张德勇[1]2005年在《基于IBV重组表达蛋白的抗体检测技术及基因免疫研究》文中研究说明以近年从浙江、四川等地分离到的鸡传染性支气管炎病毒肾致病型毒株以及传统的IBV经典毒株为材料,设计特异性引物,分别克隆了IBV的S1基因和N基因并测定序列,用DNAstar等软件进行分析。S1基因和N基因的序列比较显示,国内分离到的部分毒株间同源性最高(82.9%到98.6%),但它们与传统的毒株相比同源性较低。在分离株的S1基因和N基因序列中均发现了大量散在的点突变,而且在SC021202株和J株的Sl基因中发现一段长21nt的插入片段,在以前的毒株中不存在。这些特征显示国内近年流行的一些IBV毒株是新的变异株,有着相对独立的起源和进化方向。 在大肠杆菌pBAD/his系统中表达了IBV的N蛋白,表达量约占菌体总蛋白的20%。同时在大肠杆菌pGEX表达系统中高效表达了IBV S蛋白的S1F表位片段和SlD表位片段。大肠杆菌中表达的N蛋白和S1蛋白均可与IBV多抗血清发生特异性反应,并通过Ni柱纯化出了表达的外源蛋白。此外,还将IBV S1基因构建到酵母表达载体pPICZ α B中,电转化酵母X33菌株,得到四个阳性克隆,经甲醇诱导可分泌型其中叁株可表达IBV的S1糖蛋白,表达的蛋白可与多抗血清发生特异性反应。 以纯化到的N蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法(N-ELISA),可以检测出鸡血清中的抗IBV N蛋白的特异性抗体。对N-ELISA的反应条件进行了优化,包被液以PH 8.5的Tris-HCI包被效果最佳,抗原包被量确定为0.19 μg/孔,一抗(待检血清)的稀释度确定为1:100,酶标二抗HtRP标记的兔抗鸡IgG)确定为l:800。用N.EL,ISA检测IBV及其他病原的抗血清,结果证实N-ELISA可检测出针对各IBV毒株的抗体而其它病原的抗血清均检测为阴性,说明N-ELISA具有良好的特异性,此外,用N-ELISA与IDEXX公司的ELISA试剂盒同时检测临床样本95份,两种方法检出的总阳性率符合率达到95.7%。以表达的SlF为包被抗原,通过类似的方法建立了间接ELISA方法(SlF-ELISA),可以检测出鸡血清中抗S蛋白的特异性抗体。抗原包被浓度确定为0.6 μg/孔,一抗和酶标二抗的稀释度分别为l:50和l:800。SlF-ELISA可以检测针对不同毒株的IBV的抗血清而其他病原体的抗血清均较检测为阴性说明SlF-ELISA具有理想的特异性。用SlF-ELISA检测来自临床的免疫鸡血清样本34份,与IDEXX试剂盒的结果比较,其阳性率均为100%。 以纯化的N蛋白、S1D蛋白、S1F蛋白分别免疫BALB/e小鼠,通过杂交瘤技术制备除了8株抗N蛋白的单克隆抗体、3株抗S1D蛋白的单克隆抗体、6株抗S1F的单克隆抗体。抗体亚类鉴定显示17株单抗均为IgG1,K链。通过western
丁红梅[2]2001年在《禽传染性支气管炎病毒新的变异株核衣壳基因的克隆及在大肠杆菌中的表达》文中认为本研究用Tizol试剂直接从尿囊液中抽提病毒核酸，参考已报道的IBV－ Beaudette核衣壳基因，自行设计—对引物，以IBV—N毒株（肾型）、ZJ971 毒株（腺胃型）和一个参考疫苗毒株H52为模板，用RT－PCR扩增它们的核衣 壳基因，将扩增得到的cDNA克隆入pBluescript SK载体中。用Lasefgene analysiS软件分析它们的核苷酸和推导的氨基酸序列。在此基础上，把ZJ971 毒株核衣壳基因克隆到pBV220表达载体，利用大肠杆菌进行原核表达，并 用Western－blotting检测。结果显示： ZJ971毒株、N毒株、H52毒株的核衣壳基因ORF全长都为1230个核苷 酸，均编码一条409个氨基酸组成的多肽。 腺胃病变型IBV－ZJ971毒株与其他各血清型IBV的核昔酸同源性在 87．0％—98．6％之间，氨基酸同源性在91．0％一98．1％之间。171位氨基酸突 变导致这一区域的亲水性大为增强，但283位氨基酸突变导致邻近的282位 亲水性下降，使其最大疏水峰由 197位移到282位。系统进化分析表明 ZJ971 毒株与DI 466、Cu／TZ毒株的亲缘关系较近，它们可能有共同的祖先。 肾病变型IBV-N毒株与其他各血清型IBV的核苷酸同源性均不高（86．6％ —87．4％），氨基酸同源性在90．5－91．7％之间。其中189-190、223、236、286、 334-336位氨基酸的突变使上述5个区域的亲水性明显下降，240、301位氨 基酸的突变使这两个区域的亲水性稍有上升，整个蛋白的平均亲水值比其 它IBV小。系统进化分析表明N毒株与其它毒株（包括肾病变型Gray）的亲 缘关系均较远，处于相对独立的一支。 综合上述结果进一步从核衣壳蛋白基因角度证实 ZJ971 毒株、N毒株 是不同于其它各型IBV的新的变异株。 Western-blotting 只在重组表达菌样品中检测出一条约45kD的特异性蛋 白条带，与预期的蛋白分子量大小一致，表明 IBV－ZJ97毒株的核衣壳蛋 白确实在大肠杆菌中获得了高效表达，表达的核衣壳蛋白具有一定的金免疫 反应性，为进一步研究和开发IBV基因工程苗奠定基础。
孙晓云[3]2016年在《鸡传染性支气管炎病毒H120型M、N基因的免疫原性研究》文中研究说明鸡传染性支气管炎(Avian infectious bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus,IBV)引起的一种鸡的急性传染性疾病,通过接触相互传染,各年龄的鸡都可发病,该病在世界范围流行十分广泛,是侵害养鸡业的最严重的传染病之一,被世界动物卫生组织(OIE)列为禽病B类传染病。由于鸡传染性支气管炎病毒(IBV)极易发生变异,经常出现新的血清型,并且不同血清型之间交叉感染现象严重,不同毒株之间基本没有交叉保护力,所以该病的免疫非常困难,鸡群内呈爆发式发生,给养禽业带来巨大的经济损失。本研究对IBV H120株基因序列进行分析,将H120株M基因和N基因构建到真核表达载体中,并对重组质粒的免疫原性进行了研究,为研制IB的DNA疫苗提供依据。1.从GenBank上下载登录号为FJ888351.1的IBV H120型的基因序列,并对其基因序列进行分析,IBV基因组编码的结构蛋白主要有3种,其中N蛋白最为保守,与病毒RNA的合成有关,并且N蛋白上有重要的抗原决定簇;而M蛋白的保守性仅次于N蛋白,可能与核衣壳蛋白结合,决定了病毒的出芽位置,在病毒复制过程中起一定作用,部分抗原决定簇也在M基因上存在。利用PrimerPremier5.0针对IBV-M和IBV-N基因分别设计一对引物,采用RT-PCR试验扩增出具有免疫保护作用的抗原基因M和N基因,通过对这两个基因的测序进行分析发现,IBV-M基因序列含有大约678个碱基,编码225个氨基酸;IBV-N基因序列含有大约1230个碱基,编码410个氨基酸。将其与GenBank上登录的其他毒株进行比较,发现其变异性小,同源率很高,其中IBV-M基因与其他毒株核苷酸序列同源性为84.7%~100%之间,相对应的氨基酸同源性为86%~100%;IBV-N基因与其他毒株核苷酸序列同源性为90.2%~100%之间,相对应的氨基酸同源性为91%~100%之间。2.将扩增出的IBV-M基因和IBV-N基因用EcoRⅠ和SalⅠ进行双酶切,亚克隆到pEGFP-C1-SCP-SEC载体上,转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,经菌落筛选和测序,鉴定出正确的阳性克隆,完成真核表达载体的构建。将重组质粒转染到Vero细胞中,进行免疫荧光试验,可以检测到IBV-M基因和IBV-N基因在细胞内表达,并具有一定的免疫原性。这为进一步研究IBV的DNA疫苗提供了理论数据。3.将构建的真核表达载体用脂质体PEI25000按照N/P=8进行包裹,制成核酸疫苗,通过腿部肌肉多点注射进行动物免疫试验,10日龄首免,21日龄加强免疫一次,二免后用IBV H120型毒株进行攻击,连续观察15天后全部扑杀,取肾脏组织进行病毒的检测,其中H120弱毒疫苗组病毒检出率为33.3%,M质粒组病毒检出率为50%,N质粒组病毒检出率为40%,单基因的病毒检出率略高于弱毒苗组,而M+N混合质粒组病毒检出率仅为20%。明显低于弱毒苗组和单基因组。本研究制备的用PEI25000包裹的DNA疫苗,对IB的防控有重要的意义。
参考文献：
[1]. 基于IBV重组表达蛋白的抗体检测技术及基因免疫研究[D]. 张德勇. 浙江大学. 2005
[2]. 禽传染性支气管炎病毒新的变异株核衣壳基因的克隆及在大肠杆菌中的表达[D]. 丁红梅. 浙江大学. 2001
[3]. 鸡传染性支气管炎病毒H120型M、N基因的免疫原性研究[D]. 孙晓云. 上海海洋大学. 2016