湖南省人民医院 湖南师范大学附属第一医院 泌尿外科
摘要：目的 探讨阿法替尼（Afatinib）与顺铂联合应用于膀胱癌细胞的协同作用，并对其作用机制及耐药性进行初步探讨。方法 先进行膀胱癌阿霉素耐药T24细胞株（T24-ADM）的制备，用噻唑蓝（MTT）法观察Afatinib联合顺铂对T24细胞增殖的抑制作用；分别用MTT法检测Afatinib作用前后顺铂对T24-ADM细胞增殖的抑制作用。结果 Afatinib和顺铂联合用药的T24细胞的增殖抑制率高于单用顺铂；顺铂对Afatinib作用后的T24-ADM细胞抑制率高于Afatinib作用前。结论 Afatinib与顺铂同时作用膀胱癌T24细胞时，两者在抑制T24细胞增殖上表现出协同作用，Afatinib作用后顺铂对于膀胱T24-ADM细胞的抑制率高于单独用顺铂的抑制率。
关键词：Afatinib；顺铂；多药耐药
膀胱癌是对化疗敏感的肿瘤，其中对含顺铂的化疗方案比较敏感，总有效率为40%-75%。当前化疗药物面临的最大难题是耐药性，多药耐药（multidrug resistance，MDR）是指当肿瘤细胞多次接触到某一种化疗药物后，随后对其他不同结构和不同药理作用的抗癌药物产生耐药性，也称之为肿瘤的多药耐药性[1]。
近年来靶向抗肿瘤药物成为研究的方向与热点。Afatinib为选择性靶向表皮生长因子受体。临床上主要用于研究治疗非小细胞肺癌[2]。目前针对膀胱癌的靶向药物较少，相关的单用或联合应用靶向和传统化疗药物的报道亦较少。我们设计了Afatinib与临床常用的顺铂联合应用于膀胱癌T24细胞的一些实验研究，以为临床应用提供实验依据。
1 材料和方法
（1）主要试剂
人膀胱癌T24细胞株 中国科学院上海细胞生物研究所
阿霉素（ADM） 美国Sigma公司
BIBW2992（Afatinib） 美国Selleck
顺铂（Cisplatin） 美国Sigma公司
（2）细胞培养
T24细胞培养和传代 膀胱癌T24-ADM细胞的制备：
（3）Afatinib处理T24-ADM细胞：
（4）噻唑蓝（MTT）法检测T24细胞增殖能力实验：
（5）MTT法检测Afatinib作用前后T24- ADM细胞对药物的敏感性
（6） 统计学分析
本实验数据资料通过SPSS 17.0 for Windows分析统计软件进行单因素方差分析。各实验计量资料用（X ±S）表示，P<0.05表示差异有显著意义。
2实验结果
1 Afatinib和顺铂联合对T24细胞的影响
通过MTT法观察在不同浓度的Afatinib溶液（1umol/L、10umol/L）和不同浓度的顺铂溶液（0、0.5、1.0、2.0、10.0μg/mL）处理后的膀胱癌T24细胞，发现联合用药组与单用顺铂组相比较，对T24细胞的OD值有显著差异性（p<0.05），联合用药组T24细胞存活率明显下降。联合用药组和单用Afatinib组相比较，同样发现联合用药组T24细胞存活率明显下降，两药合用对T24细胞的OD值有显著差异性（p<0.05）。两药合用对T24细胞的抑制率高于单独应用两药的抑制率，两者合用表现出协同作用（表1，图1）。
2 Afatinib作用前后T24- ADM细胞对顺铂的敏感性影响
通过MTT法观察Afatinib作用72h后的T24-ADM细胞和不经Afatinib处理的T24-ADM细胞，结果发现随着顺铂浓度的升高，Afatinib作用后T24-ADM细胞的存活率明显下降，且与Afatinib作用前T24-ADM细胞组相比较，存活率有显著差异性（p<0.05）. Afatinib作用后顺铂对于膀胱T24-ADM细胞的抑制率高于单独用顺铂的抑制率。
3 讨论
膀胱肿瘤是泌尿生殖系最常见的恶性肿瘤，目前膀胱癌的治疗手段是以手术为主，放化疗及免疫治疗为辅的综合治疗。顺铂是治疗膀胱癌的一线药物，总有效率为40%-75%，约12%-20%的患者局部病灶获得完全缓解，约10%-20%的患者可获得长期生存。目前膀胱癌的化疗方案包括GC（吉西他滨和顺铂）方案和MVAC（氨甲喋呤、长春新碱、阿霉素和顺铂）方案。无论那种方案，顺铂都在膀胱癌的化疗中起到重要作用。但肿瘤细胞对于化疗药物的耐药性也是治疗肿瘤失败的重要原因。正是由于这种现象的出现，使得肿瘤细胞对化疗敏感性程度下降，治疗效果也随之变差。并且两种药物有明显的协同作用。Woodbur和Ciardiello等人发现吉非替尼和多种化疗药物，比如说顺铂、多系紫杉醇、卡铂、阿霉素等联合使用对高度表达EGFR的肿瘤细胞株的生长有着抑制作用，并且两类药物能起到相互协同的效果。Inoue[10]等人报告了用抗EGFR单克隆抗体MG-225联合紫杉醇对人移行细胞癌细胞株253JB-V的抗肿瘤效果由于单独用药。他们进一步在裸鼠体内试验中发现，联合用药后肿瘤血管生成受到抑制，淋巴结转移率减少，膀胱肿瘤的消退更加明显。他们认为，紫杉醇和MG-225联合用药能下调碱性成纤维细胞生长因子，血管内皮细胞生长因子，白细胞介素-8型基质金属蛋白酶9的表达，从而抑制肿瘤诱发的新生血管的生成和诱导细胞凋亡。
通过我们的试验，结合国内外的研究，我们认为，对于膀胱癌T24-ADM细胞，Afatinib可以提高该细胞对顺铂的敏感性。Afatinib与顺铂同时作用膀胱癌T24细胞时，两者在抑制T24细胞增殖上表现出协同作用，Afatinib作用后顺铂对于膀胱T24-ADM细胞的抑制率高于单独用顺铂的抑制率。
参考文献：
[1]Kuo MT. Roles of multidrug resistance genes in breast cancer chemoresistance. Adv Exp Med Biol. 2007，608（1）：23-30.
[2]Miller VA，Hirsh V，Cadrane J，et al. Phase Ⅱ/Ⅲ double-blind randomized trial of BIBW 2992，an irreversible inhibitor of EGFR/HER1 and HER2+ best supportive care（BSC）versus placebo+ BSC in patients with NSCLC failing 1-2 lines of chemotherapy and erlotinib or gefitinib（LUX-Lung1）[J]. Annals of Oncology，2010，21（8）：1-12.
[3]Warner TD，Mitchell JA. Cyclooxygenases：new forms，new inhibitors，and lessons from the clinic. FASEB J，2004，18（7）：790-804.
论文作者:李卓,李远伟,卢强,陈佳
论文发表刊物:《中国误诊学杂志》2017年第23期
论文发表时间:2018/1/11
标签：细胞论文; 膀胱癌论文; 作用论文; 抑制论文; 药物论文; 肿瘤论文; 和顺论文; 《中国误诊学杂志》2017年第23期论文;