张霞[1]2001年在《微生物转化法生产二羟基丙酮》文中指出本论文从来自于不同地区的50多份土壤中筛选到能转化甘油为二羟基丙酮的微生物茵株30多株，对各菌株二羟基丙酮的生产能力进行了鉴定、比较，并以其中转化活性最高的菌株delqh6为材料，考察了微生物发酵法与酶转化法生产二羟基丙酮的工艺条件及主要影响因素，论文主要由如下内容组成： 综述了二羟基丙酮的性质和用途，阐述了醋酸细菌属细胞中甘油的运输机制与代谢机理，概括了二羟基丙酮的微生物转化方法与有关微生物发酵法与酶转化法生产二羟基丙酮的工艺条件及主要影响因素；创立了甘油存在下二羟基两酮的定性、定量分析方法，完善了甘油的高碘酸定量分析方法，自行设计了菌种筛选思路与模型，设计了菌种筛选实验步骤，对自然界所采土壤样品进行菌种筛选，对所筛菌株二羟基丙酮的生产能力进行鉴定和比较，其中甘油到二羟基丙酮的最高转化率为16％，并以这一菌株（命名为delqh6）为试验材料既研究了微生物发酵法与酶转化法生产二羟基丙酮的工艺条件和主要影响因素，也研究了甘油脱氢酶的形成条件及其反应活性的主要影响因素，优化培养基配方及主要工艺条件，探索微生物发酵法与酶转化法生产二羟基丙酮的合适工艺条件，本论文实验中，甘油到二羟基丙酮的最高转化率达25％以上。 最后比较了两种二羟基丙酮的生产方法，并展望了酶转化法生产二羟基丙酮的潜在应用价值。
吴建[2]2010年在《基于膜结合醇脱氢酶特性的氧化葡萄糖酸杆菌选择性氧化甘油及苯甲醇的研究》文中研究说明氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)是一种在生物工业中广泛应用的微生物,它含有多种膜结合的脱氢酶,表现非常独特的、其它微生物无法比拟的不完全氧化特性,可立体选择性和区域选择性地氧化醇、糖等羟基化合物生成相应的醛,酮或酸。利用氧化葡萄糖酸杆菌中的膜结合甘油脱氢酶可直接将甘油区域选择性脱氢生成二羟基丙酮,而利用膜结合的乙醇脱氢酶可化学选择性氧化苯甲醇生成苯甲醛。本论文以二羟基丙酮和苯甲醛的合成为目标,针对性地研究转化过程中的关键影响参数,探讨酶或细胞活性的影响机制,提出相应的解决策略,实现二羟基丙酮合成过程的规模放大,建立相对高效的苯甲醛生物法合成工艺。第一部分,基于对依赖PPQ的膜结合甘油脱氢酶的认知进行了氧化葡萄糖酸杆菌转化甘油合成二羟基丙酮的过程研究及规模放大。(1)建立了一种简便、快速、同时检测发酵液中甘油和二羟基丙酮的气相色谱方法。利用N-甲基咪唑作为催化剂,可在室温下快速完成对发酵液中甘油和二羟基丙酮的乙酰化,乙酰化的产物用气相色谱检测,内标法定量。方法验证表明,甘油和二羟基丙酮在1-100酬的浓度范围内线性良好,检测限分别为0.013和0.025g/l。方法准确度,重现性好,样品回收率大于95%, RSD小于1%。(2)筛选了具有高甘油脱氢酶活性的菌株,进而比较了发酵法与静息细胞转化法对生产二羟基丙酮的影响,结果显示,静息细胞在菌体量,二羟基丙酮产率以及保留活细胞数等叁个方面分别提高了43.2,18.1和27.6%。(3)在摇瓶中初步确定了氧化葡萄糖酸杆菌静息细胞转化甘油的适宜条件：反应温度30℃、pH 6.0、转速200rpm、细胞浓度5g/l(干重)、甘油浓度46g/l,摇瓶中二羟基丙酮的产率不超过30g/l。在此基础之上,在3.7L发酵罐进行转化试验,通过溶氧和pH的有效控制,5.0-8.0g/l的静息细胞可在8-16h内转化100-120g/l甘油,转化率大于98%,可获得平均13.75g/lh最大时空产率。高浓度二羟基丙酮对反应有强烈抑制,其使反应趋于停止的临界浓度在140g/l左右。溶氧是影响二羟丙酮产率的重要限制因素,可在保持最大通气量的情况下,依据反应液中溶氧和pH的变化进行搅拌转速的调控,以满足反应过程溶氧需求。(4)对于高浓度二羟基丙酮降低细胞催化活性的原因,流式细胞仪检测和红外光谱的分析结果初步证明：二羟基丙酮对氧化葡萄糖酸杆菌静息细胞生理状态没有显着影响,而二羟基丙酮对膜结合甘油脱氢酶的不可逆抑制(失活)才是降低细胞活性的主要原因。(5)分别在300L和30L发酵罐上成功实现了菌体培养和静息细胞转化的规模放大。随着反应器的逐级放大,菌体生长和甘油转化活性都有不同程度地提高。在300L发酵罐上可获得8.5g/l菌体,分别比摇瓶、30L罐提高了164.5%和11.6%；在30L发酵罐上转化初速度比3.7L发酵罐上提高了17.4%。30L发酵罐上进行了9批菌体重复利用试验,转化率均大于98%,累计转化甘油850g/l,是目前报道的最高水平。第二部分,基于对依赖PQQ的膜结合乙醇脱氢酶的认知完成了氧化葡萄糖酸杆菌静息细胞不完全氧化苯甲醇合成苯甲醛的过程研究。(1)确定了氧化葡萄糖酸杆菌中负责氧化苯甲醇合成苯甲醛的酶为膜结合的乙醇脱氢酶(ADH),其作用机制是有序机制,O2是先导底物。膜上只有一个乙醛脱氢酶(ALDH),可将生成的苯甲醛进一步氧化成苯甲酸。(2)针对由醛脱氢酶引起的苯甲醛过氧化问题,利用缺失膜结合乙醛脱氢酶基因的氧化葡萄糖酸杆菌,在单水相体系中可使苯甲醛的选择性达到67.3%,而原始菌只有2.8%。在两相体系中利用其可进一步改善苯甲醛选择性和转化速率,1h内可完全转化5g/l的苯甲醇,苯甲醛选择性可达100%,该结果优于目前报道的微生物合成苯甲醛的最高水平。(3)针对有机溶剂对静息细胞的毒性影响,利用海藻酸钠包埋固定化细胞进行苯甲醇的转化反应。利用响应面法优化了固定化细胞中的叁个重要因素的水平,结果表明：海藻酸钠浓度、细胞浓度和固定化颗粒粒径分别为2.55%(w/v)、49.26g/l和2mm时,固定化细胞可获得最好的活性和稳定性。在两相体系中,固定化细胞的稳定性明显高于游离细胞,在10批反应后还可保留游离细胞活性的53.2%,而游离细胞仅剩15.7%。(4)利用对苯醌作为电子受体在厌氧条件下进行氧化葡萄糖酸杆菌催化苯甲醇合成苯甲醛的研究,可完全阻断苯甲醛到苯甲酸的过氧化,在水溶液中实现苯甲醛的高选择性合成。使用人工电子受体的厌氧反应体系,为水溶性羟基醛的生物法合成提供了新的思路。
马骏[3]2009年在《微生物法生产二羟基丙酮》文中认为本论文以生物柴油联生产物甘油为原料,开展微生物发酵法生产高附加值的精细化学品二羟基丙酮的研究。论文作了以下几方面的工作:利用二羟基丙酮与甘油的化学性质,建立了甘油转化生产二羟基丙酮的微生物快速筛选模型;并利用这个微生物快速模型,从几十份采自全国各地的土壤中筛选产二羟基丙酮的微生物菌株;对其中两株编号为H004、H005的酵母进行了微生物学鉴定,采用形态观察、分子生物学鉴定方法等手段,H004被鉴定为膜醭毕赤酵母(Pichiamembranifaciens),H005为葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae),这两株菌株均已保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。论文对膜醭毕赤酵母产二羟基丙酮的生产工艺进行了研究:考察了发酵温度、装液量、起始pH、甘油浓度等对二羟基丙酮发酵的影响,在单因素实验的基础上,选取pH、温度、发酵时间为实验因素,采用响应面分析方法对二羟基丙酮的生产工艺进行优化,得到的优化生产工艺如下:在摇瓶发酵试验中,采用的培养基为:甘油40g/L,酵母提取粉5 g/L,蛋白胨2 g/L,摇床转速200 rpm,初始pH为6.74,发酵温度为29.6℃,发酵时问为48.8 h,二羟基丙酮最大浓度为12.88g/L。在此优化的生产条件下,在15L发酵罐中生产二羟基丙酮,产物浓度达到13.57 g/L。采用硅胶吸附层析法从发酵液中分离二羟基丙酮,试验首先进行了层析洗脱剂的选择,然后研究了硅胶柱高径比、柱加样量、洗脱流速对层析分离二羟基丙酮和甘油分辨率的影响,得到较佳的层析工艺条件,层析洗脱剂采用95:5的乙酸乙酯-乙醇混合溶剂,柱高径比35,柱加样量为柱床体积5%,洗脱流速0.55BV/h,在该工艺条件下二者分辨率RS达到0.922。洗脱液经过浓缩,结晶工序,得到高纯度的二羟基丙酮成品。
张勇, 郑裕国[4]2005年在《1,3-二羟基丙酮生物技术法生产及其在生物体内的代谢》文中研究表明目的介绍了微生物转化甘油生产二羟基丙酮的作用机理,以及二羟基丙酮在生物体内的代谢情况。方法综合最新国内外文献资料,阐述了甘油作为微生物发酵底物,逐步转化为二羟基丙酮的过程,以及二羟基丙酮在生物体内随着糖和脂肪代谢途径进入,从而分解代谢。结果和结论目前发现微生物转化甘油生产二羟基丙酮的合成途径有两条;而二羟基丙酮在生物体内也至少有两条分解代谢途径。
胡忠策[5]2010年在《生物柴油副产物甘油生物技术法生产二羟基丙酮》文中研究表明随着生物柴油的快速发展,其副产物甘油产量猛增,导致甘油过剩,急需寻求甘油的新用途、加快其下游产品的开发。本论文采用生物技术法,以甘油为原料生产附加值更高的化学品二羟基丙酮。二羟基丙酮广泛应用于化妆品与医药中间体的合成。本论文建立了产二羟基丙酮微生物快速筛选模型,从土样中筛选得到80余株能产二羟基丙酮的微生物菌株,并对其中4株进行了微生物学鉴定,鉴定结果分别为氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)、膜醭毕赤酵母(Pichia membranifaciens)。这些菌株保藏在中国典型微生物保藏中心(CCTCC)。采用等离子注入与紫外线诱变方法,以氧化葡糖杆菌605为出发菌株,经过多轮诱变筛选得到高产稳定的诱变菌株ZJB09112。摇瓶发酵实验结果表明:甘露醇能促进氧化葡糖杆菌生产二羟基丙酮的能力;酵母提取粉、蛋白胨、玉米浆适合于氧化葡糖杆菌生产二羟基丙酮,其中以酵母提取粉为最适氮源;在起始pH偏酸性(pH 4.0~6.0)的条件下有利于二羟基丙酮生产;高KLa有利于氧化葡糖杆菌的生长和二羟基丙酮的合成。研究了补料分批发酵生产二羟基丙酮工艺,研究结果表明:批式补料工艺如下:起始甘油浓度为2.5g/L,发酵24h后开始批式补加甘油,发酵过程中总共补加甘油5次,甘油总浓度为182.5 g/L,发酵68h,二羟基丙酮产量达到161.9 g/L。研究了溶氧、pH对二羟基丙酮补料分批发酵的影响,采用pH控制技术与溶氧控制技术,优化了二羟基丙酮发酵工艺,得到了较佳的恒溶氧控制发酵工艺,得到实验结果如下:溶氧为30%,在发酵初期pH控制在6.0,发酵到20h后,pH控制在5.0,发酵72h,二羟基丙酮产量达到175.9 g/L。在小试研究的基础上,进行发酵工艺的放大研究。在500L发酵罐中进行中试研究;在中试研究的基础上,在5.0M3发酵罐中进行大规模生产工艺研究。在国内首次成功实现二羟基丙酮产业化生产,该套生产技术填补了国内空白,产品销量情况良好。5.0M3发酵罐中生产二羟基丙酮的技术指标如下:发酵周期72h,产物浓度为254.1g/L。该技术指标远远领先于国内外文献报道。研究分析补料分批发酵动力学,将发酵过程分成3个阶段进行动力学分析,建立了菌体细胞生长、底物消耗和产物合成动力学方程。第一阶段(0-10h)的发酵动力学方程组如下:第二阶段(10-24h)的补料分批发酵动力学方程组如下:第叁阶段(24h以后)的补料分批发酵动力学方程组如下:发酵结束后进行二羟基丙酮的分离提取,在提取过程中产生的废弃菌体细胞用于生物催化法生产二羟基丙酮,建立了发酵法结合生物催化法生产二羟基丙酮工艺。研究结果表明:菌体细胞生物催化反应的最适pH为5.0,最适温度为30°C;菌体细胞催化反应动力学参数为:Vmax=0.193 mmol/L/min,Km=21.89 mmol/L;生物催化法生产二羟基丙酮的优化工艺如下:反应液总体积为500mL,菌体浓度7.4 g/L,通风量为1.1vvm,甘油初始浓度为10g/L,在反应过程中流加甘油,流速约为0.4mL/h,在pH5.0、30°C条件下在鼓泡塔生物反应器催化反应66h,二羟基丙酮浓度为61.2g/L。分析了氧化葡糖杆菌体内甘油代谢情况。在发酵液中除了目的产物二羟基丙酮外,还有甲酸、乙酸、琥珀酸、丙酮酸、苹果酸、延胡索酸、酮戊二酸等化合物,在发酵液中没有检测到3-羟基丙醛和1,3-丙二醇等。研究结果表明:部分二羟基丙酮在磷酸激酶的作用下,进入了糖酵解途径;而且叁羧酸循环途径也存在;该菌株不具备甘油脱水酶和1,3-丙二醇氧化还原酶,不具备甘油代谢的还原途径。分析发酵过程中代谢流变化,在发酵前期,甘油主要用于菌体生长,伴随着二羟基丙酮的生成,同时有副产物甲酸、乙酸、琥珀酸和乙醇等生成。在发酵30h以后副产物浓度基本不变。通风量越大,越有利于甲酸和乙酸的生成,而通风量越大时琥珀酸和乙醇的浓度越低。在发酵中后期底物甘油主要用于二羟基丙酮的合成,而甘油用于其它代谢途径的很少。
张文刚, 黄家莺, 顾欣, 黄士新[6]2015年在《新型的饲料添加剂——二羟基丙酮》文中进行了进一步梳理本文综述了二羟基丙酮的理化性质、生产方法、生理功能及其在动物生长中的应用,并简要展望了二羟基丙酮研究和应用的前景。
杨少鹏[7]2016年在《由甘油制备1,3-二羟基丙酮的合成研究》文中指出近年来,随着生物柴油等可再生能源生产和利用的兴起,以生物柴油副产物甘油为原料转化制备成高附加值的精细化学品成为生物和化工领域的研究热点。其中,由甘油转化制备1,3-二羟基丙酮(DHA)是一种重要的转化途径。1,3-二羟基丙酮是一种重要的精细化学品,用途广泛,具有很高的应用价值。本文主要围绕以甘油为原料制备1,3-二羟基丙酮,在中间产物分离、催化氧化、磁性纳米负载型催化剂的制备上进行了一系列研究工作。主要分为叁个方面:(1)甘油与苯甲醛进行缩醛反应,得到两种产物:顺式和反式2-苯基-1,3-二氧六环-5-醇(HPD)以及顺式和反式4-羟甲基-2-苯基-1,3-二氧戊环(HMPD),利用产物之间存在的酸催化平衡以及在苯和石油醚混合溶液中溶解度的差异,对其定向转化和结晶分离进行了研究,得到了顺-2-苯基-1,3-二氧六环-5-醇(cis-HPD)最大收率为96.6%、纯度为96.5%。(2)用H2O2和亚硝酸叔丁酯(TBN)/2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧自由基(TEMPO)/O2两种清洁、高效、安全的催化氧化体系,将顺-2-苯基-1,3-二氧六环-5-醇氧化为相应的羰基化合物2-苯基-1,3-二氧六环-5-酮(PDO),对效果较好的TBN/TEMPO/O2体系通过单因素实验研究了各反应条件对该氧化反应的影响,确定了最佳反应条件,得到了PDO最大收率95%。通过对PDO的酸性水解,得到苯甲醛与最终产物1,3-二羟基丙酮(收率98%)。(3)针对TBN/TEMPO/O2氧化体系中TEMPO价格昂贵、回收困难等问题,设计制备了粒径分布为10~50nm的磁性纳米Fe3O4@SiO2-TEMPO催化剂,TEMPO负载量为0.28mmol/g,饱和磁化强度为26.6emu/g,将其应用于顺-2-苯基-1,3-二氧六环-5-醇的氧化,得到产物PDO的最大收率为91%。经过10次循环使用,其磁响应性能和活性都没有明显下降。
郑小娟[8]2015年在《弗托氏葡萄糖酸杆菌转化甘油生产二羟基丙酮的条件优化》文中指出1,3-二羟基丙酮(1,3-Dihydroxyacetone,DHA)一种具有很高商业价值的化学产品,主要是添加于化妆品中作为美黑剂,也能以医药合成前体和农药合成中间体等精细化工的原料投入使用。甘油作为微生物转化法合成二羟基丙酮的主要底物,在工业化合成二羟基丙酮过程中发挥重要作用。粗甘油作为生物柴油生产过程中的主要副产物,随着生物柴油产业的快速发展,粗甘油的产量也大幅度增加。粗甘油的开发利用能够降低生物柴油的市场价格降低,使能源危机得到缓解。本文研究了弗托式葡萄糖酸杆菌以棕榈油生物柴油甘油为底物,生产二羟基丙酮的条件优化。对摇瓶发酵条件进行优化,30℃为最适温度,6.0为最适p H,200 rpm为最适摇床转速。对氮源和无机盐进行选择,选用氮源是牛肉膏,无机盐是碳酸钙。最后,利用响应面法优化发酵培养基,棕榈油甘油117.18 g/L,牛肉膏15.05 g/L,Ca CO3 3.27g/L,DHA的产量达到最大,为80.13 g/L,其中DHA产量比优化前(64.62 g/L)提高了24%。5 L发酵罐放大实验,棕榈油生物柴油副产品甘油的初始浓度为140 g/L时,经过48 h发酵,DHA产量达到112.38 g/L,转化率为80.27%。研究了氧传质系数(k La)对发酵生产DHA的影响。通过普通摇瓶与挡板摇瓶的对比,显示挡板摇瓶更有利于DHA的合成。摇瓶发酵产量从80.13 g/L提高到131.16 g/L,提高了63.68%。与响应面法优化前64.62 g/L相比提高了102.97%。不同kLa值条件下,发酵罐补料分批发酵结果也显示高k La值更有利于DHA的合成。发酵罐产量从112.38 g/L增加至175.44 g/L,提高了56.11%。然后通过动力学分析,确定了氧是DHA的生产的主要影响因素。研究了静息细胞技术在弗托氏葡糖杆菌转化甘油生产DHA上的应用,实验了氧供应、p H、甘油浓度、接种细胞的菌龄和接种量对DHA产量的影响,确定使用挡板摇瓶,转速为220 rpm,p H为5.0~6.0,甘油浓度为60~80 g/L,接种细胞的菌龄为24~28 h,接种量为1.5 g/L时,DHA的转化率最高。研究了培养批次对静息细胞重复利用的稳定性。初始甘油浓度为60 g/L时,DHA的平均比生成速率和得率较高,在4批次循环培养中,DHA总产量为205.11 g/L,体积产率4.28 g/(L·h),甘油平均转化率为85.46%。
艾珍, 朱林[9]2012年在《二羟基丙酮的合成研究进展》文中进行了进一步梳理二羟基丙酮是一种重要的生化原料、合成试剂,在精细化工、食品工业、化妆品工业等很多行业发挥着重要的作用。由于二羟基丙酮用途广泛,市场容量大,因此对二羟基丙酮的合成研究具有重要的意义。介绍了二羟基丙酮的主要合成方法及其应用研究的进展,并对其前景进行了展望。
宋炜[10]2012年在《转化甘油产二羟基丙酮菌株的筛选及发酵工艺的研究》文中进行了进一步梳理当今世界,石油等化石能源含量日益减少,生物能源得到大力开发,其中生物柴油的生产量日益加大。在生物柴油生产的同时得到了大量的副产物甘油,由于甘油市场比较饱和,甘油售价低廉。寻找开发利用甘油的新途径,不仅可以提高甘油使用的附加值,也能降低生物柴油的成本。以甘油为原料可以得到许多衍生产物,用廉价的甘油作为原料可以生产制得二羟基丙酮,二羟基丙酮应用广泛,市场需求大,二羟基丙酮制品价格高昂,用甘油生产二羟基丙酮具有很高的经济效益。目前,二羟基丙酮的生产研究主要是利用微生物发酵法生产。本文围绕选育一株产二羟基丙酮菌株并对其进行优化培养条件进行研究。主要研究内容包括：(1)建立了利用毛细管电泳(CE)技术快速、准确检测发酵液中二羟基丙酮含量的新方法。所用熔融石英毛细管规格为50μm×60cm(有效长度为45cm),分离电压为24KV,缓冲液为pH9.5的30mmol/L硼砂缓冲溶液,200nm处检测DHA。结果表明,DHA标准样品的迁移时间为8.3min,在100～1000μg/mL范围内线性关系良好(R2=0.9995),加样回收率为97.79%,RSD为1.81%。测得以甘油作为底物发酵产DHA发酵液中DHA含量为3.220g/L,此方法可有效应用于产DHA发酵过程中产物的检测。(2)对从校园果园及花园土壤采集的样品进行富集培养,从中筛选到可以转化甘油生成二羟基丙酮的菌株20余株,其中菌株WT-15菌株的产量最高达7.6g/L,通过对该菌株的培养特征和形态特征观察,初步鉴定该菌株为醋酸杆菌(Acetobacter)。(3)对醋酸杆菌WT-15的紫外-盐酸羟胺复合诱变条件进行研究。在紫外照射30s,盐酸羟胺含量为0.6%时,其正突变率最大为9.8%。成功选育出一株遗传性能稳定的产二羟基丙酮菌株VH-23,其二羟基丙酮产量为9.44g/L,比出发菌株提高了30.6%。(4)研究单因素对醋酸杆菌VH-23发酵产二羟基丙酮的影响,结合单因素实验结果,采用响应面法对其发酵培养基组成及发酵工艺条件进行优化,得到最优发酵条件下：山梨醇33.6g/L,酵母膏15.1g/L,硫酸铵2g/L,磷酸二氢钾1.5g/L,硫酸锰3.2g/L,碳酸钙20g/L,初始pH6.0,装液量100mL/500mL。在此发酵条件下测得二羟基丙酮产量为13.57g/L,相比优化前的9.24g/L,DHA产量提高了约31.9%。
参考文献：
[1]. 微生物转化法生产二羟基丙酮[D]. 张霞. 浙江工业大学. 2001
[2]. 基于膜结合醇脱氢酶特性的氧化葡萄糖酸杆菌选择性氧化甘油及苯甲醇的研究[D]. 吴建. 华东理工大学. 2010
[3]. 微生物法生产二羟基丙酮[D]. 马骏. 浙江工业大学. 2009
[4]. 1,3-二羟基丙酮生物技术法生产及其在生物体内的代谢[J]. 张勇, 郑裕国. 中国现代应用药学. 2005
[5]. 生物柴油副产物甘油生物技术法生产二羟基丙酮[D]. 胡忠策. 浙江工业大学. 2010
[6]. 新型的饲料添加剂——二羟基丙酮[J]. 张文刚, 黄家莺, 顾欣, 黄士新. 上海畜牧兽医通讯. 2015
[7]. 由甘油制备1,3-二羟基丙酮的合成研究[D]. 杨少鹏. 郑州大学. 2016
[8]. 弗托氏葡萄糖酸杆菌转化甘油生产二羟基丙酮的条件优化[D]. 郑小娟. 河南大学. 2015
[9]. 二羟基丙酮的合成研究进展[J]. 艾珍, 朱林. 化工时刊. 2012
[10]. 转化甘油产二羟基丙酮菌株的筛选及发酵工艺的研究[D]. 宋炜. 安徽工程大学. 2012