李迎霞[1]2002年在《石棉的DNA交联研究》文中研究表明1979年，戴乾圜教授提出了阐明化学致癌机理的双区理论，认为致癌剂活化后引起的DNA互补碱基对间的交联，是致癌作用的关键步骤。流行病学调查和动物试验证明：石棉具有强致癌潜力，特别是诱发肺癌的潜力。根据双区理论预言：石棉与异物植入等所谓物理致癌因子，也是通过诱发DNA互补碱基股间交联而启动癌变的；石棉可能引起两类交联，其一是由石棉活性氧化物引起，其二是石棉本身通过其亲电作用理论上也应引起DNA的股间交联。本论文主要研究石棉是否能引发DNA股间交联和是否由通过活性氧化物——自由基所引发。 本论文通过DNA微孔滤膜碱洗脱法，证明石棉通过诱发细胞中氧化酶产生活化的过程，剂量相关地引发DNA股间交联和DNA-蛋白质间交联，其中DNA股间交联达到80％以上。内源性致癌剂雌二醇引起DNA交联率随药物剂量的升高而明显增加，非致癌剂芘单独与细胞作用不能诱发DNA交联，Fe~(2+)发生Fenton反应而使交联率成倍地提高，自由基清除剂抗坏血酸则抑制交联，表明交联是由羟基自由基HO·所诱发。雌二醇、芘分别与石棉共同作用时对交联有不同的增效作用，Fe2+对石棉与芘、石棉与雌二醇导致的交联有不同的增效作用，抗坏血酸对石棉、石棉与芘、石棉与雌二醇导致的交联不同的抑制作用，都进一步证明交联是由HO·所诱发的。
刘昕[2]2000年在《雌激素、石棉等诱发的DNA交联——双区理论的实验验证》文中进行了进一步梳理双区理论是探讨有机致癌活性关系领域的一项重大突破，目前双区理论正受到国内外的广泛关注。本论文的目的就是根据双区理论的推导进行实验研究，以期为双区理论提供实验旁证，探讨致癌机理。 动物实验及流行病调查证明，雌二醇和己烯雌酚均具有致癌性。戴乾圜教授根据其致癌机理的双区理论推论：雌激素是由于引发DNA互补碱基共价交联而启动致癌作用。借DNA碱洗脱法首次证明雌二醇和己烯雌酚经代谢活化均剂量相关的引起DNA-蛋白质间和DNA股间交联，而非致癌的胆固醇和芘均不能引起交联。已知雌激素与多环芳烃污染具有彼此增强的致癌作用，不能诱发交联的非致癌剂芘与雌二醇共同培育，则总交联率和DNA股间交联率分别达到雌二醇单独作用时的四倍及叁倍，表明雌二醇不仅诱发芘生成双自由基，而芘又反过来促进雌二醇双基的更多形成。 双区理论同时预测物理致癌机理也是源于物理因素引发DNA互补碱基共价交联，用DNA碱洗脱法，以致癌的石棉和不致癌的玻璃纤维作比较，首次证明石棉能剂量相关的引起DNA-蛋白质间和DNA股间交联，而非致癌的玻璃纤维不能引起交联，表明石棉能够诱发自由基与DNA发生交联，从而引发癌变。 上述实验结果符合双区理论的推导，提示致癌剂产生的DNA交联损伤在致癌过程中将产生一定的作用。
戴乾圜, 陈莎, 李迎霞[3]2001年在《石棉借诱发DNA股间互补碱基交联而启动癌变》文中进行了进一步梳理２０世纪８０年代初以来，戴乾圜根据其双区理论预言：辐射、石棉、异物植入等所谓物理致癌因子，也是通过诱发ＤＮＡ互补碱基股间交联而启动癌变．借碱稀释洗脱法证明， 石棉通过诱发细胞中氧化酶产生活化的过程，剂量相关地引发ＤＮＡ股间交联和ＤＮＡ－蛋白质间交联，其中ＤＮＡ股间交联达８０％以上．亚铁离子借Ｆｅｎｔｏｎ反应使交联率成倍地提高，维生素Ｃ则以因子８～９抑制交联，表明交联是由羟基自由基ＨＯ所诱发．非致癌剂芘或内源性致癌剂雌二醇分别与石棉共存时的不同交联增效作用，以及亚铁离子对两者的不同增效作用和维生素Ｃ的不同抑制作用，进一步证明交联是由ＨＯ所诱发．基于ＡＭ１计算指明了交联产物的可能结构，并借ＨＯ诱发的突变谱进一步证明了这些结构的存在．
王起恩, 顾志刚, 韩春华, 柳德米拉·曲路, 吴卫东[4]1999年在《人造矿物纤维对细胞DNA损伤作用的体外研究》文中研究指明目的比较研究１０种人造矿物纤维（ＭＭＭＦ）对人肺泡上皮细胞（Ａ５４９细胞）ＤＮＡ的损伤及修复作用。方法选用日本纤维状物质研究协会提供的１０种标准人造矿物纤维（ＪＦＭ），用单细胞凝胶电泳法，以Ａ５４９细胞作为靶细胞，测定了细胞ＤＮＡ链断裂、损伤后修复及ＤＮＡＤＮＡ链间交联。结果１０种ＪＦＭ纤维都可引起不同程度的ＤＮＡ链断裂、ＤＮＡＤＮＡ链间交联及抑制ＤＮＡ损伤后的修复功能。综合分析发现：微细玻璃纤维的遗传毒性最强，硅灰石的遗传毒性最低。它们的作用程度均低于温石棉。结论ＪＦＭ纤维均具有一定程度的体外遗传毒性，但均低于ＵＩＣＣ温石棉Ｂ。
戴乾圜, 逯萍, 彭少华, 张庆荣[5]2003年在《黄曲霉素和N-亚硝基化合物借诱发DNA互补碱对交联而启动癌变》文中提出致癌机理的双区理论发现,绝大多数环境中的致癌剂,均通过引起DNA股间互补碱对的共价交联而启动细胞的癌变。DNA碱稀释过滤法证明:致癌物中的霉菌毒素即黄曲霉素G_1,N-亚硝基化合物中的亚硝基二乙胺,二丁胺,吗啉和四氢吡咯、偶氮染料中的4-二甲氨基偶氮苯和含氮杂环化合物中的喹啉,均剂量相关地引起DNA股间交联,而相应类型的非致癌剂黄曲霉素B_2、亚硝基二苯胺、4’-溴-4-二甲氨基偶氮苯和异喹啉,均不能引起此种交联。用DNA交联24 h修复实验,首次提出测定DNA股间交联中、互补碱对交联比率的方法。证明:DNA非互补碱对交联被完全修复,但互补碱对间的交联则难以修复,而互补碱对交联的比率与其致癌强度相关,致突变谱数据证明:突变即点突变和移码变异都是由交联的互补碱对所指导。因此,双区理论是化学、内源物和物理致癌作用的合理机理。
余晨[6]2000年在《二氧化硅和石棉的遗传毒性》文中研究指明本文综述了采用原核生物或真核生物的基因突变试验 (细菌回复突变试验、哺乳动物细胞正向突变试验 ) ,细胞遗传学检验 (有丝分裂中期染色体结构和数目的改变、有丝分裂后微核的形成、姊妹染色单体交换试验 ) ,碱基突变、DNA加合物、交联、链断裂以及核因子、细胞周期等分子生物学分析方法 ,对二氧化硅、石棉遗传毒性的研究进展
李彦[7]2007年在《彗星试验方法研究和在医药安全评价上的应用》文中提出彗星试验(Comet assay)又称单细胞凝胶电泳试验(SCGE),是一种用于测定、研究单个细胞DNA断裂的新电泳技术。由于其具有简便、快速、灵敏、样品量少、无需放射性标记等特点,有极高的使用价值。其用于检测遗传毒性的敏感性与Ames试验相当,因此应用前景十分广泛。本文在建立该方法的基础上,将此方法扩展应用到医药安全性评价中。本研究依据Tice等(2000年)建立的国际性试验指导原则,采用医药人参皂苷Rg3冻干粉针为受试物,设3个试验剂量组,分别为140、70、35μg/ml、阴性对照组和以甲基磺酸甲酯(MMS)为阳性对照物的2个阳性对照剂量组,分别为1.1×10-3、11×10-3μg/ml,处理CHL细胞2h后,对CHL细胞进行单细胞凝胶电泳试验。从细胞的彗星图和试验数据分析可以看出,阴性对照组和人参皂苷Rg3冻干粉针各试验剂量组的受试细胞DNA均无明显损伤。阳性对照组细胞出现明显彗星,并随着MMS浓度的增大,彗星尾长明显增长,说明MMS浓度越高,对CHL细胞DNA的损伤越严重,且不同浓度MMS与CHL细胞的DNA损伤之间存在着明显的剂量效应关系且有可重复性。结果表明人参皂苷Rg3冻干粉针对CHL细胞DNA无明显损伤作用。且利用此方法检测人参皂苷Rg3冻干粉针无明显遗传毒性。
朱宁[8]2002年在《紫外光的双区理论致癌机理实验验证》文中进行了进一步梳理流行病调查表明，紫外线辐射可能诱发皮肤癌，其中包括黑色素和非黑色素皮肤癌，特别在欧美白人中。并已知，紫外线引起DNA与蛋白质之间的交联。戴乾圜教授的双区理论认为致癌剂活化后引起的DNA互补碱基对间的交联，是致癌作用的关键步骤，并预言：紫外光、电离辐射的物理致癌因子是通过诱发DNA互补碱基股间交联而启动癌变的。本论文主要研究紫外光是否能引发DNA股间交联和是否由通过活性氧化物——自由基所引发。 实验通过DNA微孔滤膜碱洗脱法测得了不同紫外光照射时间与DNA交联度的关系。结果表明，在波长365nm紫外光，剂量为20～100minutes的范围内，剂量的升高使得DNA交联率增加。同时，硫酸亚铁使紫外光引发的DNA交联有不同程度的增加，而抗坏血酸使得紫外光引发的DNA交联随着的其浓度增加而减少。 对于该结果解释如下：紫外光照射诱发细胞中氧化酶产生活化，相关地引发DNA股间交联和DNA-蛋白质间交联，Fe2+发生Fenton反应而使交联率成倍地提高，自由基清除剂抗坏血酸则抑制交联，表明交联是由羟基自由基HO·所诱发。进一步拓宽了双区理论的应用范围。
张敏[9]2013年在《温石棉和石棉替代品致BEAS-2B和Met-5A细胞的损伤作用》文中指出研究背景石棉是自然界存在的纤维状物质,具有保温、隔热、绝缘和隔音等性能。石棉作为工业原料和材料己有数千年的历史,目前石棉相关制品有3000多种,主要应用于汽车、化工和电器设备等工业部门。尽管石棉在工业发展中有重要作用,但是长期接触石棉可引起肺部组织纤维化,甚至诱发支气管肺癌和间皮瘤。石棉共分两大类：温石棉(Chrysotile Fibers, CF)和角闪石类石棉,在所有的石棉中,致病能力最强的是角闪石棉中的青石棉[21,但对于温石棉是否具有致癌、致纤维化的能力,还有争议。我国的政策是禁止使用角闪石石棉,安全使用温石棉。由于石棉具有致癌性,出现了人工合成的石棉替代品,称人造矿物纤维(Man-Made Mineral Fibers, MMMF),也称人造玻璃纤维(Man-Made Vitreous Fibers, MMVF),常用的品种有：玻璃棉(Glass Wool, GW)、岩棉(Rock Wool, RW)和渣棉(Slag Wool),耐火陶瓷纤维(Refractory Ceramic Fiber, RCF)等。然而有研究表明,石棉替代品同样具有生物活性和致病的可能性,其致病机理和分子机制目前尚在研究之中。温石棉及替代品的体外实验可以提供对人体的生物危害及其分子机制等信息。无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子-1(apurinic/apyrimidimic endonuclase/redoxfactor-1, APE/Ref-1)是一种具有DNA修复、氧化还原以及调节转录因子活性的多功能蛋白；多聚腺苷二磷酸核糖基聚合酶-1(poly(ADP-ribose)polymerase-1, PARP-1)是DNA损伤感应及监测分子,其参与许多重要的生命活动如凋亡、转录、DNA修复、细胞死亡等。本项研究通过细胞毒性试验、形态学观察和分子生物学等实验方法,研究RCF1、 GW1、RW1和CF致人支气管上皮细胞(Human Bronchial Epithelial Cells, BEAS-2B)和人胸膜间皮细胞(Human Pleural Mesothelial Cells, Met-5A)损伤的作用,为探寻纤维诱发细胞病变的机理提供依据。本课题应用RNA干扰技术建立PARP-1和APE/Ref-1基因缺陷细胞株,为阐明RCF1、GW1、RW1和CF引起细胞毒性的分子机理提供细胞工具。研究目的评估RCF1、GW1、RW1和CF对BEAS-2B和Met-5A细胞的细胞毒作用。评估APE/Ref-1的PARP-1在受试纤维刺激BEAS-2B和Met-5A细胞中的作用。研究方法1.体外培养Met-5A和BEAS-2B细胞,用RCF1、GW1、RW1和CF刺激细胞不同时间后,采用MTT法测定细胞活力的大小,彗星试验检测细胞DNA损伤程度和DNA损伤修复能力,流式细胞仪测细胞的凋亡率,荧光探针DHR123和DCFH-DA测细胞内(Reactive Oxygen Species, ROS)水平,扫描电子显微镜观察细胞的形态学变化,用NAC预处理细胞2h再用受试纤维刺激细胞24h,观察纤维对细胞DNA损伤、凋亡的影响。2.20μg/cm2纤维刺激细胞后,用RT-PCR和Western Blot检测caspase-3、caspase-9、 APE/Ref-1和PARP-1的mRNA及蛋白表达水平。3.利用RNA干扰技术构建PARP-1缺陷和APE/Ref-1缺陷的Met-5A和BEAS-2B细胞系。4.沉默APE/Ref-1和PARP-1后,观察纤维对基因缺陷细胞的凋亡和DNA损伤的影响。结果1. BEAS-2B和Met-5A细胞分别暴露于浓度为5至200μg/cm2的RCF1、GW1、RW1和CF纤维24h、48h和72h后发现,在低剂量(5μg/cm2)时有刺激细胞增殖的现象,在高剂量(20、40、100和200μg/cm2)时,细胞活力下降有明显的剂量和时间反应关系。2.扫描电镜观察发现,暴露于20μg/cm2纤维的细胞出现微绒毛损失、吞噬等现象。3.细胞暴露于0～20μg/cm2纤维4h、24h和48h后,DNA损伤表现为时间依赖性和剂量依赖性增加(P<0.05)。去除纤维刺激3小时后,细胞的DNA损伤可修复。NAC对细胞DNA损伤有拮抗作用。4.分别用RCF1、RW1、GW1和CF刺激细胞后,发现细胞凋亡率增高,而GW1刺激细胞凋亡率小于其它纤维。RCF1、GW1、RW1和CF刺激细胞产生ROS的荧强度明显大于空白组。NAC对细胞凋亡和ROS产生有抑制作用。5.分别用RCF1、GW1、RW1和CF刺激BEAS-2B和Met-5A细胞后,发现caspase-3和caspase-9的mRNA和蛋白水平随着时间的增加而增加。APE/Ref-1和PARP-1的mRNA和蛋白水平随着时间的增加先增高而后下降。6.本研究利用RNAi技术分别构建了Met-5A和BEAS-2B细胞的PARP-1基因缺陷细胞株和APE/Ref-1基因缺陷细胞株,基因缺陷细胞株与正常细胞株相比,mRNA表达水平下降了70～80%,蛋白质表达水平下降了80%以上,沉默效果显着且稳定性好。7.分别用受试纤维刺激基因缺陷细胞和正常细胞,基因缺陷细胞的DNA损伤和细胞凋亡蛋白表达高于正常细胞。结论：1. RCF1、GW1、RW1和CF可诱导BEAS-2B和Met-5A细胞DNA损伤和细胞凋亡,ROS在其中起至关重要作用。2. Caspase-3和caspases-9参与RCF1、GW1、RW1和CF诱导BEAS-2B和Met-5A细胞的凋亡过程。3. PARP-1和APE/Ref-1缺陷可加重RCF1、GW1、RW1和CF对Met-5A和BEAS-2B细胞的DNA损伤程度和细胞凋亡蛋白表达。PARP-1和APE/Ref-1在RCF1、GW1、RW1和CF引起的细胞损伤中有重要作用。4.本研究用慢病毒介导的RNAi技术成功构建了PARP-1和APE/Ref-1基因缺陷细胞株,沉默效果显着且稳定性好,为后续基因功能研究提供了有效的工具细胞。
姜琪[10]2011年在《我国不同产地温石棉及代用纤维对中国仓鼠肺细胞p73和p53基因表达的影响》文中研究说明目的：通过中国四大产区(青海芒崖、四川新康、甘肃阿克塞、陕南)温石棉及四种代用纤维(玻璃纤维、陶瓷纤维、硅灰石、岩棉)作用于中国仓鼠肺细胞(Chinese Hamster Lung Cell,V79细胞),探讨粉尘对细胞的毒性作用以及比较温石棉及代用纤维之间的毒性差异,和p73基因和p53基因在粉尘导致的细胞损伤中的表达及两者间的相互关系。方法：选取四大产区温石棉及四种代用纤维共八种设立25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml五种浓度的粉尘悬液分别作用于V79细胞,另设空白对照组,染毒24小时后用活细胞计数试剂盒(cell counting kit-8, CCK-8)检测细胞增殖情况,比较各组细胞存活率。选择50μg/ml这一浓度作用于V79细胞24小时,每种粉尘设立叁个平行对照组,另设立一个空白对照组。瑞氏-吉姆萨(Wright-Giemsa)染色观察细胞形态；用实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测p73基因和p53基因的表达。结果：(1)瑞氏-吉姆萨染色结果：多数温石棉和代用纤维组可发现裸核、空泡以及黑褐色颗粒沉着现象。(2)细胞存活率：不同浓度的粉尘作用于V79细胞24小时后,多数以50μg/ml时细胞增殖最快,多数温石棉组的细胞出现成倍增长,且温石棉组的增殖普遍大于代用纤维组。(3)实时荧光定量PCR (real-time quatitat ive polymerase chain reaction,real-time Q-PCR)检测p73基因和p53基因。1)p73基因：阿克塞组、玻璃纤维组、岩棉组、陕南组p73与空白对照组分别比较可以得出,阿克塞组、玻璃纤维组、岩棉组、陕南组的表达量明显高于空白对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。而青海芒崖组、四川新康组、陶瓷纤维组、硅灰石组分别与空白对照组对比,差异无统计学意义(P>0.05)。其余纤维组间两两对比差异均无统计学意义(P>0.05)。2)p53基因：空白对照组与各个粉尘组及各纤维组间相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。3)p53基因与p73基因相关性检验无统计学意义(P>0.05)。结论：(1)多数温石棉组和代用纤维组出现细胞中毒现象。(2)p73基因在阿克塞组、玻璃纤维组、岩棉组和陕南组的表达明显高于空白对照组,提示这几组温石棉及代用纤维可能导致细胞恶性改变,p73基因是通过上调其表达,在导致细胞恶性改变中可能发挥癌基因的作用。阿克塞组、玻璃纤维组、岩棉组和陕南组导致癌变的可能性更大,而其他纤维组导致癌变的可能性却不明确。(3)p53在各组中的表达无明显差异,p53在粉尘所致的细胞恶性改变中的作用不明确。
参考文献：
[1]. 石棉的DNA交联研究[D]. 李迎霞. 北京工业大学. 2002
[2]. 雌激素、石棉等诱发的DNA交联——双区理论的实验验证[D]. 刘昕. 北京工业大学. 2000
[3]. 石棉借诱发DNA股间互补碱基交联而启动癌变[J]. 戴乾圜, 陈莎, 李迎霞. 科学通报. 2001
[4]. 人造矿物纤维对细胞DNA损伤作用的体外研究[J]. 王起恩, 顾志刚, 韩春华, 柳德米拉·曲路, 吴卫东. 中华劳动卫生职业病杂志. 1999
[5]. 黄曲霉素和N-亚硝基化合物借诱发DNA互补碱对交联而启动癌变[J]. 戴乾圜, 逯萍, 彭少华, 张庆荣. 自然科学进展. 2003
[6]. 二氧化硅和石棉的遗传毒性[J]. 余晨. 国外医学(卫生学分册). 2000
[7]. 彗星试验方法研究和在医药安全评价上的应用[D]. 李彦. 新疆农业大学. 2007
[8]. 紫外光的双区理论致癌机理实验验证[D]. 朱宁. 北京工业大学. 2002
[9]. 温石棉和石棉替代品致BEAS-2B和Met-5A细胞的损伤作用[D]. 张敏. 浙江大学. 2013
[10]. 我国不同产地温石棉及代用纤维对中国仓鼠肺细胞p73和p53基因表达的影响[D]. 姜琪. 泸州医学院. 2011
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