郝慧[1]2012年在《甜菜蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因的克隆及其遗传转化》文中进行了进一步梳理甜菜是我国糖料作物之一,在我国北方地区种植,在育种过程中,主要的目的是培育出高产、高糖、高品质的新品种甜菜。在甜菜的生产中病虫害较多,从而影响到甜菜的质量和品质。为了使植物生长性状得到改变,基因工程是最直接有效的手段。由于基因工程具有周期短,见效快等优点,所以,基因工程在植物新品种选育中是一条有效的途径。由于建立甜菜植株再生体系比较困难,较低的遗传转化效率,具有较差的重复性。因此,甜菜植株再生体系及遗传转化体系的建立,转化并培育出优质、高产的甜菜新品种是许多研究者的目标,具有很大意义。本研究是通过RT-PCR扩增技术,将甜菜的蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因克隆出来,进行重组质粒的构建,将目的基因利用农杆菌介导法导入甜菜,转化条件得到了优化,建立了稳定的甜菜叶柄遗传转化体系,获得转蔗糖磷酸合成酶基因的甜菜再生植株。主要研究结果如下:1.对SPS基因进行扩增利用RT-PCR方法从甜菜嫩叶片总RNA中克隆出甜菜的SPS基因。进行测定序列,该序列与甜菜SPS基因编码区的核苷酸序列其同源性可达100%。2.构建植物表达载体利用pMD18-TVector克隆载体的介导,将SPS基因与质粒pBI121连接,构建了以CaMV35S为启动子和Tnos为终止子的植物双元表达载体,该载体含有选择标记基因nptII。3.农杆菌介导法优化了甜菜叶柄遗传转化体系结果显示:将生长到对数生长期的农杆菌菌液重悬稀释,确定了浓度OD600值为0.6;叶柄外植体经过48h的预培养,确定侵染时间为5min;确定了共培养培养基中乙酰丁香酮的浓度为100μmol/L;确定了22℃~25℃共培养4d;经过头孢霉素的抑菌,确定了200mg/L的Kan浓度的筛选。4.对获得的阳性植株检测用农杆菌介导法将SPS基因转入甜菜,经过筛选培养共获得27株抗Kan的甜菜稳定再生植株。提取27株基因组DNA,经PCR检测有8株呈阳性植株,PCR阳性率为29%。
刘宝辉[2]2003年在《玉米蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因的克隆及对甜菜遗传转化的研究》文中研究说明甜菜(Beta Vulgaris L.)是世界上重要的糖料作物。但由于甜菜块根根重(吨/公顷)和根中含糖(%)呈负相关,通过常规育种途径很难育出根重与糖分之间平衡最佳的品种。前人的研究结果表明蔗糖磷酸合成酶(SPS)在碳分配中起着关键的作用。 近年来基因工程在品种改良方面取得了重大的进展。由于可控性强,效率高,周期短,成本低,并且可以利用远缘的基因资源。因此,基因工程将成为新品种选育的一条全新而有效的途径。从优良作物品种中克隆有益基因,进行遗传转化,进而培育出优质新品种(系)已成为现代分子育种发展的方向。 在甜菜的遗传转化方面,甜菜植株再生系统的建立极其困难,遗传转化效率低,重复性差。本研究是通过RT-PCR,将玉米的蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因克隆出来,构建重组质粒,分别利用农杆菌介导法和基因枪轰击法将目的基因导入甜菜,并探讨了影响植株再生和遗传转化效率的因子,建立了稳定的甜菜植株再生和遗传转化体系,获得转SPS基因的甜菜植株,为甜菜高生产力分子育种提供了基础材料和理论依据。主要研究结果如下: 1.利用RT-PCR方法从玉米幼苗叶片总RNA中克隆出玉米的蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因的全长cDNA片段。该片段与文献报道的序列具有99%的同源性。 2.确定了在50ul PCR反应体系中10mM MgCl2加入1.0ul时,其高保真Taq DNA聚合酶活性最大。 3.分别构建了以CaMV35S为启动子,以Tnos为终止子的植物双元表达载体PBISPS和以Pcab为启动子,以T35S为终止子的植物表达载体PBSPS,通过农杆菌介导的方法和基因枪法对经过预培养的甜菜叶柄进行遗传转化。其中PBISPS含有NPTⅡ选择标记基因,PBSPS不含选择标记基因。 4.建立了甜菜叶柄器官发生再生系统: a.最佳甜菜种子灭菌剂组合为浓硫酸、70%乙醇、3%次氯酸纳、0.1%升汞。 b.最佳丛生芽诱导分化培养基为MS+IBA0.1mg/l+BA1.0mg/l+30g/l蔗糖+9g/l琼脂粉,PH5.8。 c.最佳丛生芽诱导外植体为经过30天左右预培养的甜菜叶柄。 东北农业大学农学博士学位论文 d.在12个供试的基因型中筛选出4个丛生芽诱导率高的甜菜品种(系),其中忌gi0A 和8908B丛生芽诱导率为引.6%,每个外植体上丛生芽数为4.7个;8910B和新 双8.3.2丛生芽诱导率为48.3%,每个外植体上丛生芽数为5.7个。 e.首次将完全展开叶片的丛生芽甜菜叶柄作为新的外植体诱导丛生芽分化.5.优化了农杆菌介导的经过预培养的甜菜叶柄遗传转化体系: a8910AB、8908B在0.8 OD600菌液浓度的农杆菌侵染8分钟获得最高的抗性芽 率,其抗性芽率分别为36.6%、36.6%和33.3%。而对于材料新双8-3-2在1.0 ODm 菌液浓度的农杆菌侵染6分钟获得最高的抗性芽率,其抗性芽率为40.0%。 b确定了最佳的共培养温度为22-25℃。 C.丛生芽分化阶段卡那霉素的选择压力确定为150mg/L;丛生芽生根阶段卡那霉素 的选择压力 8910AB和 5908B确定为 20mz/L,新双 8-3-2为 25ms/L。 d.在丛生芽分化阶段采用延迟选择法;在抗性芽筛选阶段采用两步选择法即丛生芽 诱导分化阶段和丛生芽生根阶段都进行筛选。6.国内外首次用农杆菌介导的方法对经过预培养的甜菜叶柄进行遗传转化并获得整合 玉米的蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因的转基因甜菜,共4株,阳性植株比率为40%, 整合比率为100%.其中,8910B有2株,8910A有1株,8908B有1株。7.国内首次用基因枪法对经过预培养的甜菜叶柄进行遗传转化获得整合玉米的蔗糖磷 酸合成酶(SPS)基因的转基因甜菜,共3株,阳性植株比率为0.76%,整合比率为 100ng中:8910B有1株,新双M-2有2株。
李建平[3]2010年在《甜菜蔗糖磷酸合酶基因的克隆、表达及其遗传转化》文中指出甜菜是重要的经济作物,蔗糖合成效率的高低是评判甜菜品种好坏的标准之一,因此,研究与蔗糖合成相关的酶也是非常必要的。蔗糖磷酸合酶(SPS)是植物蔗糖合成的关键酶,它在调控光合产物的最终分配、促进库细胞中蔗糖的积累方面具有重要的作用。本研究从以下几方面开展对蔗糖磷酸合酶基因的研究。1. RT-PCR克隆得到甜菜蔗糖磷酸合酶基因(BvSPS1)的克隆,对该基因的序列分析表明:BvSPS1开放阅读框全长3138 bp,编码1045个氨基酸,所推导的蛋白质分子量为118 kDa,所推测的BvSPS1氨基酸序列跨膜区域位于第561-593位氨基酸之间。与酿酒葡萄(Vitis vinifera)的序列同源性是75.45%、烟草(Nicotiana tabacum)为74.59%。2.利用半定量RT-PCR分析了BvSPS1基因在甜菜中的表达,结果显示,该基因在根部的表达水平远远高于叶柄及叶,表达方式属于组织特异性表达。对甜菜各部位的SPS酶活性分析同样表明该酶在根部的活性高于其它部位。葡萄糖及蔗糖对BvSPS1基因的表达产生不同的影响,葡萄糖能够强化BvSPS1基因的表达,且表达量与处理时间相关。3.建立了甜菜的遗传转化体系,研究结果表明叶柄的再生能力较强,甜菜叶柄在6-BA 1.0 mg/L与IAA 0.3 mg/L激素组合的培养基上,再生率较高,均提高至约14.0%。利用农杆菌介导方法将BvSPS1基因导入甜菜,并获得了转基因植株,PCR结果为阳性。本研究得出的结论从分子水平初步阐述了BvSPS1基因的特性和功能,同时通过将该基因导入甜菜获得转基因甜菜,为进一步研究该基因功能奠定基础。
陈志彤, 王俊宏, 陈恩, 黄毅斌, 林永生[4]2016年在《蔗糖磷酸合成酶基因在作物上的应用研究进展》文中研究说明蔗糖磷酸合成酶(Sucrose phosphate synthase,SPS)是高等植物体内控制蔗糖合成的关键酶之一。研究SPS及其基因的组成、调控与表达,对进一步了解植物体内的糖代谢与糖积累具有重要意义。对SPS基因及其在作物上的应用研究进行了综述,包括SPS基因在糖料作物、粮食作物、纤维作物、药用作物及园艺作物等方面的研究进展。
孙亚卿[5]2007年在《核糖体失活蛋白(RIPs)基因的克隆及其对甜菜遗传转化的研究》文中进行了进一步梳理甜菜是世界上重要的糖料作物,但生产中甜菜病害较多,其产量和品质受到严重威胁。改变植物性状表现,转基因是最直接有效的手段。近年来,人们开始尝试通过遗传转化有目的地将抗病基因导入甜菜品种,从中选育抗病、丰产、优质的甜菜新品种。虽然国内外这方面的研究较多,但所取得的成效却甚微,其主要原因是甜菜再生较为困难,遗传转化体系基因依赖性强。植物遗传转化方法有很多,农杆菌介导法由于其可以转入的片段长,拷贝数少,遗传稳定性好等优点,一直是科学研究者重点研究的方法。前人的研究结果表明,核糖体失活蛋白(RIPs)具有抗病毒、真菌、细菌等多种抗性。本研究是通过PCR法,将玉米(Zea mays)RIPs基因克隆出来,构建重组质粒,利用农杆菌法将目的基因导入甜菜,并在已建立的甜菜再生体系基础上,对农杆菌介导的转化条件进行了优化,建立了稳定的甜菜子叶节遗传转化体系,获得转RIPs基因的甜菜植株,为甜菜抗病分子育种提供了基础材料和理论依据。目前取得的主要研究结果如下:1、利用PCR方法从玉米幼苗叶片总DNA中克隆到RIPs基因,并进行序列测定。该基因全长953bp,与文献报道的核苷酸序列具有99.90%的同源性,氨基酸同源性为100%;2、通过pMD18-T Vector这一克隆载体的介导,将RIPs基因与质粒pCAMBIA2301相连,构建了以CaMV35S为启动子,以Tnos为终止子的植物双元表达载体,该载体含有npt II选择标记基因。3、优化了农杆菌介导的甜菜子叶节遗传转化体系,结果显示:将对数生长期的农杆菌重悬稀释后调浓度OD600值为0.4,子叶节外植体经过24h预培养,侵染时间8min,共培养培养基中添加100μM乙酰丁香酮,22℃~25℃共培养48~60h,经过Cb抑菌和125mg/L的Kan筛选,有利于甜菜子叶节的遗传转化。可得到最高的抗性芽率。4、用液氮冷冻法将重组质粒转入农杆菌LBA4404,实现了核糖体失活蛋白(RIPs)基因对甜菜的遗传转化,共获得抗性植株38株,PCR检测的阳性植株11株,阳性植株比率为28.9%。本研究进一步的相关工作正在进行中。
田红梅[6]2008年在《甜瓜果实蔗糖代谢相关酶基因的克隆、表达分析及Anti-CmSPS1对甜瓜的遗传转化》文中研究指明甜瓜(Cucumis melon L.)是世界性的重要园艺作物,糖分组成及含量是衡量甜瓜品质的主要依据之一。蔗糖、葡萄糖和果糖是甜瓜果实中主要的可溶性糖,其含量和组成对果实品质起重要作用,它们的含量和组成严格受蔗糖代谢酶调控,而蔗糖代谢酶包括蔗糖合成酶(SS)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)和转化酶(AI),其中SPS活性的提高和AI活性的降低是蔗糖积累的首要条件,改变SPS的活性可能会改变蔗糖的代谢模式。因此,利用现代分子生物学的方法改变蔗糖代谢酶的活性对甜瓜品质育种具有重要的意义。本研究首先通过RT-PCR及3′、5′RACE技术克隆到甜瓜果实蔗糖磷酸合成酶基因和酸性转化酶基因全长cDNA,研究了这两个基因的组织器官表达特异性和果实发育过程中的表达特异性,然后构建了甜瓜果实SPS基因的反义表达载体。以甜瓜自交系M01-3为材料,通过子房注射法将甜瓜果实反义蔗糖磷酸合成酶基因进行了甜瓜的遗传转化,得到了转基因植株。研究的主要结果如下:1.通过RT-PCR及3′、5′RACE技术克隆到甜瓜果实SPS基因和AI基因全长cDNA。测序结果表明SPS基因全长为3373 bp,编码1054个氨基酸,在GenBank中登记号为DQ521271,命名为CmSPS1;AI基因全长为2178 bp,编码636个氨基酸,在GenBank中登记号为EU260044,命名为CmS-AIV1。2.通过Northern Blot分析得知,在甜瓜的不同组织中,CmSPS1基因在叶片、茎、果实中均有表达,而在根和花中未检测到该基因的表达,而CmS-AIV1基因在花和果实中表达,在根、茎、叶中不表达。在甜瓜果实生长发育过程中,在20 DAP之前没有检测的CmSPS1基因的表达,在20 DAP之后,该基因开始表达,到果实成熟时表达量最高;而CmS-AIV1基因的表达情况与之相反,随着果实的成熟表达量逐渐降低。3.将克隆在pMD18-T载体上的甜瓜CmSPS1基因用HincⅡ和KpnⅠ进行酶切,酶切产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后回收830 bp的片段,将该片段与经KpnⅠ和SmaⅠ酶切的植物表达载体pROK2进行连接,这样获得的重组质粒CmSPS1片段反向插入35S启动子之后,TNOS终止子之前。经酶切和PCR检测表明,我们成功构建了甜瓜反义CmSPS1基因的植物表达载体。4.本研究利用子房注射法将anti-CmSPS1基因对甜瓜进行了遗传转化,应用PCR和PCR Southern Blot技术对后代进行了分子鉴定,在获得的800株成苗中,共鉴定出2株转基因植株,转化效率为0.25%。
蒋彦婕[7]2010年在《一个棉花蔗糖合酶基因的克隆、鉴定与功能研究》文中认为棉花作为世界性的重要经济作物,产生的天然纤维是重要的纺织工业原料。单细胞结构的棉纤维为研究相关基因在发育中的功能提供了一个良好的实验系统。大量基因在棉花不同发育时期表达,控制着胚珠和纤维的发育。而棉花纤维发育相关基因的克隆和遗传转化体系的建立为棉花重要基因的功能验证和目标性状的遗传改良奠定了基础。蔗糖合酶(SuSy, EC2.4.1.13)作为促使蔗糖进入各种代谢途径的关键酶之一,普遍存在于原核生物和真核生物体内。其产物二磷酸尿核苷葡萄糖(UDP-Glc)被认为是棉纤维细胞次生壁中纤维素合成最直接的底物。本研究从7235文库中获得了一段棉花蔗糖合酶基因片段,通过TAIL-PCR技术克隆得到了该基因基因组全长,一共为5582bp,包含15个外显子和14个内含子。并获得了2790bp的cDNA全长,其中ORF为2430bp,共编码809个氨基酸,将其命名为GhSUSA1。该基因属于糖基转移酶-1家族,包含典型的糖基转移结构域,并具有多处磷酸化位点。从两个二倍体棉种中分别得到了GhSUSA1基因序列,并证明陆地棉基因组的A、D亚基因组各存在一个拷贝。该基因在棉花各个不同组织中组成性表达,其中根和雄蕊中表达量高;在纤维发育不同时期表达量有差异,起始期和次生壁加厚期优势表达,伸长期胚珠中表达量高于纤维。分析该基因在不同遗传材料中的差异表达发现,该基因在两个无绒无絮突变体中0DPA表达被抑制,而在高强纤维品系7235中伸长期表达水平高于TM-1。GhSUSA1与棉花中其他两个蔗糖合酶基因比较,虽然在氨基酸序列上有一定相似性,但是这种相似性远小于不同物种同一类型基因间的相似性。无论从结构还是进化距离上来说,叁个基因均有很大差异。我们利用反向遗传学技术,研究棉花蔗糖合酶(Socrose Synthase, SuSy)基因GhSUSA1在棉纤维发育中的功能。通过原核表达技术,从大肠杆菌中纯化到预期大小的由GhSUSA1表达的蛋白,酶活性测定发现其具有典型的蔗糖合酶活性。为进一步研究该基因的功能,用pBI121质粒载体分别构建了E6棉纤维专化表达启动子驱动的反义表达载体(E6AS-SA)和组成性CaMV35S启动子驱动的反义表达载体(35AS-SA);并利用农杆菌介导的遗传转化方法将两个载体导入棉花W0品系,通过棉花体细胞胚胎发生途径获得转基因植株;对每个再生单株都进行NPTII和启动子-基因特异的PCR检测,经过连续两个世代的选择,获得了12个转基因株系。Southern杂交分析表明,这12个转基因株系含有一个至四个拷贝不等。这些GhSUSA1的反义转基因株系表现出纤维显着变短的表型,部分株系纤维的强度和细度也有所变化。选取其中7个只有GhSUSA1被显着抑制的转基因纯合株系进一步分析其在棉花发育中的功能。定量RT-PCR和酶活性检测发现,GhSUSA1在四个E6AS-SA转基因株系5DPA纤维中的表达都受到了不同程度抑制、酶活水平降低;虽然没有引起最终纤维素含量发生变化,但是通过测定棉纤维中的糖含量发现,果糖和葡萄糖含量明显下降,蔗糖含量除了一个株系外也都有所下降,这与酶活水平是一致的。在35AS-SA的转基因株系中,除了发现纤维变短外,还有更明显的种子变小现象,铃重和百粒重均比对照有所下降,纯系种子的苗期生物量也出现下降;我们测定了叁个35AS-SA反义株系10~20DPA种子中GhSUSA1的表达量变化,发现10DPA下降最明显,相应酶活水平也比对照有所下降,叁种糖含量下降明显;成熟种子中淀粉含量的测定结果表明:转基因株系中淀粉含量比对照显着减少,尤其是抑制最为明显的45-49株系.这些结果表明,GhSUSA1基因在棉纤维中的抑制表达导致酶活下降,从而引起可溶性糖含量减少,缩小了伸长期纤维和种皮细胞之间的膨压差,引起纤维长度变短;而在棉花中的组成性抑制则影响了整个库强与生物量,使得种子淀粉合成量下降,减少了铃重和百粒重。为了进一步验证GhSUSA1基因的功能,用pBI121质粒载体构建了GhSUSA1的CaMV35S组成性表达启动子驱动的过量表达载体(35S-SA),用农杆菌介导转化胚性愈伤的方法将这个表达载体转入棉花W0品系。TO和T1代转基因植株有发生GhSUSA1正义共抑制的现象,但是也有植株出现了表达量升高的现象,并且过量表达该基的植株相应的糖含量和T2代苗期生物量均有所增加,还有部分株系出现纤维变长的表型,但是T1代有分离,具体结果需要通过纯系的获得进一步加以验证。此外,在进行棉花的遗传转化中,发现了一个性状可遗传的节间伸长的突变体株系,分析了该株系的表型变异并对其插入区段进行了初步鉴定。另外转基因过程还出现了芽黄突变体和卷叶突变体,这些突变体株系的获得,为棉花形态发育的分子生物学机理研究提供了宝贵的实验材料。
侯金锋[8]2012年在《大豆鲜籽粒蔗糖含量的研究及糖代谢相关基因的克隆与功能分析》文中研究指明菜用大豆是指大豆鼓粒末期(R6-R7)籽粒饱满,英色翠绿时采青食用的大豆专用型品种,是一种重要的豆类蔬菜。外观品质和食味品质是菜用大豆两个基础的品质要素,与菜用大豆这两个性状紧密相关的百荚鲜重、百粒鲜重及鲜籽粒蔗糖含量是菜用大豆品质遗传研究的重要性状。依据菜用大豆这些特殊的目标性状,本研究在对我国323份栽培大豆种质资源进行准确评价、鉴定的基础上,通过关联作图和连锁作图方法发掘与大豆百荚鲜重、百粒鲜重及鲜籽粒蔗糖含量相关的QTL或关联位点。同时,通过同源克隆的方法获得大豆蔗糖代谢关键酶转化酶及蔗糖磷酸合成酶的基因,对这些基因进行大豆发育中籽粒及大豆根、茎、叶、花中的表达特性进行分析,并检测了这些组织中相关酶的活性及糖代谢物的含量。进一步将大豆转化酶基因、蔗糖磷酸合成酶基因转化野生型拟南芥,并将大豆转化酶基因转化拟南芥细胞质转化酶基因功能缺失突变体,观测拟南芥转基因株系相应酶的活性,蔗糖、葡萄糖的含量,以及生长发育中幼苗根长、莲座叶直径等性状。以了解这些酶对组织中糖分累积及植物生长发育的影响。本研究主要结果如下:1.按照菜用大豆品质要求直接通过表型筛选得到一批优异鲜籽粒性状的种质,并通过关联分析方法鉴定得到与百荚鲜重、百粒鲜重、鲜籽粒蔗糖含量相关的58个(次)标记-性状关联位点,涉及36个SSR标记。在这58个关联位点中,有9个蔗糖-SSR关联点,28个百荚鲜重-SSR关联点,21个百粒鲜重-SSR关联点,这49个荚粒鲜重相关位点共涉及29个SSR标记。进一步对这些显着关联位点进行特异等位变异及载体材料发掘,鉴定出一批优异等位变异位点及其典型载体材料。同时用连锁作图的方法共定位到11个(次)QTL与百荚鲜重(5个)、百粒鲜重(4个)、鲜籽粒蔗糖含量(2个)相关。两种不同作图方法检测QTL的结果中均涉及到的SSR标记有4个,分别为Satt136.Satt208.Satt251及Satt445.2.以拟南芥细胞质转化酶基因及蔗糖磷酸合成酶基因序列为探针,分别同源克隆得到两个大豆细胞质转化酶基因GmCInv1和GmCInv2,两个大豆蔗糖磷酸合成酶基因GmSPS1和GmSPS2。 GmCInv1和GmCInv2的开放阅读框分别为2040bp和1665bp,分别编码680个和555个氨基酸残基。推测两蛋白分子量分别为76.96kD和63.30kD,等电点分别为5.94和6.22。GmSPS1和GmSPS2的开放阅读均为3177bp,编码1059个氨基酸残基。推测两蛋白分子量分别为117.97和117.99kD,等电点分别为5.99和6.09。同源性分析发现GmCInv1和GmCInv2与其他植物细胞质转化酶氨基酸序列相似性较高,并与酸性转化酶基因完全分开。GmSPS1与GmSPS2在同源性分析中与拟南芥ATSPS1F及ATSPS2F分到一组,但亲缘关系最近的却是葡萄和茄。3.随着大豆籽粒的发育进程,籽粒中蔗糖含量呈先增长后降低的趋势,葡萄糖含量前期降低较快,后期降低较慢。淀粉含量在不同品种中随发育时期变化的趋势不同。在大豆根、茎、叶、花中,蔗糖含量大都低于葡萄糖含量,这与籽粒中情况恰好相反。随着大豆籽粒发育进程,籽粒中细胞质转化酶、液泡转化酶、细胞壁转化酶活性均是逐步下降,且液泡转化酶活性一直高于细胞质转化酶活性高于细胞壁转化酶活性;蔗糖磷酸合成酶活性在不同品种中变化规律不同。非籽粒组织中,一般叶片和花中转化酶活性较高;蔗糖磷酸合成酶活性有的品种是花中最高,有的是根中最高。随着籽粒的发育进程,两个细胞质转化酶基因GmCInv1与GmCInv2的表达模式不同:GmCInv1呈上升趋势,而GmCInv2有下降趋势,对籽粒中转化酶活性具有明显效应的可能是GmCInv2。两细胞质转化酶基因均是在根中表达量高于其他组织。大豆蔗糖磷酸合成酶基因随籽粒发育进程表达量逐步升高,在根中的表达量高于其他非籽粒组织。糖代谢物含量与酶活性、酶活性与酶基因表达量之间均存在一定的影响关系,但没有完全的控制效果。4.将GmCInv1及GmCInv2分别转化拟南芥野生型(WT)及拟南芥细胞质转化酶基因功能缺失突变体cinv1,将获得纯合阳性转基因株系分别称作W组转基因株系和M组转基因株系。除GmCInv2的M11株系外,GmCInv1、GmCInv2的其他转基因株系均有目的基因的表达及拟南芥自身转化酶AtCinv1基因的表达,WT没有大豆基因表达,突变体cinv1没有大豆基因的表达且自身AtCinv1基因的表达极低。GmCInv1及GmCInv2的表达,专一性的提高了转基因株系的细胞质转化酶活性,对液泡转化酶、细胞壁转化酶活性没有明显效应。转基因株系的蔗糖含量及其蔗糖含量/葡萄糖含量比被降低,表明转化酶活性的提高促进了蔗糖的分解。与对照相比,转基因株系的生长发育受到影响,基因效应包括:促进幼苗根伸长,促进莲座叶生长,促进莲座叶数目增加,增加抽薹数,增加株高,延长开花期。两转化酶基因在某些功能上具有差异。大豆GmCInv1及GmCInv2的表达对拟南芥突变体cinvl的一些表型具有补偿作用,可以恢复其表型,但不一定能完全恢复至WT水平。5.转GmSPS1、GmSPS2的转基因株系均有目的基因的表达,但两基因的6个转基因株系中仅有1个株系Line5的SPS活性与WT有显着性差异。Line5的蔗糖含量明显提高,与WT相比,Line5株高度及幼苗根长得到显着增加。其他5个株系虽然SPS酶活性没有显着提高,但大部分株系仍在所考察的6个生长发育表型中有某一个或两个与WT产生显着性差异。这些结果表明拟南芥中SPS活性的提高能够促进蔗糖的累积,并引起植株生长表型的改变;大豆SPS基因在拟南芥中表达后可能受到其他因素的抑制,以至不能提高拟南芥SPS的活性。
宁秀娟[9]2011年在《高钾水平对温室番茄生长发育和蔗糖代谢的影响》文中指出以“瓯秀806F1”番茄为试验材料,采用营养液砂培技术,改良霍格兰(Hoagland)营养液(K~+为6mmol/L)为对照,通过在不同生长时期进行高钾水平处理(T1:K~+为9mmol/L;T2:K~+为12mmol/L),研究了高钾处理对番茄植株生长发育、叶片和果实中糖分积累和蔗糖代谢相关酶活性以及果实品质的影响,主要结果如下:1.高钾水平处理增加了叶片各种糖分含量。在开花期高钾水平处理后5天,T1和T2叶片果糖分别比对照显着增加21.9%和16.4%;在处理后7天,T2叶片蔗糖和可溶性总糖分别较对照显着增加21.7%和21.4%,T1叶片蔗糖和可溶性总糖分别比对照显着增加6.35%和18.6%。2.高钾水平处理增加了果实中糖分含量。开花期高钾水平处理后60天,T1果实中果糖和葡萄糖含量分别比对照显着提高19.9%和23.9%,T2果实中果糖和葡萄糖含量分别比对照显着提高21.7%和22.3%,T1和T2果实中可溶性总糖含量分别比对照显着增加19.1%和18.4%。果实膨大期高钾水平处理后25天,T2果实中果糖、葡萄糖和可溶性总糖含量最高,分别较对照显着增加11.1%、20.3%和19.8%,T1果实葡萄糖和可溶性总糖也比对照显着增加13.6%和14.9%, TI和T2果实中蔗糖含量分别比对照显着高27.2%和24.2%;淀粉含量分别显着高于对照64.2%和38.0%。3.高钾水平处理提高了番茄叶片和果实中蔗糖代谢相关酶活性。开花期高钾水平处理后5天,T1和T2叶片蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性均与对照达到显着差异水平,分别比对照高12.9%和14.4%;处理后7天,T2叶片酸性转化酶(AI)和中性转化酶(NI)活性分别比对照显着提高52.5%和32.5%,T1和T2叶片蔗糖合成酶(SS)活性分别显着高于对照30.6%和12.8%。开花期高钾水平处理后60天,T2果实AI和NI活性分别显着高于对照24.9%和13.8%,果实中SS活性T1和T2分别显着比对照增加26.5%和24.3%。果实膨大期高钾水平处理后25天,T1和T2果实AI活性分别比对照显着增加53.7%和38.8%;T1果实NI活性显着高于对照17.2%,T2果实NI活性比对照增加9.67%,但差异不显着;果实中SPS活性T1和T2分别显着高于对照32.6%和45.0%。4.间隔6天进行12mmol/L高钾水平的处理显着提高番茄产量和品质。番茄单果重和单株产量分别比对照显着增加20.0%和31.8%;果实Vc、可溶性糖和有机酸含量分别比对照显着提高14.9%、9.36%和35.4%。
张伟伟[10]2010年在《提高甘氨酸甜菜碱含量的转基因小麦的抗逆性分析》文中研究说明干热风和干旱是限制小麦产量的最重要的非生物逆境因子。干热风是低湿、高温和风力共胁迫的灾害气候,而水资源短缺更是公认的全球性环境问题之一。长期以来,国内外对如何提高小麦的抗干热风和抗旱能力开展了广泛而深入的研究。随着植物基因工程的发展以及大量抗逆基因的鉴定和克隆,利用基因工程方法培育抗逆作物新品种已成为减轻逆境胁迫的重要手段。小麦分布广、种植面积大,需求量与供应量之间的矛盾却随着自然环境恶化和人口增长愈来愈突出。基因工程技术的发展和应用,为培育抗逆小麦品种及增加小麦产量开辟了新途径。但由于小麦基因组大、离体培养受基因型的影响大等原因,利用基因工程技术改良小麦的抗逆性研究远落后于其它主要农作物。因此,小麦抗逆基因工程研究具有重要意义。本论文以本实验室已得到的转甘氨酸甜菜碱合成途径的酶基因(来自大肠杆菌的编码胆碱脱氢酶基因betA、来自嗜盐藻青菌的甘氨酸肌氨酸甲基转移酶基因ApGSMT2和二甲基甘氨酸甲基转移酶基因ApDMT2)的小麦为材料,开展转基因小麦抗干热风和抗旱性研究。一、转betA基因小麦的干热风抗性分析选取来自济南17的转betA基因纯合株系BL1、BL2、BL3及其未转基因对照株系,于灌浆期模拟干热风胁迫处理3天,然后恢复自然条件。胁迫处理后,转基因株系植株整体长势较好,旗叶青枯失水较少,与野生型相比甜菜碱含量明显较高。生理测定结果显示:干热风胁迫下各株系叶绿素含量都降低,但转基因株系的叶绿素含量始终高于野生型的。干热风胁迫抑制了所有植株的净光合速率、气孔导度和蒸腾速率:然而转基因植株的受抑制程度明显低于野生型的。在测定过程中,旗叶温度不断升高,但转基因株系的旗叶温度明显低于未转基因对照株系的,这有利于维持较高的灌浆速率。与未转基因植株相比,转基因株系的最大光化学效率(Fv/Fm)在处理后仍然维持在一个较高的水平。干热风胁迫处理3天后,转基因株系旗叶的蔗糖磷酸合成酶(SPS)与蔗糖合成酶(SS)的活性明显高于野生型对照。这些结果表明转基因株系在干热风胁迫处理中能合成较多的碳水化合物,能更好地维持灌浆速率。这与旗叶中可溶性总糖和蔗糖含量的测定结果一致。与未处理组相比,干热风处理3天后各株系株高没有明显变化,穗长和穗粒数略有降低。胁迫处理后植株发生青枯、旗叶持绿面积减小,但转基因植株的旗叶持绿面积要显着大于未转基因的。干热风处理组的百粒重、株粒重均大幅下降,其中株系BL2、BL3与野生型相比差异达到显着性或极显着性水平,即转betA基因植株表现出显着提高的抗干热风特性。二、转ApGSMT2和ApDMT2基因小麦的抗旱性分析将除草剂筛选和PCR检测为阳性的转ApGSMT2和ApDMT2基因的T2代种子和野生型(济麦19)的种子分别播到蛭石盘中,待小苗长到3—4叶期时进行除草剂抗性(选择标记基因为epsp,编码的酶抗除草剂草甘膦)筛选,统计转基因株系中除草剂抗性植株的比例,根据卡方(X2)检验推定外源基因在转基因植株中的遗传行为是否符合孟德尔分离规律。在得到的21个T2代转基因株系中,外源基因均稳定存在。对除草剂筛选后的植株进行PCR和RT-PCR检测。大部分除草剂抗性植株的PCR结果为阳性,RT-PCR检测结果表明目的基因ApGSMT2和ApDMT2在不同株系中的表达强度有差异,表达量最高的株系为AL6。苗期是小麦对缺水较敏感的时期,此阶段受到干旱胁迫会使小麦的分蘖能力下降,从而影响产量。选取目的基因表达量高的3个T2代转基因株系AL1、AL4、AL6和野生型(济麦19)进行苗期持续干旱处理,观测植株生长状态并测定目的基因表达量和甘氨酸甜菜碱含量、相对含水量、光合速率等生理指标,确定转基因株系是否具有较高的抗旱性。测定结果表明,转基因植株在干旱处理中长势较好,分蘖数多;严重干旱胁迫时发生永久性萎蔫较晚,复水后存活率高且能够较快恢复生长。在适度干旱处理中,转基因株系的目的基因表达丰度随着胁迫时间的延长而升高,甘氨酸甜菜碱积累水平也大幅度提高,两者呈显着的正相关,即目的基因表达强度高的株系甘氨酸甜菜碱含量也较高。5叶期小麦幼苗持续干旱7天后,野生型植株失水严重,叶片萎蔫;而转基因植株叶片萎蔫程度低,相对含水量较高。并且,转基因株系的叶片细胞离子渗漏率和MDA含量均显着低于野生型的,即转基因株系的细胞膜损伤和膜脂过氧化程度较轻。细胞中较多可溶性物质的积累有利于细胞吸水和维持正常的膨压。干旱胁迫使得所有株系叶片的细胞可溶性糖和游离氨基酸含量升高,而转基因植株可溶性糖和脯氨酸的积累量显着高于野生型的。干旱胁迫条件下,转基因株系的叶绿素含量、净光合速率、气孔导度和蒸腾速率均高于野生型的,其中株系AL6与野生型相比达到差异显着水平。光化学系统Ⅱ(PSⅡ)的活性测定表明转基因株系小苗PSⅡ复合体受伤害程度较轻。这些结果表明,转ApGSMT2和ApDMT2基因小麦具有比野生型对照明显提高的耐旱性。由于ApGSMT2和ApDMT2催化以甘氨酸为底物合成甘氨酸甜菜碱的代谢反应,分析干旱处理前后植株的氨基酸含量变化有助于评估基因的应用价值。干旱处理后,干旱处理后,丝氨酸含量在所有株系中均有升高,但野生型植株中升高幅度大,转基因株系升高幅度小,且含量明显低于野生型的;野生型植株中甘氨酸含量升高,转基因株系均有下降且含量与野生型相比差异极显着。这表明在转基因株系中有大量的甘氨酸用于甘氨酸甜菜碱合成,由丝氨酸合成甘氨酸的速率也相应提高。甘氨酸是植物体内能够合成且大量存在的一种氨基酸,相对于以胆碱为底物合成甘氨酸甜菜碱的途径,这条途径受底物浓度制约较小,这种优势无疑会促进利用该代谢途径的基因工程发展。综上所述,在已有工作基础上,本工作选出了抗干热风和抗旱能力显着提高的转基因小麦株系,这为培育抗逆小麦新品种创造了优异材料;同时为深入了解小麦抵御非生物胁迫的分子机制提供了有价值资料。
参考文献:
[1]. 甜菜蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因的克隆及其遗传转化[D]. 郝慧. 黑龙江大学. 2012
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[4]. 蔗糖磷酸合成酶基因在作物上的应用研究进展[J]. 陈志彤, 王俊宏, 陈恩, 黄毅斌, 林永生. 闽西职业技术学院学报. 2016
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[6]. 甜瓜果实蔗糖代谢相关酶基因的克隆、表达分析及Anti-CmSPS1对甜瓜的遗传转化[D]. 田红梅. 山东农业大学. 2008
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[8]. 大豆鲜籽粒蔗糖含量的研究及糖代谢相关基因的克隆与功能分析[D]. 侯金锋. 南京农业大学. 2012
[9]. 高钾水平对温室番茄生长发育和蔗糖代谢的影响[D]. 宁秀娟. 中国农业科学院. 2011
[10]. 提高甘氨酸甜菜碱含量的转基因小麦的抗逆性分析[D]. 张伟伟. 山东大学. 2010