江苏省泰州市人民医院检验科 江苏 泰州 225300
摘要：间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSCs)是一种来源于中胚层的成体干细胞, 具有多向分化能力，如具有向骨、软骨、脂肪、肌肉、肌腱、血管内皮细胞及神经星形胶质细胞分化的潜能。并且MSC体外较易分离培养、扩增，细胞免疫原性低，易于转染并能长期表达外源基因等特点，故已成为组织工程、基因治疗和再生医学中的研究热点。目前，对MSCs 的分离、纯化、培养还没有统一的方法。MSCs的分离技术和方法主要有4种：贴壁法、流式细胞仪分离法、密度梯度离心法和免疫磁珠法。本研究对传统的分离方法进行一些改进，联合利用密度梯度离心法和差异贴壁法，旨在体外分离培养血管MSCs ，并将其经定向分化诱导为成骨细胞、脂肪细胞和血管内皮细胞，并与骨髓MSC定向分化为血管内皮细胞进行比较，以观察血管来源MSC在血管内皮细胞分化及血管损伤修复中的优势，为临床血管病变性疾病的干细胞治疗提供更为合适的细胞来源。
关键词：间充质干细胞（MSCs），组织工程，流式细胞仪，差速贴壁培养法，定向分化，传代培养，CD13、CD29，多向分化
1，资料与方法
间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSCs)是一种来源于中胚层的成体干细胞, 具有多向分化能力，如具有向骨、软骨、脂肪、肌肉、肌腱、血管内皮细胞及神经星形胶质细胞分化的潜能。MSC体外较易分离培养、扩增，细胞免疫原性低，易于转染并能长期表达外源基ha因等特点，故已成为组织工程、基因治疗和再生医学中的研究热点。MSC存在于体内多种组织，人们已经从骨、脂肪、脐血及脐带等多种组织中成功分离培养出间充质干细胞，但血管组织中MSC的分离培养及功能研究未见报道。
骨髓是MSC分离培养的主要组织来源，但由于 MSCs还可以存在于人类、鸟类、啮齿类等生物的脂肪、血管等多种组织中，具有高度增殖、自我更新及组织再生和修复功能。在体外成功分离培养血管MSC，并得到大量纯化的MSCs 是研究其分化机制、基因调控、以及在临床血管损伤修复应用等方面的前提。
目前，对MSCs 的分离、纯化、培养还没有统一的方法。MSCs的分离技术和方法主要有4种：贴壁法、流式细胞仪分离法、密度梯度离心法和免疫磁珠法。应用流式细胞仪分离法或免疫磁珠法，虽可以得到纯度较高的细胞，但分离过程对细胞的活性影响较大，甚至导致细胞完全失去活性。使用percol1 分离液梯度离心的方法，能有效地将红细胞、白细胞和间充质干细胞分离开来，同时操作简便，快速，对细胞的活性影响较小，但要是所得血管中细胞的量不多，分离得到的单个核细胞数量较少, 接种至培养瓶内细胞密度偏小，不利于细胞的生长。本实验采用差速贴壁培养法及利用密度梯度离心联合分离培养大鼠血管间质干细胞, 通过观察MSCs 在体外分离、培养、扩增的过程, 最后通过流式细胞仪进行间质干细胞的鉴定, 为下一步实验应用提供依据，也进一步增加了间质干细胞的来源。
目前认为，间充质干细胞的分离与培养必须在形态学上和功能学上均满足要求。获得优良的种子细胞对于构建良好的组织工程人工组织具有非常重要的意义。本研究对传统的分离方法进行一些改进，联合利用密度梯度离心法和差异贴壁法，使所获细胞纯度更高，在体外多次传代能保持良好的增殖和分化能力，生物学活性优良。流式细胞仪检测均一表达CD13 、CD29 、CD44等。其次，种子细胞的分化能力对组织工程构建人工组织的效果亦具有决定性的意义。本研究旨在体外分离培养血管MSCs ，并将其经定向分化诱导为成骨细胞、脂肪细胞和血管内皮细胞，并与骨髓MSC定向分化为血管内皮细胞进行比较，以观察血管来源MSC在血管内皮细胞分化及血管损伤修复中的优势，为临床血管病变性疾病的干细胞治疗提供更为合适的细胞来源。
2，实验过程及结果
2.1 MSCs 的取材及原代培养：
取生后5～6 周的雄性健康大鼠, 颈部脱臼处死, 用75% 酒精浸泡1 min,分离出血管, 在装有PBS 液的培养皿内将血管清洗干净, 进行组织破坏后获得培养液的液体移入10 mL 的离心管中, 反复吹打后离心500 r /min, 5 min。弃上清, 加入10% FBS 的L-DMEM培养液吹打混匀, 离心800 r /min, 5 min。弃上清, 再加入培养液重悬细胞, 调整细胞密度为5×105 个/mL 接种于25 cm2 培养瓶中, 置于37℃, 5% CO2, 95%饱和湿度培养箱中培养。接种24 h 后全量换液, 去掉悬浮的细胞及其碎片和杂质, 以后隔天换液一次。每天在倒置相差显微镜下观察、记录。
2.2 MSCs 的传代培养：
待原代细胞生长接近铺满瓶底约80%时, 去除培养液, PBS缓冲液轻洗3 次,加入0.25%胰蛋白酶以及0.02% EDTA, 37℃条件下消化3 min, 倒置相差显微镜下观察, 当细胞回缩、变圆、间隙增大时, 立即加入含10%FBS 的培养液终止消化。用吸管轻轻吹打培养瓶底壁，制作单细胞悬液, 离心1 000 r /min, 5 min。弃上清, 加入培养液, 按1∶2 比例接种到新的培养瓶, 置于37℃, 5%CO2, 95%饱和湿度培养箱中继续培养, 进行传代培养。每2～3 d 换液1 次, 直至贴壁细胞成片, 接近铺满瓶底约80%时, 重复以上操作, 再次传代。
2.3 培养结果
培养24 h, 细胞已开始贴壁, 胞体呈圆形或多边形。培养3 d, 贴壁细胞胞体明显增大并开始分裂增殖, 此时细胞形态渐变为梭形或纺锤形, 呈成纤维细胞样生长, 形成大小不一的集落。通过更换培养液, 不贴壁的造血细胞等被去除; 残存的内皮细胞也应无法生长而死亡或者用流式细胞仪进行二者的分离。贴壁的MSCs 逐渐呈脊梁状、鱼群状、漩涡状、网状或辐射状排列, 细胞分裂增殖十分明显, 胞浆丰富, 核大, 呈椭圆形(左图) 。在9～10 d 左右, 培养的细胞长满培养瓶底的80%～90%并融合。传代培养的MSCs 在形态学上更加趋于一致, 为排列更加有序的成纤维细胞样细胞, 生长旺盛,胞核明显。培养6d 左右即可长满培养瓶底。
2.4.MSCs的鉴定
细胞传至第4代后,用消化液消化细胞, PBS洗涤2次(1 000 r /min) ,流式细胞术检测CD13、CD29的表达情况。经流式细胞仪检测,MSCs均一地表达CD13 、CD29 , CD44等; 而CD34 、CD45 和HLA-DR 阴性，经成骨细胞及成脂肪细胞定向分化鉴定其多向分化潜能。
2.5 实验流程如下图：
2.6 实验结果
本实验成功建立血管MSCs 的体外培养分离方法，获得血管MSC并对其进行表面标志及多向分化潜能鉴定，将为临床血管性疾病的损伤修复提供新的干细胞来源，开展人体自身的血管间充质干细胞的临床应用奠定实验基础。
参考文献：
[1]徐有恒，王琦如. 造血生理学和造血细胞检测技术[D]., 湖南科学技术出版社1997年3月
[2]Emest Beutler.Williams Hematology. 6th ed. 北京：人民卫生出版社 2001年
[3] Zhu W, Xu WR, Jiang RQ, et al. Mesenchymal stem cells from bone marrow favor tumor cell growth in vivo. Experimental and Molecular Pathology,2005,Oct;[Epub ahead of print]
[4]邓家栋，杨崇礼，杨天楹等.邓家栋临床血液学.上海：上海科学技术出版社
，2001年
[5]章静波，宗数东，马文丽.干细胞[D].中国协和医科大学出版社, 2003年2月
[6]Wilderman MJ,Kim S, Gillespie CT,et al.Blockade of TNF-alpha Decreases Both Inflammation and Efficacy of Intrapulmonary Ad.IFNbeta Immunotherapy in an Orthotopic Model of Bronchogenic Lung Cancer . Mol Ther,2006(15)
[7]Studeny M,Marini FC ,Dembinski JL,et al.Mesenchymal stem cell:precursors for tumor stroma and targeted-delivery vehicles for anticancer agents. J Natl Cancer Inst,2004,96(21):1593-1560
[7]裴雪涛. 干细胞技术[D]. 化学工业出版社,2002年1月
[8]许文荣，王建中. 临床血液学与检验[D].人民为生出版社, 2008年11月
[9]卢建华，吴建国，赵俊.医学科研思维与创新[D].科学出版社2005年8月
论文作者:唐立敏
论文发表刊物:《医师在线》2016年10月第19期
论文发表时间:2016/11/29
标签：细胞论文; 血管论文; 干细胞论文; 内皮论文; 培养液论文; 组织论文; 体外论文; 《医师在线》2016年10月第19期论文;