张晓晓[1]2012年在《抗汉坦病毒鼠/人嵌合抗体真核表达载体的构建及表达》文中提出汉坦病毒（Hantavirus）属于布尼亚病毒科汉坦病毒属，根据其抗原性和基因结构的不同，可分为10多个型别。Hantavirus可引起两种类型的急性传染病，一类以高热、弥漫性肺部炎症和急性呼吸衰竭为主要表现，称为汉坦病毒肺综合征（hantavirus pulmonary syndrome，HPS），另一类以出血、高热、肾功能损害为主要表现，称为肾综合征出血热（hemorrhagic fever withrenal syndrome，HFRS）。迄今为止，在我国尚未发现HPS的报道，但我国是世界上受HFRS危害最严重的国家。该病在我国具有发病人数多、流行范围广、死亡率高等特点。此外，Hantavirus还是一种潜在的生物战剂，有被恐怖分子利用的可能。而且目前临床上尚未有能特异治疗HFRS的有效药物，因而更增加了HFRS的艰巨性和长期性。用疫苗进行主动免疫和用抗体进行被动免疫治疗是当前预防和治疗病毒性疾病的重要措施。近年来国内外已研制出Hantavirus的纯化细胞培养灭活疫苗和纯化乳鼠脑灭活疫苗，但这两类疫苗在试用过程中表现出明显不足。使用具有中和活性的单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb)是在体内、外抑制或阻断病毒感染的有效的治疗方法之一。早在上世纪八十年代中期本实验室即研制出具有较高中和活性和保护性的抗Hantavirus mAb，并在国家863计划支持下研制注射用抗HFRS病毒单克隆抗体制剂，现已完成临床试验。由于鼠源性mAb对人有潜在的免疫原性，可能引起超敏反应等副作用，因此，本课题拟在此基础上对抗Hantavirus鼠源性mAb3G1进行人源化改造，应用基因重组技术，构建鼠/人嵌合抗体基因，在哺乳动物细胞中表达并筛选出稳定高效表达嵌合抗体的细胞系，纯化表达的嵌合抗体并鉴定其生物学特性，为进一步研制特异治疗HFRS的新型制剂奠定基础。1.构建抗汉坦病毒鼠/人嵌合抗体的真核表达载体以pCI-neo-M和pCI-M载体为基础，用ease2.1-cmv5分别替换pCI-neo-M和pCI-M的启动子MARs-mCMV改建真核表达载体，改构后的载体命名为pCI-neo-ease2.1-cmv5-M和pCI-ease2.1-cmv5-M；获得抗HTNV mAb3G1的鼠/人嵌合轻链、重链基因，并分别将其克隆到pCI-neo-ease2.1-cmv5-M和pCI-ease2.1-cmv5-M真核表达载体中，经双酶切鉴定后分别获得阳性重组质粒pCI-neo-ease2.1-cmv5-vh-M和pCI-ease2.1-cmv5-vl-M，测序后证实载体构建成功。2.稳定表达抗汉坦病毒鼠/人嵌合抗体CHO-K1细胞系的建立与筛选将上述含抗Hantavirus mAb3G1鼠/人嵌合重链和轻链基因表达载体的JM-109扩大培养后提取质粒，用紫外分光光度计定量,用脂质体法按LipofectamineTM2000说明书转染野生型CHO-K1细胞，在氨甲喋呤(MTX)和G418双重筛选压力下筛选稳定、高效表达抗Hantavirus嵌合抗体的细胞株，ELISA方法测定重组蛋白的表达。3.抗汉坦病毒鼠/人嵌合抗体的表达、鉴定及生物学活性检测扩大培养上述筛选出的稳定、高效表达嵌合抗体的细胞系，收集其培养上清，超滤浓缩、除盐后，用Protein A HP Spin Trap纯化试剂盒纯化。纯化后进行SDS-PAGE和Western blot检测，结果表明成功表达了抗Hantavirus鼠/人嵌合抗体。通过体外中和实验检测其中和活性，结果显示该嵌合抗体具有良好的中和活性，其中和活性与亲本抗体的中和活性相近。本实验为抗Hantavirus鼠/人嵌合抗体的进一步研究和临床应用奠定了基础。
白文涛[2]2001年在《抗汉坦病毒单克隆抗体1A8鼠/人嵌合Fab抗体表达载体的构建及鉴定》文中进行了进一步梳理肾综合征出血热（HFRS）是由汉坦病毒引起的一种危害极大的急性病毒性传染病，在我国的危害尤为严重，目前尚无特异有效的治疗方法。鼠源性单克隆抗体（mAb）在病毒性疾病的治疗上已有应用，但由于用杂交瘤技术制备人源性mAb仍存在很多困难，而鼠源性mAb存在人抗鼠抗体（HAMA）应答，可能会影响其治疗效果，甚至引起变态反应，危及生命。因此，用基因工程方法改造鼠源性mAb，对其进行“人源化”改造，减少鼠源性mAb的免疫原性，对进一步利用鼠源性mAb治疗疾病具有重要意义。 本研究在本室已克隆抗汉坦病毒mAb 1A8单链抗体（ScFv）的基础上，构建了鼠/人嵌合Fab表达载体，并鉴定了表达产物的免疫学活性。首先用PCR扩增人重链恒定区1（CH1）基因和轻链恒定区（C_k）基因，并用引物点突变法使人CH1基因中BstEⅡ酶切位点发生突变，除去BstEⅡ酶切位点，以便于克隆。然后分别将mAb 1A8 V_H基因和突变的人CH1基因连接、V_L基因和人C_k基因连接，分别构建了鼠/人嵌合重链Fd基因和轻 第四军医大学硕土学位论文链基因，并克隆入pComb3，构建了鼠／人嵌合Fab噬菌体抗体表达载体IASFab／pComb3。用 Spe和 Nhe切除编码噬菌体衣壳蛋白 gill基因后使载体自连，获得了可溶性 Fab表达载体 slASFab／pComb3。酶切鉴定及序列分析结果均表明，人 CHI基因中 BslE 11酶切位点已被突变，并与 Ilb％bIAS V。基因连接为鼠／人嵌合Fd基因；IA8 V。也与人C。基因正确连接，构成鼠／人嵌合轻链基因，表达载体均构建正确。 将上述表达载体分别进行表达及检测。ELISA间接夹心法的结果表明，在噬菌体表面表达的Fab和可溶性表达的Fab均可与汉坦病毒核蛋白 （NP）抗原结合；可溶性Fab表达产物主要存在于细菌培养上清和细菌裂解液中。同时 ELISA阻断试验结果也表明鼠源性 mAb AS可明显阻断噬菌体表面表达的Fab与NP抗原的结合，表明鼠／人嵌合Fab抗体与IllilbIAS识别相同的抗原结合位点。Western blot结果表明可溶性 Fab表达产物可与NP抗原特异结合。用ELISA阻断法检测可溶性Fab抗体的表观亲和力，约为 5 XIO“molo 本研究获得了鼠／人嵌合Fab抗体基因，并分别表达了可与汉坦病毒NP抗原特异结合的噬菌体Fab抗体及可溶性Fab抗体。在克隆过程中所构建的多种载体可用于其它Fab抗体的构建及表达。
李卓[3]2017年在《人源性抗汉滩病毒中和活性抗体的制备和鉴定》文中指出肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)是一种以发热、出血、急性肾功能损害为特征的急性传染病,通常由汉坦病毒(Hantaviruses,HTV)感染引起,在世界范围内广泛分布,中国是世界上发病人数最多的国家,而陕西省为我国HFRS的高发地区之一。长期以来,我国通过对重点疫区人群进行疫苗接种预防HFRS的发生,因此需要对HFRS疫苗的免疫效果进行定期评价。抗汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)抗体特别是中和抗体(neutralizing antibody,NAb)可直接与HTNV结合,参与机体对病毒的免疫清除。鼠源性抗体因为异源性反应很难应用于人体,目前很少有人源性抗体用于HFRS的紧急预防和治疗,因此,制备具有潜在中和活性的人源性抗体十分必要。本研究在评价了HFRS抗体检测试剂盒和疫苗接种者免疫接种效果的基础上,建立了疫苗接种者的B淋巴母细胞系(Blymphoblastoid cell lines,BLCLs)。将NAb阳性的疫苗接种者和HFRS患者的BLCLs抗体基因重组到噬菌体载体上,建立噬菌体Fab抗体库,筛选HTNV特异性抗体和中和活性抗体,经表达、纯化和鉴定获得了具有潜在中和活性的人源性抗HTNV Fab抗体,为HFRS的紧急预防、治疗以及疾病的诊断提供新的途径。为此,我们进行了以下实验:第一部分:HFRS疫苗接种者和患者BLCLs的建立、筛选和克隆化首先,基于HTNV抗体检测的需要,评价了国产与进口HFRS IgG抗体ELISA试剂盒的性能,结果表明国产试剂盒敏感性高,进口试剂盒特异性强。然后,采集疫苗接种者的血液标本,应用EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)转化技术建立了70株疫苗接种者BLCLs,检测了疫苗接种者的血清标本和BLCLs培养上清中HTNV特异性抗体,评价了咸阳地区HFRS疫苗接种的免疫效果。疫苗接种人群血清中HTNV核蛋白(nucleocapsid protein,NP)特异的IgM、IgG抗体以及HTNV NAb的水平和阳性率明显升高,叁者具有较好的相关性;最强烈的抗体分泌反应发生在接种疫苗后3个月,与血清检测结果一致,表明针对HFRS的疫苗免疫接种计划在中国西北地区人群中可以有效地诱导体液免疫应答。最后,明确了NAb阳性的BLCLs(占44%)并对BLCLs进行了克隆化,NAb阳性的35株BLCLs(HFRS疫苗接种者与科室保存的患者BLCLs)为构建具有潜在中和活性的噬菌体抗体库提供基因资源;BLCLs的成功克隆化有望为单克隆抗体制备开辟新的途径。第二部分:抗HTNV噬菌体Fab抗体库的构建和筛选提取NAb阳性BLCLs的mRNA并合成cDNA,应用噬菌体展示技术建立了库容量为1.3×10~9的抗HTNV噬菌体Fab抗体库,Fab的阳性插入率为95%,抗体序列正确率为68%。以HTNV全抗原为靶分子,用固相筛选法经过4轮“吸附-洗脱-扩增”,对洗脱的噬菌体滴度进行测定,结果显示回收率明显增加。筛选前随机克隆测序正确率为68%,第4轮筛选后随机克隆测序正确率为81%;筛选前多样性为95%,第4轮筛选后多样性为31%。经Phage-ELISA检测,最终从第3、4轮筛选的50个克隆中选出了15个序列正确的特异性强的HTNV噬菌体Fab抗体。通过此部分实验,我们成功构建了抗HTNV噬菌体Fab抗体库并对其进行了筛选。第叁部分:人源性抗HTNV Fab抗体的可溶性表达和中和活性检测将第二部分筛选获得的特异性HTNV Fab噬菌体转染Ecoli.HB2151,诱导表达制备可溶性HTNV Fab抗体,并应用亲和层析法进行纯化。表达及纯化产物经还原电泳检测分析,发现在约25kDa处出现明显目的条带,与Fab的预期大小相符。间接ELISA表明这些可溶性HTNV Fab抗体均能与HTNV特异性结合。病毒中和实验结果显示3个Fab抗体具有中和活性。测序分析了15个Fab抗体轻链和重链可变区氨基酸序列,结果表明这些Fab抗体分属于6个抗体家族,大多数轻链和重链属于V3和V4家族,以IGKV3-20*01、IGHV4-59*01家族为主。同源性分析显示,3个具有中和活性的Fab抗体基因序列来自人胚系基因,未发现与其完全相同的抗体基因序列。第四部分:HTNV感染巨噬样人急性单核细胞白血病细胞系(differentiated THP-1,dTHP-1)诱导内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ER stress)反应HTV感染机体后可诱导强烈的免疫应答,但其致病机制尚未明确,我们从ER stress的角度,初步观测了HTNV感染对dTHP-1内质网应激的影响。检测结果显示HTNV感染dTHP-1细胞后,其内质网应激标志性分子葡萄糖调节蛋白(78kDa glucose-regulated protein,GRP78)的mRNA和蛋白水平、X盒结合蛋白1(X box-binding protein 1,XBP-1)的mRNA水平均明显升高,表明HTNV感染可以诱导dTHP-1启动ER Stress。而在病毒感染后2h,C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)的mRNA水平在病毒感染组与未感染组无明显差异;凋亡检测结果显示,HTNV感染dTHP-1 12h后细胞未发生明显凋亡;这些结果提示HTNV诱导的ER Stress在病毒感染早期(12h内)并未直接导致dTHP-1凋亡。
周伟[4]2008年在《抗汉滩病毒中和性鼠/人嵌合抗体在拟南芥中的表达及其免疫学特性的初步研究》文中进行了进一步梳理汉滩病毒(HTNV)主要引起肾综合征出血热(HFRS),迄今尚无特异、有效的治疗药物。抗HTNV鼠源性单克隆抗体(mAb),虽然有较好的抗病毒作用,但应用于人体可能产生抗鼠抗体。而人源性mAb制备困难、产量低,目前也难以应用。基因工程抗体在原核系统中表达虽然产量较高,但由于其受加工修饰功能的限制,会影响表达产物的生物学特性;而真核表达又存在表达量低的难题。运用合适的植物表达系统表达抗体不仅表达产量高,而且由于植物表达系统有良好的加工修饰功能,其表达产物能保持良好的生物学特性。本研究用基因工程技术构建了鼠/人嵌合抗体基因,并将其导入拟南芥内,尝试在植物体内表达,主要方法和结果如下:1.将抗HTNV鼠源性mAb 3G1的可变区基因及人抗体恒定区基因进行拼接,构建了植物嵌合表达载体3G1MH-pCAMBIA2301,转化入根瘤农杆菌中,利用根瘤农杆菌介导的抽真空转基因技术转化野生型拟南芥,获得转基因植株。提取T0代转基因植株基因组DNA,应用针对轻、重链序列的特异性引物进行PCR检测,筛选出整合有目的基因的阳性植株。以轻、重链探针对RNA进行Northern Blot检测,检测出完整的轻、重链RNA,证明转基因植株构建成功。2.针对抗体轻、重链核苷酸序列设计特异性引物,对转基因植物的cDNA进行实时荧光定量PCR检测,结果显示不同转基因植株间的RNA转录量存在差异,挑选出轻、重链转录量较高的5株表达株系,通过以抗人Kappa链及抗人Fc段抗体分别做Western Blot检测,结果显示有目的蛋白的表达,但表达的蛋白分子量小于预期大小,实验提示抗体的Fc段可能存在一定程度的降解。3.以HTNV感染细胞为抗原,植物蛋白提取物为待测抗体,羊抗人Kappa链抗体为一抗,FITC标记的兔抗羊抗体为二抗做间接免疫荧光检测,结果证明目的蛋白具有与HTNV抗原的结合活性。本研究对基因工程抗体在植物体系中的表达进行了有益的探索,提供了有用的理论和实验依据。
参考文献：
[1]. 抗汉坦病毒鼠/人嵌合抗体真核表达载体的构建及表达[D]. 张晓晓. 第四军医大学. 2012
[2]. 抗汉坦病毒单克隆抗体1A8鼠/人嵌合Fab抗体表达载体的构建及鉴定[D]. 白文涛. 第四军医大学. 2001
[3]. 人源性抗汉滩病毒中和活性抗体的制备和鉴定[D]. 李卓. 第四军医大学. 2017
[4]. 抗汉滩病毒中和性鼠/人嵌合抗体在拟南芥中的表达及其免疫学特性的初步研究[D]. 周伟. 第四军医大学. 2008
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