗生育效果。在chi-(pcD-Lzp3+pcD-fai3)和chi-(pcD-Lzp3+pcD-mIL-33)共免疫组,免疫接种后不育小鼠的抗体水平显着高于生育小鼠,小鼠不育与抗体水平之间具有明显的相关性。口服免疫是不育疫苗发送的有效途径。本研究进一步探讨了小鼠白细胞介素15和FAI3作为口服粘膜佐剂增强Lzp3 DNA不育疫苗抗生育效果的可行性。将上述chitosan-DNA复合物加入鼠粮中,制成饵料,免疫ICR小鼠。结果显示,口服共免疫chi-(pcD-Lzp3+pcD-fai3)都诱导产生了较高水平的血清IgG和肠粘膜sIgA,生育率和平均窝仔数都有所下降。Chi-(pcD-Lzp3+pcD-mIL-15)免疫组产生了较强的淋巴细胞增殖活性。对卵巢切片进行组织学检测,结果显示,两个共免疫组小鼠的卵巢组织正常。综上所述,小鼠细胞因子白细胞介素33作为分子佐剂与草原兔尾鼠DNA不育疫苗pcD-Lzp3滴鼻共免疫小鼠,增强了机体的系统体液免疫反应和粘膜免疫反应,提高了DNA不育疫苗的抗生育率。白细胞介素31、白细胞介素15与草原兔尾鼠DNA不育疫苗pcD-Lzp3滴鼻共免疫小鼠,所产生的抗体水平和抗生育率均低于chi-(pcD-Lzp3+pcD-mIL-33)共免疫组。这些结果说明小鼠细胞因子白细胞介素33与白细胞介素31、白细胞介素15相比较,具有更强的分子佐剂功效。非细胞因子FAI3作为分子佐剂与DNA不育疫苗pcD-Lzp3,通过滴鼻和口服两种黏膜免疫途径共免疫小鼠,不仅增强了体液免疫反应,还激发了机体的粘膜免疫反应。因此,mIL-33和FAI3都可以作为分子佐剂,与DNA不育疫苗pcD-Lzp3共免疫,能够显着提高DNA不育疫苗pcD-Lzp3的抗生育效果。
张蕴斌[4]2002年在《草原兔尾鼠卵透明带3 cDNA的克隆、鉴定与分析的研究》文中指出草原兔尾鼠是威胁新疆畜牧业发展的重要害鼠，其种群的相对过剩不利于草原生态系统的可持续发展。通过免疫不育方法控制鼠害已成为目前国际上的研究热点。卵透明带3（ZP3）蛋白是哺乳动物生殖过程中介导精卵结合的关键因子，已被用作免疫不育控制鼠害研究的主要靶抗原。本论文研究工作采用RT-PCR与RACE相结合的方法，首次克隆了草原兔尾鼠ZP3 全长cDNA并进行了序列分析，构建了真核表达质粒，为草原兔尾鼠免疫不育的研究奠定了基础。首先根据已发表的五种啮齿目动物ZP3 cDNA序列同源性分析结果设计特异性引物，RT-PCR扩增草原兔尾鼠ZP3（lZP3）cDNA保守序列。将扩增产物连接到pMD18-T载体上进行测序后将其与Gene Bank中多种哺乳动物ZP3 cDNA进行同源性比较，确定已克隆出了lZP3 cDNA保守序列。根据已测序的lZP3保守序列设计特异性引物，使用3'和5'RACE的方法扩增lZP3 cDNA的3'末端和5'末端序列并进行测序，所测序列经与lZP3保守序列相互重迭、核对与拼接，获得了lZP3全长cDNA序列。根据已拼接出的lZP3 全长cDNA序列设计基因特异性引物，利用RT-PCR方法扩增lZP3 全长cDNA。将扩增产物连接到pMD18-T载体上进行测序，序列分析表明已克隆出lZP3 全长cDNA。将其与Gene Bank中多种哺乳动物ZP3 cDNA进行同源性比较后，发现草原兔尾鼠与布氏田鼠ZP3 cDNA编码的蛋白前体的某些位点显着不同于其它哺乳动物，其后续研究可能有助于哺乳动物受精机理的阐明与免疫不育疫苗的设计。获得lZP3全长cDNA后，RT-PCR扩增lZP3 cDNA核心片段，构建pGEX-lZP3cf原核表达质粒；用lZP3全长cDNA构建pCMV-lZP3真核表达质粒。经双酶切鉴定后，证实两种质粒均已构建成功，可用于表达重组蛋白和进行免疫不育实验。本工作首次克隆了草原兔尾鼠卵透明带3全长cDNA，已向GeneBank申请注册为新基因，保护了我国的野生动物基因资源，为哺乳动物生殖机理的研究提供了新的资料。构建了lZP3原核与真核表达质粒，为草原兔尾鼠ZP3免疫不育控制鼠害的研究提供了实践基础。
李晨晨, 于继云, 姜敏, 涂亦娴, 马晓林[5]2011年在《草原兔尾鼠卵透明带3DNA疫苗pVAX1-sig-LTB-lZP3-C3d3的构建表达及其免疫不育的研究》文中认为目的:构建草原兔尾鼠卵透明带3 DNA疫苗pVAX1-sig-LTB-lZP3-C3d3进行小鼠的黏膜免疫,增强该疫苗的免疫不育效果。方法:将两种佐剂分子大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基和C3d基因通过酶切鉴定,构建重组质粒pVAX1-sig-LTB-lZP3-C3d3,采用RT-PCR和W estern b lot技术,检测其在mRNA和蛋白水平的表达,并通过肌肉注射、滴鼻和灌服3种途径免疫雌性C57BL/6小鼠,通过ELISA检测抗体水平及分型。结果:酶切鉴定,RT-PCR和W estern b lot结果表明重组质粒构建正确并可在mRNA和蛋白水平的表达,ELISA结果表明以重组质粒pVAX1-sig-LTB-lZP3-C3d3免疫诱导的特异性IgG、IgA的水平明显高于对照组(P<0.01)。抗生育实验表明该疫苗免疫的小鼠平均生仔数与对照组相比差异极显着(P<0.01)。结论:构建的草原兔尾鼠卵透明带3DNA疫苗重组质粒pVAX1-sig-LTB-lZP3-C3d3可高效地激发小鼠特异性免疫应答,提高抗生育的效果。
涂亦娴, 张富春, 鲍乾, 李晨晨, 李新萍[6]2010年在《分子佐剂FAI3通过滴鼻途径增强草原兔尾鼠ZP3DNA疫苗抗生育效果》文中提出目的:探讨纤维蛋白原/白蛋白/IgG受体3(FAI3)作为分子佐剂,通过滴鼻途径增强免疫反应以提高草原兔尾鼠ZP3 DNA疫苗的抗生育效果。方法:FAI是来自C群链球菌的一种多配基结合蛋白,它能同时结合纤维蛋白原、白蛋白和免疫球蛋白G,FAI的基因片段-fai3(415~702 bp)具有黏膜佐剂的功能。通过构建pcD-fai3重组质粒,用chitosan包裹质粒DNA不育疫苗pcD-Lzp3和质粒pcD-fai3,形成复合物的chi-(pcD-Lzp3+pcD-fai3),以及单独的chi-pcD-Lzp3和chi-pcD-fai3,叁种chitosan包裹质粒,分别用这些质粒作为DNA疫苗,分别于第0、14、28、42天,通过滴鼻途径免疫小鼠。间接ELISA检测免疫小鼠血清中抗LZP3特异性IgG,IgG1和IgG2a,同时检测阴道洗液和粪便中的特异性IgA。结果:滴鼻共免疫chi-(pcD-Lzp3+pcD-fai3)诱导产生了高水平的血清IgG和黏膜sIgA,生育率和平均窝仔数显着降低。结论:fai3作为分子佐剂与DNA不育疫苗pcD-Lzp3滴鼻共免疫小鼠,能诱导免疫小鼠产生较强的体液免疫反应和黏膜免疫反应,增强DNA不育疫苗的抗生育效果。
张钰[7]2007年在《卵透明带3（ZP_3）DNA疫苗免疫不育效果的研究》文中研究表明草原兔尾鼠(Lagurus lagurus)为啮齿目仓鼠科田鼠亚科兔尾鼠属,它是一种典型的草原荒漠鼠种。它的分布面积广,体型小,性成熟早,繁殖力强,种群密度高,终年活动,啃食牧草,频繁活动严重践踏植被,是新疆畜牧业发展的重要危害鼠种,严重影响着新疆畜牧业的发展。目前控制鼠害多采用传统的机械捕杀、化学毒杀等方法,但存在耗费大、专一性差、灭效短、种群恢复快等缺点,且化学毒杀方法对环境的危害较大。随着公众对环保和动物权益等意识的增强,许多国家开始转变鼠害防治策略,把免疫不育控制鼠害当作一项重要的研究内容。免疫不育技术在控制野生动物种群数量方面显示出诱人的前景,成为当前国际上一种很有潜力的种群控制技术。哺乳动物卵透明带(zona pellucida,ZP)是由卵母细胞合成和分泌的,由ZP1、ZP2、ZP3叁种硫酸化的糖蛋白组成,是精子在受精过程中必须穿过的障碍。其中ZP3有两个重要作用:一是ZP3上的寡聚糖链与精子专一性地结合;二是在与精子结合后诱导精子的顶体反应。大量实验证明,阻断精子与ZP3的结合就可以阻断小鼠、猪等哺乳动物的生殖过程。因此,ZP3是免疫不育控制有害动物种群和数量的理想靶抗原。本研究利用实验室已经克隆到的草原兔尾鼠卵透明带3基因(Lagurus lagurus zona pellucida 3,lzp3)及昆明白小鼠卵透明带3基因(Mus musculus zona pellucida 3,mzp3)开展一系列DNA疫苗免疫不育效果方面的研究,内容包括: 1探讨不育疫苗的种属特异性为了探讨lzp3与mzp3对NIH小鼠抗生育的种属特异性,特选择草原兔尾鼠卵透明带3(lzp3)和昆明白小鼠卵透明带3(mzp3)基因构建四种DNA疫苗表达载体:pcDNA3-mzp3(pcD-M)、pcDNA3-lzp3(pcD-L)、pcDNA3-aat-comp-mzp3(pcD-ACM)和pcDNA3-aat-comp-lzp(3pcD-ACL)。水动力转染技术(hydrnamic transfection)取代传统的Hela细胞真核转染技术,用RT-PCR检测目的基因能够在小鼠肝脏中表达。上述DNA疫苗肌肉免疫NIH小鼠,ELISA分析表明重组质粒均能使小鼠激发较高水平的特异性抗体,且anti-LZP3能结合到小鼠卵透明带上(荧光结果);抗生育结果表明四种DNA疫苗均具有免疫不育的效果(P<0.05),其中pcDNA3-aat-comp-mzp(3pcD-ACM)的免疫效果最好(P<0.01);卵巢病理切片H.E染色结果显示pcD-M、pcD-L和pcD-ACL组卵巢结构没有变化,而pcD-ACM组卵巢结构发生病理性变化。结果初步说明草原兔尾鼠和昆明白小鼠卵透明带3对NIH小白鼠均有抗生育效果,在不同小鼠科属和品系间ZP3不具有特异性。2 HSP70增强ZP3 DNA疫苗免疫效果为探讨分枝杆菌热休克蛋白(HSP70)对草原兔尾鼠卵透明带3(lzp3)抗生育效果,本实验设计带有连接子的融合引物,将HSP70全长和C端分别与lzp3融合构建重组质粒:pcDNA3-lzp3-HSP7(0pcD-L-HSP70)和pcDNA3-lzp3-HSP70C(pcD-L-HSP70C)。以具有抗生育功能的pcDNA3-lzp3(pcD-L)和pcDNA3- aat-comp-lzp3-C3d3(pcD-ACLC)作为对照。水动力转染技术(hydrnamic transfection)取代传统的Hela细胞真核转染技术,RT-PCR检测目的基因均能在小鼠肝脏中表达后,将其制成疫苗免疫NIH小鼠。T细胞增殖结果表明实验组均能刺激机体T细胞发生增殖,尤其是pcD-ACLC和pcD-L-HSP70C免疫组(P<0.01);ELISA分析表明重组质粒均能使小鼠激发特异性的LZP3抗体反应(p<0.05),且anti-Lzp3能结合到小鼠卵透明带上(荧光结果);合笼结果显示除pcD-L-HSP70免疫组外其它叁种重组质粒均具有抗生育效果(P<0.05),其中pcD-ACLC和pcD-L-HSP70C免疫组效果极显着(P<0.01),且未引发机体卵巢组织发生病理性变化。以上结果显示pcD-L-HSP70和pcD-L-HSP70C均可激发机体特异性的体液免疫和细胞免疫反应,但pcD-L-HSP70未能显着性地增强NIH小鼠的抗生育效果;相比之下,pcD-L-HSP70C能极显着地增强免疫不育效果。以上结果说明分枝杆菌热休克蛋白HSP70C端比HSP70全长具有更好的基因佐剂功效。3探讨壳聚糖介导ZP3 DNA疫苗口服免疫途径为探讨壳聚糖介导ZP3 DNA疫苗口服免疫途径的可行性,以壳聚糖分别包裹pcDNA3-lzp3(pcD-L)和pcDNA3-aat-comp-lzp3-C3d3(pcD-ACLC)后口服免疫小鼠,同时以等剂量肌肉注射作为对照。水动力转染技术(hydrnamic transfection)取代传统的Hela细胞真核转染技术,RT-PCR检测chitosan介导或未介导的目的基因均能在小鼠肝脏中表达。上述疫苗分别于0、3、6、9、12d快速口服免疫NIH小鼠,T细胞增殖检测表明口服和肌肉免疫组均能激发机体T细胞增殖,尤其是口服免疫组pcD-ACLC的增殖水平极显着高于对照组(P<0.01);ELISA检测结果表明口服免疫组血清中几乎不产生IgG和IgA,肌肉注射组相对产生较高水平的IgG,但是口服免疫组小鼠分泌物中含有高水平特异性的IgA(p<0.01);抗生育结果表明口服及肌肉免疫组均能引起小鼠平均窝崽数降低,但未达到显着性水平(p>0.05),且卵巢未发生病理性变化;直接免疫荧光结果表明在紫外激发光下不育小鼠卵透明带发出绿色荧光。以上结果初步表明快速口服壳聚糖介导的DNA不育疫苗pcD-L和pcD-ACLC均能降低小鼠的平均窝崽数,具有潜在的免疫不育功效。4抗生育免疫反应类型的确定为探讨不育疫苗可能的抗生育机制,采用IgG分型试剂盒的方法对DNA、protein、DNA-protein免疫鼠的抗血清进行IgG1和IgG2a分型检测。结果表明抗生育疫苗在具有很好免疫不育效果的同时,无论是DNA免疫还是protein免疫及DNA-protein免疫组IgG1/IgG2a均大于1,即免疫使小鼠机体激发体液为主的Th2型免疫反应,大大减少了小鼠卵巢炎症或病理性变化发生的机率。
张爱莲, 庄淑珍, 吴道澄, 李轶杰, 张富春[8]2009年在《口服草原兔尾鼠卵透明带3纳米乳剂DNA疫苗免疫效果研究》文中进行了进一步梳理用免疫不育疫苗控制有害动物的数量成为动物种群数量控制的一个有效措施,对于大多数动物来说,口服饵料发送系统是最好的选择。但是口服疫苗容易产生耐受,且生物利用度低,利用多聚物包裹口服疫苗是一种打破口服耐受,提高其生物利用度的新途径。本文以纳米乳剂作为草原兔尾鼠卵透明带3(Lugurus zone pellucida 3,LZP3)DNA疫苗的发送载体,探讨通过口服途径增强小鼠的免疫效果和抗生育率。用纳米乳剂包裹lzp3DNA疫苗后,采用强阴离子交换色谱法测定纳米乳剂的包封率,将制备好的质粒纳米乳剂lzp3 DNA疫苗通过口服饵料免疫小鼠,检测到免疫后小鼠的体内产生了特异性的抗LZP3的IgG和IgA。对免疫后小鼠进行抗生育实验,分析生育后免疫小鼠的卵巢病理切片。研究结果表明,用质粒纳米乳剂lzp3 DNA疫苗通过口服途径免疫,在小鼠的血清和粘液中检测到了特异性的抗LZP3的IgG和IgA,同时也产生了相应的抗生育作用,表明纳米乳剂作为口服不育疫苗的发送载体是可行的,为草原兔尾鼠鼠害的防治提供了理论基础。
张钰, 李轶杰, 刘菲, 陈蓉, 郭继华[9]2007年在《草原兔尾鼠和昆明白小鼠卵透明带3 DNA疫苗免疫不育效果的研究》文中指出为探讨不同种类小鼠卵透明带3(zp_3)的免疫不育效果,并筛选高效且具有物种特异性的DNA抗生育疫苗,本研究选择草原兔尾鼠卵透明带3(Lzp_3)和昆明白小鼠卵透明带3(Mzp_3)构建不同的DNA抗生育疫苗表达载体,pcDNA3-mzp_3(pcD-M)、pcDNA3-lzp_3(pcD-L)、pcDNA3-aat- comp-mzp_3(pcD-ACM)和pcDNA3-aat-comp-lzp_3(pcD-ACL)分别免疫NIH小白鼠。研究中用水动力转染技术取代传统的Hela细胞真核转染检测小鼠体内真核表达情况,结果表明四种质粒均能在小鼠肝脏中进行表达:ELISA图示表明重组质粒均能使小鼠激发较高水平的特异性抗体;抗生育结果表明四种DNA疫苗均具有免疫不育的效果(P<0.05),其中pcDNA3-aat-comp-mzp_3(pcD-ACM)的免疫效果最好(P<0.01);卵巢病理切片H.E染色结果显示pcD-M和pcD-L组卵巢结构与对照小鼠区别不大,而pcD-ACL和pcD-ACM组卵巢结构发生病理性变化。结果初步说明草原兔尾鼠和昆明白小鼠卵透明带3对NIH小白鼠均有抗生育效果,但不具有物种特异性。
陈邦党[10]2007年在《人乳头瘤病毒16型L1基因、小鼠及草原兔尾鼠卵透明带3基因重组腺病毒载体的构建及表达》文中指出1.人乳头瘤病毒16型L1基因重组腺病毒载体的构建及表达人乳头瘤病毒(Human papillomavirus, HPV )是一种双链的小DNA病毒。高危型HPV可引起宫颈癌等恶性肿瘤,其中最常见的是HPV 16型和HPV 18型。大量研究资料证明,50%的宫颈癌与HPV16感染相关。因HPV有潜在的致癌性,故HPV疫苗的制备不能采用传统的减毒活疫苗或灭活疫苗。目前,HPV16疫苗研究集中于晚期蛋白L1及L2组成的基因工程亚单位疫苗。HPV16晚期基因L1编码病毒的主要衣壳蛋白,在真核细胞中产生的HPV16L1或L1+L2可高效自行装配成病毒样颗粒(virus like particles, VLPs)。由于VLPs不含DNA成分,且结构和天然病毒颗粒相似,能刺激机体产生抗体,保护机体不受同型别HPV感染而成为引人关注的免疫原。在前期的研究中,我们已经从新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌组织中克隆获得HPV16 L1基因。该基因发生多位点变异,并形成突变的主流模式,这些突变引起HPV16 L1蛋白疏水性和抗原性的改变。L1基因的突变可导致HPV16逃避机体免疫识别,造成HPV16的持续感染。以新疆地区宫颈癌患者组织中的HPV16 L1基因开展疫苗研究,对预防HPV 16新疆流行株的感染将更为有效。本研究将本室克隆的新疆株HPV16 L1基因亚克隆到腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV上,采用细菌内同源重组“两步转化法”构建携带L1基因的重组腺病毒质粒pAd-L1,以获得的重组质粒线性化后转染HEK293细胞,获得重组腺病毒;PCR法对重组腺病毒基因鉴定表明L1基因已经整合到腺病毒基因组中,空斑法测定重组腺病毒RAd-L1的滴度为1.5×109 pfu /L,RT-PCR检测表明该重组腺病毒感染后的宿主细胞具有HPV16L1对应的mRNA表达;Western blot和间接免疫荧光检测表明L1基因在HEK293细胞能够有效的表达。制备了表达新疆人乳头瘤病毒16型L1基因的非复制型重组腺病毒,为后续进行重组腺病毒在动物体内诱导抗L1免疫应答能力的研究奠定了基础。2.小鼠、草原兔尾鼠卵透明带3基因重组腺病毒载体的构建及表达哺乳动物卵透明带(zonapellucida,ZP)是由卵泡细胞和卵细胞合成和分泌的,由ZP1、ZP2、ZP3叁种硫酸化的糖蛋白组成,是受精过程中精子必须穿过的障碍。其中ZP3在受精过程中有两个重要作用:一是与精子专一性地结合;二是与精子结合后诱导精子的顶体反应。大量实验证明,阻断精子与ZP3的结合就可以阻断小鼠、猪等哺乳动物的生殖过程,因此,ZP3是利用免疫不育技术控制有害动物种群数量的理想靶抗原。重组腺病毒载体可模仿病毒天然的感染方式,有效地将外源DNA导入宿主细胞内并表达天然的、保持完整生物活性的抗原蛋白,能够诱导有效的特异性体液免疫应答和强烈的细胞免疫应答。本研究所用病毒载体为缺失E1和E3基因的人血清型5型复制缺陷性腺病毒,插入外源基因可达7.5kb;宿主范围广,可转染分化及未分化细胞;可获得高滴度的病毒,而且腺病毒并不整合到宿主基因组上,相对安全,基因转染后不会激活或者抑制宿主细胞基因的表达,因此作为免疫不育疫苗载体具有明显的优势。本研究将本室克隆的草原兔尾鼠和小鼠的zp3基因亚克隆到腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV上,采用细菌内同源重组“两步转化法”构建携带zp3基因的重组腺病毒质粒pAd-mzp3和pAd-lzp3,以获得的重组质粒线性化后转染HEK293细胞,包装成重组腺病毒;PCR法对重组腺病毒基因鉴定表明mzp3和lzp3基因已经整合到腺病毒基因组中;间接免疫荧光检测表明zp3基因在HEK293细胞中能够有效表达;病毒的滴度可达1.2×109pfu /L和1.3×109pfu/L;继而用鉴定正确的重组腺病毒感染HeLa细胞,RT-PCR检测表明构建的重组腺病毒感染后的宿主细胞具有mzp3和lzp3对应的mRNA表达,Western blot检测表明感染的HeLa细胞中zp3基因能够有效表达。本研究探索制备免疫不育疫苗的新途径,获得草原兔尾鼠卵透明带3(lzp3)和小鼠卵透明带3(mzp3)重组腺病毒载体疫苗,为进一步进行重组腺病毒活疫苗免疫不育技术控制鼠害的研究奠定基础。
参考文献：
[1]. 草原兔尾鼠卵透明带3（ZP_3）DNA疫苗免疫不育的研究[D]. 李涛. 新疆大学. 2003
[2]. 免疫不育疫苗控制草原兔尾鼠生育的研究[D]. 张爱莲. 新疆大学. 2004
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[4]. 草原兔尾鼠卵透明带3 cDNA的克隆、鉴定与分析的研究[D]. 张蕴斌. 新疆大学. 2002
[5]. 草原兔尾鼠卵透明带3DNA疫苗pVAX1-sig-LTB-lZP3-C3d3的构建表达及其免疫不育的研究[J]. 李晨晨, 于继云, 姜敏, 涂亦娴, 马晓林. 细胞与分子免疫学杂志. 2011
[6]. 分子佐剂FAI3通过滴鼻途径增强草原兔尾鼠ZP3DNA疫苗抗生育效果[J]. 涂亦娴, 张富春, 鲍乾, 李晨晨, 李新萍. 细胞与分子免疫学杂志. 2010
[7]. 卵透明带3（ZP_3）DNA疫苗免疫不育效果的研究[D]. 张钰. 新疆大学. 2007
[8]. 口服草原兔尾鼠卵透明带3纳米乳剂DNA疫苗免疫效果研究[J]. 张爱莲, 庄淑珍, 吴道澄, 李轶杰, 张富春. 分子细胞生物学报. 2009
[9]. 草原兔尾鼠和昆明白小鼠卵透明带3 DNA疫苗免疫不育效果的研究[J]. 张钰, 李轶杰, 刘菲, 陈蓉, 郭继华. 分子细胞生物学报. 2007
[10]. 人乳头瘤病毒16型L1基因、小鼠及草原兔尾鼠卵透明带3基因重组腺病毒载体的构建及表达[D]. 陈邦党. 新疆大学. 2007
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