赖红星 马文柱 夏玉平 肖拥军 刘厚明 王小龙 陈轩裴
珠海冀百康生物科技有限公司
摘要：本研究用7.5L发酵罐对胰蛋白酶毕赤酵母基因工程菌TRYP1的发酵培养基进行优化，结果表明最佳的发酵培养基为：40g/L甘油、30g/L酵母浸粉、60g/L酵母蛋白胨、16g/L硫酸铵、10g/L七水合硫酸镁、10g/L氯化钾、0.3g/L二水合氯化钙、4mL/L微量元素PTM1。并使用该发酵培养基进行了发酵工艺研究，结果表明最佳的发酵工艺为：培养阶段温度30℃，pH5.0，DO维持在20%~60%之间；诱导发酵液浓度（OD600）为200；诱导阶段温度25℃，pH4.0，DO维持在5%~50%之间。在此基础上进行了20L罐的发酵中试，重组胰蛋白酶的产量达到7851U/ml，实现了高密度发酵，为胰蛋白酶的大规模工业化生产奠定了基矗
关键词：重组毕赤酵母生产胰蛋白酶的中试发酵条件研究
胰蛋白酶（EC 3.4.4.4）是一种丝氨酸蛋白酶，能选择地水解蛋白质中赖氨酸或精氨酸羧基末端的肽键，广泛用于动物细胞培养、生物制药、化工、洗涤等领域。 重组胰蛋白酶不含动物病毒、致病因子等风险物质，无糜蛋白酶、羧肽酶A等杂酶，特别适用于生物药物的生产。
目前胰蛋白酶已在大肠杆菌中实现了表达重组【1-3】，但是胰蛋白酶原大多以包涵体形式存在，需要破碎细胞、提取包涵体、蛋白变性、复性、激活等步骤，工艺十分复杂，部分通过改变信号肽或增加融合伴侣的方式可以提高可溶性表达的比例，但后续纯化工艺仍然比较复杂，不利于大规模生产。
用毕赤酵母表达重组胰蛋白酶【4】时，胰蛋白酶原以可溶形式分泌到细胞外培养基中，无需破碎、变性、复性等步骤，纯化工艺简单。但是在工业发酵过程中，胰蛋白酶原容易自我激活，成为活化胰蛋白酶，对宿主细胞产生毒害作用，从而导致目的蛋白降解，宿主细胞死亡，导致胰蛋白酶产量过低。
本研究用7.5L发酵罐对胰蛋白酶毕赤酵母基因工程菌TRYP1的发酵培养基进行优化，并对关键的发酵参数进行摸索，有效降低了胰蛋白酶对毕赤酵母细胞的毒害作用，延长了表达时间，实现了重组胰蛋白酶的高密度发酵，为大规模工业化生产奠定了基矗
1 材料与方法
1.1材料
1.1 .1菌株
胰蛋白酶毕赤酵母基因工程菌TRYP1（Mut+His+），由珠海冀百康生物科技有限公司构建与保存。
1.1.2 培养基
摇瓶培养基BMGY：1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%YNB，4×10-5%生物素，0.1mol/L pH6.0磷酸缓冲液，2%甘油。
摇瓶培养基BMMY：1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%YNB，4×10-5%生物素，0.1mol/L pH6.0磷酸缓冲液，0.5%甲醇。
发酵培养基BSM：40g/L甘油，0.93g/L 硫酸钙，14.9 g/L七水硫酸镁 ，18.2g/L硫酸钾，26.7ml/L磷酸（85%），4.13g/L KOH ，4ml/L微量元素PTM1。
发酵培养基ONM：40g/L甘油、20g/L酵母浸粉、40g/L酵母蛋白胨、16g/L硫酸铵、10g/L七水合硫酸镁、10g/L氯化钾、0.3g/L二水合氯化钙、4mL/L微量元素PTM1。
微量元素PTM1：6g/L CuSO4·5H2O ，0.02g/L H3B03，20 g/L ZnCl2 ，65g/L FeSO4·7H2O ，0.92g/L CoCl2· 6H2O ，3g/L MnSO4·H2O，0.2g/L Na2Mo4·2H2O ，0.2g/L D-生物素，0.08g/L NaI，5mL/L浓硫酸。
1.2 方法
1.2.1 基础发酵培养基的确定
1.2.1.1发酵培养基BSM对工程菌产酶的影响
使用Invitrogen公司《Pichia Fermentation Process Guidelines》中提供的BSM培养基进行高密度发酵。将种子液接种至装有3L BSM培养基的7.5L发酵罐中，在培养阶段控制温度为30℃，pH值为5.0，调节搅拌转速、通气量和甘油补料速率控制DO在20~60%之间，当发酵液浓度（OD600）为150时，流加甲醇进行诱导，取发酵上清液检测胰蛋白酶活性。
1.2.1.2 有机氮源培养基对工程菌产酶的影响
使用本公司的发酵培养基ONM进行高密度发酵。将种子液接种至装有3L ONM培养基的7.5L发酵罐中，在培养阶段控制温度为30℃，pH值为5.0，调节搅拌转速、通气量和甘油补料速率控制DO在20~60%之间，当发酵液浓度（OD600）为150时，流加甲醇进行诱导，取发酵上清液检测胰蛋白酶活性。
1.2.2 发酵培养基的优化
1.2.2.1 有机氮源对工程菌产酶的影响
调整培养基ONM中有机氮源的含量，配制培养基A、B和C，其中培养基A含有20g/L酵母浸粉、40g/L酵母蛋白胨，培养基B含有30g/L酵母浸粉、60g/L酵母蛋白胨，培养基C含有40g/L酵母浸粉、80g/L酵母蛋白胨。按照1.2.1.2所述方法进行发酵，并取样检测。
1.2.2.2 补料培养基对工程菌产酶的影响
配制含有不同有机氮源的补料培养基，其中补料A含有10g/L酵母浸粉、20g/L酵母蛋白胨，补料B含有50g/L酵母浸粉、100g/L酵母蛋白胨，补料C含有60g/L酵母浸粉、120g/L酵母蛋白胨，补料D含有50g/L酵母浸粉、75g/L酵母蛋白胨，补料E含有50g/L酵母浸粉、150g/L酵母蛋白胨。 将种子液接种至装有3L ONM培养基的7.5L发酵罐中，在培养阶段控制温度为30℃，pH值为5.0，调节搅拌转速、通气量和甘油补料速率控制DO在20~60%之间，在接种8h时流加补料培养基，当发酵液浓度（OD600）为150时，流加甲醇进行诱导，取发酵上清液检测胰蛋白酶活性。
1.2.3 高密度发酵工艺条件的研究
1.2.3.1 诱导pH对工程菌产酶的影响
将种子液接种至装有3L ONM培养基的7.5L发酵罐中，在培养阶段控制温度为30℃，pH值为5.0，调节搅拌转速、通气量和甘油补料速率控制DO在20~60%之间，在接种8h时流加补料培养基，当发酵液浓度（OD600）为150时，流加甲醇进行诱导，控制温度为28℃，pH值分别为3.5、4.0、4.5和5.0，调节搅拌转速、通气量和甲醇补料速率控制DO在5~50%之间，每12h取发酵上清液检测胰蛋白酶活性。
1.2.3.2 诱导温度对工程菌产酶的影响
参考1.2.4.1，控制诱导温度为22℃、25℃和28℃ ，每12h取发酵上清液检测胰蛋白酶活性。
1.2.3.3诱导浓度对工程菌产酶的影响
参考1.2.4.1，分别于发酵液浓度为150、180、200和220时开始诱导 ，每12h取发酵上清液检测胰蛋白酶活性。
1.2.4 中试发酵工艺条件的放大优化
将种子液接种至装有8L ONM培养基的7.5L发酵罐中，在培养阶段控制温度为30℃，pH值为5.0，调节搅拌转速、通气量和甘油补料速率控制DO在20~60%之间，在接种8h时流加补料培养基，当发酵液浓度（OD600）为200时，流加甲醇进行诱导，控制温度为25℃，pH为4.0，调节搅拌转速、通气量和甲醇补料速率控制DO在5~50%之间，每24h取发酵上清液检测胰蛋白酶活性。
1.3 胰蛋白酶活性检测
1.3.1酶原激活
取发酵上清菌液2ml，加入等体积0.2M二水合氯化钙溶液，混匀后，调pH至8.0±0.2，加入终浓度为10U/ml的胰蛋白酶，放置于37℃恒温水浴中激活16-18h。
1.3.2底物溶液配制
取底物原液10 ml，用Tris-HCl缓冲液（0.1mol/L ，pH7.6）稀释并定容至100ml容量瓶中。以水为空白，测定该溶液在253nm处的吸光度，用上述Tris-HCl缓冲液或底物原液调节，底物溶液吸光度应在0.575-0.585之间，置25℃恒温水浴锅中备用。
1.3.3测定
取底物溶液（恒温于25℃±0.5℃）3.0ml，加0.001mol/L盐酸溶液200μl，混匀，作为空白归零。另取供试品溶液200μl，加底物溶液（恒温于25℃±0.5℃）3.0ml，立即计时并摇匀，读取其在253nm的吸光度，比色池内的温度应保持在25±0.5℃，每隔30秒读取一次吸光度，吸光度的变化值ΔA253应恒定在0.015~0.018之间。测试时间5分钟。
1.3.4计算
以吸光度为纵坐标，时间为横坐标，作图；在上述吸光度对时间的关系图中，呈直线部分的时间不少于3分钟，否则应重新测定。取呈直线部分的吸光度。按下式计算：
式中：P为每1mg或1ml供试品中胰蛋白酶的量(单位)。
A1直线上终止的吸光度，A2为直线上开始的吸光度；
T为A1至A2读数的时间（min），W为测定液中含供试品的量(mg)或（ml）。
2 结果与分析
2.1基础发酵培养基的确定
使用BSM培养基进行发酵，当培养至约29h时DO（溶氧）波动逐渐变小，并且随着发酵进行DO整体上升，甲醇的利用量逐渐减少，在光学显微镜下观察到细胞碎片，这说明工程菌收到毒害，部分细胞死亡（图3）。取发酵上清液，用SDS-PAGE进行分析，发现诱导32h时重组胰蛋白酶原出现降解，且随着诱导时间增加降解现象越严重，当诱导88h时约90%的重组胰蛋白酶原出现了降解（图4）。发酵上清激活时出现白色沉淀，推测原因为培养基中含有磷酸盐，与氯化钙发生反应生成沉淀。最终检测诱导88h的上清液中重组猪胰蛋白酶表达量为2758U/mL。
注：条带1为蛋白质标准品，从上到下分子量依次为：94.0KD,66.2KD,45.0KD,33.0KD,26.0KD,20.0KD,14.4KD， 条带2-条带5分别为诱导32h、60h和88h的上清液。
用ONM培养基进行发酵，当培养至约8h时DO波动也逐渐变小，但上清液激活时没有出现白色沉淀，最终检测诱导88h的上清液中重组猪胰蛋白酶表达量为3215U/mL。将发酵上清液进行SDS-PAGE分析，发现重组胰蛋白酶原并未降解。
由此可见，虽然使用ONM培养基发酵比使用BSM培养基更早出现DO波动变小，但二者原因不同。使用BSM培养基发酵时DO波动变小，是因为活化的胰蛋白酶对工程菌细胞产生了毒害作用；而使用ONM培养基发酵时DO波动变小，其原因在于ONM培养基中缺少了磷元素，影响了工程菌细胞的生长和代谢。因此，ONM培养基更适合毕赤酵母工程菌TRYP1的发酵，后续研究也将在ONM基础培养基上进行优化。
2.2发酵培养基的优化
2.2.1有机氮源对工程菌产酶的影响
使用含有不同浓度酵母浸粉、酵母蛋白胨的ONM培养基进行发酵，结果表明ONM培养基中有机氮源含量过高或过低都不利于重组胰蛋白酶的表达，当培养基中酵母浸粉为30g/L、酵母蛋白胨为60g/L时，重组猪胰蛋白酶表达量最高（图5）。
2.4.2 诱导温度对工程菌产酶的影响
本研究用摇瓶发酵考察了温度为20℃、25℃和30 ℃时对工程菌产酶的影响，发现最佳诱导温度为25℃。根据此结果并考虑到能耗因素，选择22℃、25℃和28℃三种诱导温度，考察对工程菌产酶的影响，结果表明依然是25℃最有利于重组胰蛋白酶的表达，见图9。
3 讨论
本研究选择常用的BSM培养基，在7.5L罐上进行发酵研究，但是培养至约29h，胰蛋白酶原出现自我激活，活化的胰蛋白酶对工程菌细胞产生了毒害作用，并且由于酶活检测过程中培养基中的磷酸盐与氯化钙反应产生白色沉淀，导致发酵产量非常低，仅为2758U/mL。为了克服BSM培养基的缺点，我们开发了新的ONM培养基，该培养基无磷酸盐，在酶活检测过程中不会产生白色沉淀，且发酵表达量高于BSM培养基。然而，由于ONM培养基缺乏毕赤酵母生长所必须的磷元素，导致更早出现细胞生长被抑制的现象（DO波动减小）。为了消除磷元素缺乏对毕赤酵母的影响，我们向发酵系统中流加含有有机氮源的补料培养基，令人惊喜的发现细胞生长恢复正常，并且重组胰蛋白酶的产量从3215U/mL提高到5640U/ml，提高1.75倍。研究表明，有机氮源不仅可以提供毕赤酵母生长所需的磷元素等营养物质，还对胰蛋白酶原的结构稳定性起到一定程度的保护作用。
在获得最优的发酵培养基后，本研究还对影响工程菌产酶的pH、温度、诱导浓度等参数进行了优化，发现最佳诱导温度为25℃，最佳诱导浓度为200，最佳诱导pH为4.0。7.5L罐发酵的最佳pH和摇瓶发酵的最佳pH不同，可能是因为毕赤酵母发酵过程中产生有机酸，使得整个摇瓶发酵液体系的pH下降，从初始pH5.0逐渐下降，故pH4.0最有利于酶的表达。
我们还使用20L罐进行了发酵工艺验证，表明该工艺条件适合胰蛋白酶毕赤酵母基因工程菌TRYP1的高密度发酵，重组胰蛋白酶的产量达到7851U/ml，比摇瓶发酵提高了20倍，比BSM培养基提高了2.85倍，为胰蛋白酶的大规模工业化生产奠定了基矗
参考文献
1. Selective alteration of substrate specificity by replacement of aspartic acid-189 with lysine in the binding pocket of trypsin. Graf L, Craik CS, Patthy A, Roczniak S, Fletterick RJ, Rutter WJ.Biochemistry. 1987 May 5;26(9):2616-23.
2.牛胰蛋白酶的生产工艺.张维CN201610005823.2.
3.一种高稳定性的重组胰蛋白酶的生产及应用.冯矗;赵致.CN200910055493.8.
4.生产重组胰蛋白酶的方法.R·米勒;S·格莱泽;F·盖佩尔;J-P·塔尔霍费尔;B·雷克塞尔;C·施奈德;M·拉特卡;S·伦宁;H·埃克施泰因;C·吉塞尔.CN02805619.1.
论文作者:赖红星 马文柱 夏玉平 肖拥军 刘厚明 王小龙 陈轩裴
论文发表刊物:《中国西部科技》2019年第22期
论文发表时间:2019/11/27
标签：培养基论文; 胰蛋白酶论文; 酵母论文; 诱导论文; 蛋白胨论文; 光度论文; 温度论文; 《中国西部科技》2019年第22期论文;