杨少波[1]2002年在《人胃腺癌相关基因谱研究》文中研究表明研究背景： 我国胃癌发生率在各类恶性肿瘤中位居第二，但其死亡率居各类恶性肿瘤之首。胃癌的病因不明确，尽管人们近年来关于胃癌癌基因和抑癌基因等方面的认识在不断的深化，但仍不清楚胃癌多阶段癌变过程的分子机理。全面了解胃癌癌变过程中的基因表达谱变化，并筛选出胃癌的相关基因，将为解决胃癌的诊断和治疗等问题提供关键的线索。随着人类基因组计划的顺利实施，基因表达及基因功能成了生命科学研究的热点，基因芯片技术是近年来出现的分子生物学与微电子技术相结合的新的检测技术，目前已广泛应用于基因表达研究。研究目的： 1 应用cDNA基因芯片研究筛选人胃腺癌相关差异表达基因，探讨胃癌发生发展的分子机理。 2 研制出人胃腺癌相关基因芯片。 3 研究免疫球蛋白(Ig)轻链kappa(Igκ)和lambda(Igλ)在胃癌细胞中的表达状况，以及Igκ和Igλ在胃癌细胞中表达的一致性。 研究方法： 1．人胃腺癌及相对应的正常胃组织标本取自解放军总医院，新鲜手术标本离体后立即冻存于液氮中。总RNA的提取采用TRIzol reagent。 2．含18000个基因克隆的cDNA膜基因芯片由上海细胞生物学研究所Max-Plank客座实验室制作。6对胃腺癌及正常胃组织的mRNA提取按Qiagen公司的mRNA提取试剂盒操作，cDNA探针以~(33)P-dATP标记，用逆转录法标记探针，杂交炉内杂交，洗膜，磷屏显影，扫描分析，扫描图像成对进行一一对比。 对差异表达基因在上述标本中的表达状况，进一步运用原位杂交和免疫组织 解放军总医院 杨少波 博1：学位论文 车医进修学院 人胃腺癌相关基H谱研究 化学技术进行检测验证。原位杂交探针用Bio－11－dUTP进行标记。免疫组织化学 检测使用LSAB法。 2．人胃腺癌相关基因芯片的制作 所研制的玻璃载体基因芯片上每个基因点两点，所选5兀基因克隆的＊＊R产 物均经测序确定，用点样仪按微矩阵排列点样于化学涂层的载玻片上，经系列处理 固定于载玻片上，即制成基因芯片。 胃腺癌和正常胃组织的总RNA分别直接进行逆转录反应，同时进行荧光素标 记CDNA产物用作杂交探针，等量探针混合后与上述基因芯片进行杂交。严格洗片 后扫描其上的荧光信号，然后分析比较两种组织间的差异。 3运用免疫组织化学技术L％B法对22例石蜡包埋人胃癌组织标本ig。和 Ig入进行检测。 结果： 1．II＄床胃腺癌与相对应的正常胃组织均经病理证实；凝胶电泳显示每例均提 取到优质RNA。 2．膜基固芯片杂交结果6对人胃腺癌与相对应的胃正常组织相比较，筛选出 在 3例以上标本中有 2倍以上改变的基困克隆共有 103条（1条在所有病例中均差 异明显＼其中胃癌组织表达上调基因56条，胃癌组织表达下调基因47条。 对两个膜基困芯片杂交显示明显差异表达的基因 SNC73（f067420，克隆号 GKCFOC02）和 TIMP－l（X0312．克隆号ADCAXD12）．运用原住杂交检测其在6 对胃癌及相对应胃正常组织标本的表达．结果显示SNC73在胃癌组织中表达均低 于正常胃组织，6 TIMP八在胃癌组织中表达均高于正常胃组织，结果与膜基因芯 片杂交一致。运用 TIMP－1（C－20）山羊抗人 TIMP－1多克隆抗体，检测 TIMP－1在 6对 胃癌及相对应胃正常组织标本的表达，TIMP＜在胃癌组织中表达均高于正常胃组 织，进一步从蛋白质水平证实膜基因芯片杂交结果。 3．人胃腺癌相关基固芯片包含 103个上述研究中筛选的人胃腺癌差异表达基 6 解放车总医院 杨少波 博卜学位论文 军医进修学院 人胃腺癌相关基因谱研穴 困，以及一些巳知的胃癌相关基因（如P21ras，P53等）和检测控制基队 运用此芯片检测10对胃癌及相对应胃正常组织标本结果显示，每一杂交点均 清晰，无污点和点间融合，背景较为一致，阴性对照点无反应，看家基因点的亮度均 匀。胃癌的 CDNA探针以Q－5荧光素（呈红色）标iC，而正常胃组织 CDNA探针以h－3 荧光素（呈绿色）标记，杂交图上红缘颜色的差别反映了该基因在胃癌和正常胃组 织的表达水平上的差异，红色点表示胃癌组织该基困表达上调，绿色点表示胃癌组 织该基困表达下调，黄色代表表达水平一样。胃癌组织与正常胃组织相比，在5对 ?
王庆苓, 赵树立, 黄亚红, 侯亚义[2]2009年在《人胃腺癌BGC823细胞Midkine高表达前后基因表达谱芯片分析》文中研究表明目的:用基因芯片技术分析、筛选Midkine高表达前后胃腺癌相关基因谱的差异表达。方法:建立Midkine高表达BGC823胃腺癌细胞系,提取细胞总RNA,逆转录Cy3、Cy5标记cDNA探针,应用晶芯表达谱芯片,分析差异表达的基因。结果:发现Midkine高表达前后BGC823胃腺癌细胞有显着性表达差异的基因共有550个,其中上调基因407个,下调基因143个。对550条差异表达基因进行初步功能分类分析,结果表明这些基因与Midkine促进胃腺癌发病机制存在相关性。结论:Midkine高表达前后BGC823胃腺癌细胞部分功能基因存在显着的表达差异,多数差异表达的基因参与细胞黏附、细胞骨架形成、细胞周期以及细胞代谢等过程。
俞丽芬, 吴云林, 章永平, 乔敏敏, 钟捷[3]2005年在《JAK/STAT信号通路相关基因在人胃腺癌5氟尿嘧啶耐药细胞株中的表达变化》文中指出目的 用基因芯片技术研究人胃腺癌 5 氟尿嘧啶 (5 FU)耐药细胞株SGC7901 /R及其亲本细胞株SGC7901JAK/STAT信号传导通路相关基因表达谱的差异。方法 分别抽提两种细胞mRNA,经逆转录反应,用生物素标记的 16-dUTP将两种细胞的mRNA分别标记成两种cDNA探针,并与载有一组靶基因的人JAK/STAT信号通路芯片进行杂交,通过软件对扫描图像进行数字化处理和分析,筛选 2种细胞在该信号通路中有表达差异的基因。通过RT PCR法分别对耐药细胞及其亲本细胞中的Stat3、核因子(NF)-κB1和bcl-xmRNA的表达水平进行检测。结果 通过两种细胞株JAK/STAT信号通路的基因谱平行比较,筛选出人胃腺癌 5-FU耐药细胞株及其亲本细胞株中有表达差异 2倍以上的基因共 70个,其中表达上调>2倍的 40个,表达下调>2倍的 30个。RT-PCR的验证结果与芯片的筛查结果基本相符。结论 人胃腺癌 5- FU耐药细胞株中JAK/STAT信号通路基因表达谱的变化研究是对胃癌多药耐药分子机制研究的有力补充。
马志明[4]2017年在《CaMKKβ抑制剂STO-609诱导胃腺癌细胞凋亡的机制研究》文中研究表明研究背景:胃癌是在世界范围内常见的恶性肿瘤,具有非常高的肿瘤相关的死亡率。胃癌的预后较差,在疾病的早期阶段,病人的临床症状不特异的症状,因此我国大部分的胃癌于临床诊断时已处于进展期,整体的预后及生存率远不如早期病例占多数的日本、韩国。在我国胃癌已经成为重要的卫生负担,虽然临床及基础的研究取得了长足的进步,但总体而言我国胃癌治疗的效果仍不满意。故此,对胃癌的早期诊断及与肿瘤的演进相关的信号通路及激酶等的研究,一直是胃癌基础研究的一个重要的方向。Ca MKKβ是钙调蛋白激酶家族成员,最初的研究多集中在其作为全身及具体的器官能量平衡的调控因子的作用,在诸如自身免疫性疾病、慢性炎症、神经系统退行性变、炎症等系统性疾病等方面;而最近的研究提示包含消化系统肿瘤在内的多种肿瘤,存在了Ca MKKβ的异常,但关于Ca MKKβ与胃癌的研究较少。目前已知的Ca MKKβ的下游激酶主要有AMPK、Ca MK及Akt,但在胃癌发生发展过程中Ca MKKβ究竟扮演着何种的角色,是学者们关心但尚未明确的问题。STO-609是Ca MKKβ的选择性抑制剂,研究已经发现在多种肿瘤,STO-609可以抑制肿瘤细胞的活力等。但STO-609抑制肿瘤的具体机制不详,只有零星的报道探讨了STO-609与Ca MKKβ的下游分子靶标的作用关系,而STO-609能否成为胃癌治疗潜在的药物的前提,则是对其作用机制及耐药机制的探讨。目的:1.探讨Ca MKKβ在胃癌组织及非癌组织中的表达是否存在差异,如果存在差异,则进一步探讨胃癌组织的Ca MKKβ的表达与临床病理学特征及预后的相关性。2.探讨Ca MKKβ的特异性抑制剂STO-609对胃腺癌细胞活力、凋亡及侵袭能力的影响,探讨STO-609对Ca MKKβ的相关下游通路活化的影响。3.利用sh RNA抑制Ca MKKβ和AMPK,探讨STO-609诱导胃腺癌细胞凋亡的作用及与Ca MKKβ下游信号通路的关系。方法:1应用免疫组织化学的方法检测胃癌组织与癌旁组织及正常组织的Ca MKKβ的表达。2应用统计学软件综合分析胃癌的Ca MKKβ表达与胃癌的组织分型、肿瘤直径、Lauren分型及淋巴结转移等临床病理学特征及预后进行分析。3通过台盼兰染色探讨STO-609的对胃腺癌细胞存活率的影响。4通过Western Blot检测STO-609对胃腺癌细胞Ca MKKβ下游AMPK、Akt、ERK的表达水平。5通过凋亡-坏死定量检测试剂盒及Western Blot检测STO-609的对胃腺癌细胞凋亡率的影响。6通过Trans-well侵袭室检测STO-609的对胃腺癌细胞侵袭能力的影响。7通过sh RNA抑制Ca MKKβ和AMPK,检测STO-609对胃腺癌细胞活力、凋亡及侵袭能力的影响,及AMPK、Akt、ERK的表达水平变化。8通过IBM SPSS 24.0对数据进行统计学分析。结果:1.93例胃癌组织中61例Ca MKKβ表达阳性为,21例癌旁组织中10例表达阳性,17例正常组织中6例表达阳性,阳性率分别为81.7%、46.6%、54.5%,差异具有统计学意义;2.在胃腺癌组织的Ca MKKβ表达评分上,T2期及以下肿瘤组织的评分为1.03±0.79,T2期以上肿瘤组织的评分为1.93±1.05,差异有统计学意义。多因素分析显示Ca MKKβ的强阳性表达是预后的独立危险因素,与弱阳性组相比强阳性组在总生存率上的差异有统计学意义;3.STO-609可以抑制胃腺癌SUN-1细胞及N87细胞的活力。4.STO-609对胃腺癌SUN-1细胞及N87细胞的AMPK、Akt、ERK的活化有抑制作用。5.STO-609对胃腺癌SUN-1细胞及N87细胞的凋亡有诱导作用。6.STO-609对胃腺癌SUN-1细胞及N87细胞的侵袭能力有抑制作用。7.与对照组相比,Ca MKKβsh RNA对STO-609引起的胃腺癌SUN-1细胞的凋亡存在抑制作用,但AMPK sh RNA无明显抑制凋亡的作用。8.与对照组相比,AMPK sh RNA对STO-609引起的胃腺癌SUN-1细胞的活力抑制及凋亡诱导无抑制作用;AMPK sh RNA对STO-609引起的SUN-1细胞的Akt及ERK活化无抑制作用。结论:1.胃癌组织的Ca MKKβ的表达明显高于癌旁组织及正常组织,Ca MKKβ的表达与肿瘤的浸润深度相关且强阳性表达提示预后不良,可能成为潜在的分子标志物;2.STO-609抑制胃腺癌细胞活力的作用,可能是与其诱导细胞凋亡有关;STO-609诱导胃腺癌细胞凋亡的作用,与其对Ca MKKβ的下游信号AMPK、Akt、ERK的激活抑制有关。STO-609抑制对胃腺癌细胞的侵袭能力有抑制作用,提示Ca MKKβ抑制剂STO-609可能作为一种新型的抗癌药物。3.我们进一步研究发现,AMPK特异性沉默,并没有影响Ca MKKβ抑制剂STO-609诱导胃癌细胞凋亡作用,提示诱导凋亡的作用可能与Ca MKKβ下游的信号其一的AMPK途径的机制无关。4.最后,结合我们的整体实验结果,我们推测:STO-609诱导胃癌细胞凋亡的机制,可能与抑制Ca MKKβ下游信号Akt、ERK及信号途径之间的交互调控有关。
刘振华[5]2011年在《β3Gn-T8与胃癌增殖侵袭关系的研究》文中研究表明目的:(1)探讨糖基转移酶β3Gn-T8在胃癌组织与癌旁非肿瘤胃组织表达的差异。(2)在胃癌组织、胃癌AGS细胞、胃癌细胞裸鼠移植瘤水平分别探讨糖基转移酶β3Gn-T8对胃癌增殖侵袭能力的影响。(3)探讨糖基转移酶β3Gn-T8对胃癌侵袭能力的影响机制。方法:(1)通过免疫组织化学方法检测β3Gn-T8在由97例人胃癌组织和89例癌旁非肿瘤胃组织制作而成的组织芯片上的表达并分析其差异。收集97例胃癌组织标本的临床病理参数并通过统计学分析胃癌组织β3Gn-T8的表达与临床病理参数的关系。通过免疫组织化学的方法检测肿瘤转移相关基因MMP-2,TIMP-2以及肿瘤增殖相关基因PCNA在97例胃癌组织中的表达,并分析β3Gn-T8的表达与MMP-2,TIMP-2,PCNA表达之间的相关性。(2)设计合成叁条β3Gn-T8的siRNA,通过脂质体转染胃癌AGS细胞,通过RT-PCR,realtimePCR,western bloting等方法进行有效siRNA的筛选和鉴定。将阴性对照β3Gn-T8siRNA (β3Gn-T8NCsiRNA ) ,有效β3Gn-T8siRNA(β3Gn-T8siRNA-2)及β3Gn-T8真核正义表达载体(pEGFP-C1-β3Gn-T8),空载体(pEGFP-C1)转染入胃癌AGS细胞,以未处理AGS细胞做对照,通过HE细胞染色形态学观察,MTT法,流式细胞仪,Hoechst33258染色等方法检测β3Gn-T8对胃癌AGS细胞的增殖能力的影响;通过Transwell方法检测β3Gn-T8对胃癌AGS侵袭能力的影响;通过RT-PCR方法以及western bloting方法检测上调和下调β3Gn-T8表达对胃癌AGS细胞MMP-2,TIMP-2表达的影响;进一步通过明胶酶谱法检测下调β3Gn-T8对MMP-2酶活性的影响。(3)将转染β3Gn-T8siRNA-2的AGS细胞、转染pEGFP-C1-β3Gn-T8的AGS细胞以及未处理的AGS细胞通过皮下接种BALB/c裸小鼠的方法构建胃癌移植瘤模型。通过对移植瘤成瘤时间,生长曲线,最终体积,最终重量等指标的测量,研究β3Gn-T8对胃癌移植瘤增殖能力的影响。通过对移植瘤组织进行HE染色形中文摘要β3Gn-T8与胃癌增殖侵袭关系的研究态学观察,透射电镜形态学观察、免疫组织化学检测移植瘤中PCNA的表达进一步研究β3Gn-T8对胃癌移植瘤的侵袭能力、凋亡水平、增殖能力的影响。通过免疫组织化学方法检测胃癌移植瘤组织中β3Gn-T8,MMP-2,TIMP-2的表达强度,探究β3Gn-T8对胃癌移植瘤的侵袭能力的影响机制。结果:(1)β3Gn-T8在胃癌组织的表达(82/97)显着高于癌旁非肿瘤胃组织(33/89)(P<0.001);β3Gn-T8蛋白的表达与胃癌的临床分期显着正相关(P<0.01),与浸润深度显着正相关(P<0.05),与淋巴结转移显着正相关(P<0.01);β3Gn-T8在胃癌组织中的表达与MMP-2的表达显着正相关(P<0.01),与PCNA的表达显着正相关(P<0.05),而与TIMP-2的表达显着负相关(P<0.05)。(2)β3Gn-T8siRNA-2对β3Gn-T8的mRNA表达和蛋白表达有显着的抑制作用。对转染β3Gn-T8siRNA-2的AGS细胞进行增殖侵袭能力的系列检测,和对照组相比较,流式细胞仪检测和Hoechst33258染色显示细胞凋亡率增加(P<0.05);MTT法显示细胞的增殖能力下降(P<0.05);Transwell法显示细胞的侵袭能力下降(P<0.05);RT-PCR以及western bloting显示MMP-2的表达下降,而TIMP-2的表达升高(P<0.05);明胶酶谱法显示MMP-2的酶活性下降(P<0.05)。对转染pEGFP-C1-β3Gn-T8的AGS细胞进行增殖侵袭能力的系列检测,和对照组比较,流式细胞仪检测和Hoechst33258染色显示凋亡率下降,和对照组相比,差异不明显(P>0.05);MTT法显示细胞的增殖能力升高(P<0.05);Transwell法显示细胞的侵袭能力增强(P<0.05);RT-PCR以及western bloting显示MMP-2的表达升高,而TIMP-2的表达下降(P<0.05)。(3)胃癌AGS细胞裸鼠移植瘤成瘤率100%。β3Gn-T8siRNA组移植瘤成瘤时间、生长速度、最终重量、最终体积均显着小于对照组(P<0.05);pEGFP-C1-β3Gn-T8组生长速度、最终重量、最终体积均显着大于对照组(P<0.05),而成瘤时间与对照组无明显差异。移植瘤HE染色组织学观察发现,移植瘤呈现低分化胃癌的组织学特点,局部淋巴结、肝、肺均无转移瘤形成;pEGFP-C1-β3Gn-T8组可见移植瘤对周围横纹肌的侵袭现象,而对照组及β3Gn-T8siRNA组无此现象。透射电镜观察发现β3Gn-T8siRNA组凋亡现象较对照组和pEGFP-C1-β3Gn-T8组明显。免疫组化检测发现,pEGFP-C1-β3Gn-T8组β3Gn-T8、MMP-2的表达显着增加,而TIMP-2的表β3Gn-T8与胃癌增殖侵袭关系的研究中文摘要达显着下降(P<0.05),而PCNA的表达未见显着差异;β3Gn-T8siRNA组β3Gn-T8、MMP-2的表达显着下降,而TIMP-2的表达显着升高(P<0.05),而PCNA的表达未见显着差异。结论:(1)β3Gn-T8在人胃癌组织的表达增加,而且与胃癌的增殖侵袭转移能力正相关;β3Gn-T8在人胃癌组织中的表达与MMP-2、PCNA正相关,与TIMP-2负相关。β3Gn-T8可能通过对MMP-2、TIMP-2表达的调控促进了胃癌的侵袭转移。(2)β3Gn-T8增强胃癌AGS细胞的增殖能力和侵袭能力;下调AGS细胞β3Gn-T8的表达,导致MMP-2的表达、酶活性降低以及TIMP-2的表达升高;上调AGS细胞β3Gn-T8的表达,导致MMP-2的表达升高和TIMP-2的表达降低。β3Gn-T8具有调节MMP-2、TIMP-2表达以及MMP-2酶活性的功能,这可能是β3Gn-T8促进胃癌侵袭转移的机制之一。(3)β3Gn-T8增强胃癌裸鼠移植瘤的增殖和侵袭能力;下调移植瘤β3Gn-T8的表达,出现MMP-2的表达下降和TIMP-2的表达升高;上调移植瘤β3Gn-T8的表达,出现MMP-2的表达升高和TIMP-2的表达降低。β3Gn-T8在裸鼠移植瘤中对MMP-2、TIMP-2的表达具有调控作用,并可能通过这种调控作用影响胃癌移植瘤的侵袭转移。综上所述,糖基转移酶β3GnT8在胃癌组织的表达较癌旁非肿瘤胃组织显着增加;糖基转移酶β3GnT8对胃癌组织、胃癌细胞、胃癌裸鼠移植瘤的增殖、侵袭能力有增强作用;β3GnT8对胃癌组织、胃癌细胞、胃癌裸鼠移植瘤中的MMP-2、TIMP-2表达具有调控作用,推测这可能是其促进胃癌侵袭转移的机制之一。
佚名[6]2004年在《肿瘤流行病学与肿瘤病因学》文中提出肿瘤高发人群上消化道肿瘤筛查方法的应用与体会贺立绩黄瑞德山西省阳城县肿瘤防治办公室,山西阳城,048100 摘要目的:肿瘤筛查是癌症“叁早”的唯一途径,应用胃液隐血技术隐血珠+胃镜+活检的筛查方法在肿瘤高发人群中对30岁以上的居民进行了叁级筛查,以期降低人群晚期肿瘤发生率及死亡率,提高患者生存率。方法:1、全县30岁以上人群均为筛查对象;2、《防癌自查隐血试剂盒》即隐血珠为筛查药具;3、筛查方法采用一级隐血珠初筛,二级电子胃镜检查,叁级病理确诊的.“叁级法”。结果:1、隐血珠人群筛查,
唐琳[7]2005年在《肝素酶mRNA在胃癌组织中的表达及体外抑制胃癌侵袭的实验研究》文中进行了进一步梳理胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,严重危害人类的生命与健康,其对人体的危害不仅在于肿瘤细胞生长失控而引起的克隆性异常增生,同时,肿瘤的侵袭和转移更是导致胃癌患者死亡的重要原因。 肿瘤细胞浸润和转移首先须穿越血管基底膜(basement membrane, BM)与细胞外基质(extracellular matrix, ECM)组成的屏障。这一屏障主要由结构蛋白和糖氨聚糖(heparan sulfate proglycan, HSPG)两种成分构成。分别以此两种成分为底物的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)和肝素酶(heparanase, HPA)则可通过其降解作用而促进肿瘤细胞的浸润和转移。有关MMPs及其内源性组织金属蛋白酶抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs)在肿瘤转移中的重要作用已在以往的研究中得到证实,并发现MMP9是MMPs家族中与胃癌转移关系最为密切的成员之一,TIMP1是MMP9的天然抑制剂,能与MMP9形成1:1复合物,从而抑制其活性。对以糖氨聚糖为底物的HPA,其研究才刚刚起步。自1999年以来,随着HPA基因得以克隆,有关HPA的研究相继获得一些令人振奋的实验结果,HPA在肿瘤细胞穿越血管壁进而实现浸润、转移过程中的关键作用已受到人们的高度关注。研究发现,HPA在乳腺癌、肺癌、肝癌等高转移性肿瘤中呈现高表达,在低或无转移潜力的恶性肿瘤中微量表达或不表达。胃癌亦属于高转移性恶性肿瘤之一,到目前为止,有关HPA与胃癌侵袭转移关系的研究,报道甚少,且未见运用RT-PCR、原位杂交两种方法联
刘莺, 刘平, 朱文锋, 李俊军[8]2004年在《胃癌相关基因的表达谱研究》文中提出胃癌是发生在胃上皮组织的恶性肿瘤。是全世界最常见的恶性肿瘤。在我国胃癌死亡率占所有恶性肿瘤死亡的23.02%,居各类肿瘤之首,因此,早期诊断与早期治疗尤为重要。基因芯片利用芯片技术中信息集成化和平行处理原理,在645mm~2基质上固定成千上万个特定的寡核苷酸或DNA片段,通过碱基互补配对原理进行杂交,能够高能量、高效率、低消耗地获得大量基因mRNA水平的表达信息,从而能够进行整个基因
刘建明[9]2014年在《microRNA在胃癌细胞株MKN-45肿瘤干细胞中的表达谱研究》文中研究说明第一部分悬浮培养法分离人胃癌细胞株MKN-45肿瘤干细胞目的：探讨悬浮培养法在胃癌细胞株MKN-45中分离胃癌干细胞的可行性，为研究胃癌干细胞建立一种细胞模型。方法：人胃癌细胞株MKN45购自中科院上海细胞库。MKN45细胞复苏以后在含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养液中培养，细胞贴壁以后，收集贴壁细胞置于含无血清的RPMI-1640培养液96孔超低粘附板(Corning)中培养，培养液中加入1%N-2添加剂，2%B-27添加剂(Invitrogen),1%青链霉素(Gibco),20ng/ml人FGF-2和100ng/ml EGF (Chemicon)，观察的肿瘤球形成情况，每孔100个细胞，两周后在倒置显微镜(Olympus)下放大40及100倍观察肿瘤球形成情况。当形成的克隆球长到200-500个细胞时，将肿瘤球溶解成1000个/ml细胞的溶液，按每孔100μL单细胞悬液植入含无血清培养液的96孔的超低粘附板(Corning)中，两周后观察第二代肿瘤球就形成情况，贴壁细胞作为对照组观察成球情况。重复上述步骤，亚代球体细胞体外传代培养六代以上。结果：胃癌MKN-45细胞在无血清培养基中能形成悬浮球状体。悬浮培养7d即开始形成细胞球体，培养至14d球体基本形成，中心密度増高。培养21d左右球体完全形成，球体结构饱满，细胞排列致密，中心密度更高。第一代球体细胞吹散后在无血清培养基中继续培养，能继续形成细胞球体，随着传代代数的增加，成球率逐渐增高，传代至第六代时，成球率达29.70%±6.21%，而原代细胞的成球率为3.30%±1.49%，差异有统计学意义(P<0.05)。结论：采用悬浮培养法在胃癌细胞株MKN-45中分离出的悬浮球体细胞具有自我更新与增殖的CSC的特性。第二部分人胃癌细胞株MKN-45肿瘤干细胞的鉴定目的：鉴定悬浮培养法分离的悬浮球体细胞的肿瘤干细胞的特性，为进一步研究胃癌干细胞建立一种实用而有效的细胞模型。方法：①实时定量逆转录-聚合酶链反应检测干性基因Oct-4, Nanog, Sox2以及CD44在球体细胞与贴壁细胞中的表达;②免疫荧光检测干细胞标志物Oct-4, Nanog, Sox2以及CD44在MKN-45悬浮球体细胞及贴壁细胞中的表达；③免疫印迹分析测定干细胞标志物Oct-4, Nanog, Sox2以及CD44在MKN-45悬浮球体细胞的中的表达；④化疗耐受实验：提取培养至14天的MKN-45球体细胞接种于96超孔板低粘附板中，每孔2×103／200ul；取MKN-45贴壁细胞，接种于普通的96孔板中，每孔2×103／200ul。分别在球体细胞及贴壁细胞加入传统化疗药5-Fu及DDP检测，PBS作为内参。药物浓度及作用方式为单药5-Fu (50μg/ml,100μg/ml,200μg/ml),单药DDP (10μg/ml,20μg/ml,40μg/ml),5-Fu联合DDP (50μg/ml+10μg/ml;100μg/m+20μg/ml;200μg/ml+40μg/m)，化疗药作用24及48小时后，分别加入MTT37C孵化4h，更换150ml DMSO。细胞存活数根据OD450nm (Abs)吸光值评估。；⑤选用雄性无胸腺裸鼠6-8周年龄24只，分别提取培养至14天MKN-45悬浮球体细胞数1x104,2x104,2x105,2x106个，提取相应数量的贴壁细胞作为对照。球体细胞注射在右前背部皮下，原代贴壁细胞注射在左前背部皮下，每7-10天观察肿瘤形成情况，直至8周处死，肿瘤标本固定在10%福尔马林液中，作H&E病理检查。结果：①实时定量PCR与免疫印迹实验显示，球体细胞Oct-4, Sox2, Nanog和CD44的相对表达量分别为2.92±0.44、4.49±0.20、2.34±0.22、1.18±0.04；原代贴壁细胞Oct-4,Sox2, Nanog和CD44的相对表达量分别为1.02±0,06、1.00±0.06、1.00±0.00、1.00±0.05，球体细胞Oct-4, Sox2, Nanog和CD44明显高于原代贴壁细胞(P＜0.05)②免疫荧光显示Oct-4, Sox2以及Nanog蛋白主要在细胞核周围及细胞质中阳性表达，而CD44主要在细胞膜上表达。Oct-4/CD44, Sox2/CD44以及Nanog/CD44双重染色提示胚胎蛋白Oct-4、Sox2以及Nanog均与CD44在同一球体细胞中表达；③5-Fu及DDP作用24小时后，球体细胞呈现明显的药物抵抗能力，球体细胞的存活率明显高于原代贴壁细胞，其中，50μg/ml,100μg/ml及200μg/ml5-Fu作用后，球体细胞的存活率分别为原代贴壁细胞的1.3倍,1.4倍和1.7倍,10μg/ml,20μg/ml及40μg/ml DDP作用后，球体细胞的存活率分别为原代贴壁细胞的1.7倍,3.2倍和3.4倍。作用48小时，无论是5-Fu还是DDP,球体细胞存活率无明显增高,但当5-Fu联合DDP作用24小时后，球体细胞存活率分别为原代贴壁细胞的2.6,2.9以及2.7倍，作用48小时后球体细胞存活率分别为原代贴壁细胞的5.1倍,4.8倍以及5.4倍。④MKN-45球体细胞2x104个细胞即能形成移植瘤，而原代贴壁细胞需要2x106个细胞才能形成移植瘤，球体细胞致瘤能力是原代贴壁细胞的100倍。且球体细胞形成的肿瘤比原代贴壁细胞形成的瘤体大。H&E检查显示球体细胞形成的肿瘤与原代贴壁细胞形成的瘤体的病理改变表现相似，主要是已分化的胃癌细胞。结论:悬浮培养法分离的悬浮球体细胞具有的肿瘤干细胞的特性，这些特性包括自我更新与增殖能力、对传统化疗药物的耐受性、高致瘤能力、干性基因与蛋白的高表达等。该方法为胃癌干细胞的进一步研究提供了一种实用而有效的细胞模型。另外，Oct4/CD44、 Sox2/CD44、 Nanog/CD44可能分别是胃癌CSC的一种表型。第叁部分microRNA在人胃癌细胞株MKN-45肿瘤干细胞中的表达谱目的：探讨microRNA在胃癌细胞株MKN-45肿瘤干细胞中的表达谱，预测miRNA的靶基因，并分析其在胃癌干细胞中的生物学功能。方法：①采用悬浮培养法分离出球体细胞（胃癌干细胞）；②基因芯片（Agilent’s humanmiRNA microarray, version18.0）测定球体细胞（胃癌干细胞）与贴壁细胞间的miRNA的特性表达谱；③RT-PCR验证miR-29a-3p, miR-181a-5p, miR-21-5p, miR-16-5p,miR-27a-3p, miR-22-3p, let-7b-3p, miR-34a-5p, miR-4270,和miR-483-5p这10个miRNA的表达,所有验证均重复叁次。④通过MiRanda, TargetScan以及Pictar叁个在线数据库对上述10个miRNA作生物信息学分析，预测miRNA的靶基因，并分析其在胃癌干细胞中的生物学功能。这叁个在线数据库的网址分别是：miRanda： http://microrna. sanger.ac.uk；TargetScan：http://www.targetscan.org。PicTar： http://www.ncrna.org/KnowledgeBase/link-Database/mirna_target_database,结果：①microRNA芯片检测结果显示，悬浮培养法培养胃癌细胞株MKN-45所形成的悬浮球体细胞与原代贴壁细胞之间有1887个microRNA的表达存在程度不等的差异，其中差异在两倍以上的microRNA有182个，绝大多数（173个）microRNA在球体细胞中表达下调，少部分（9个）表达上调。②qRT-PCR验证结果显示，10个microRNA在球体细胞与原代贴壁细胞间的相对表达量存在明显差异，其中，7个microRNA（miR-29a-3p, miR-181a-5p, miR-21-5p, miR-27a-3p, miR-22-3p， miR-4270以及miR-483-5p）的表达水平与芯片检测结果一致，3个microRNA （miR-16-5p,,let-7b-3p,miR-34a-5p）的表达水平与芯片检测结果不一致，符合率70%③MiRanda,TargetScan以及Pictar叁个在线数据库的交集中，有384对miRNA: mRNA配对靶点，其中miR-181a-5p, miR-27a-3p, miR-34a-5p, miR-21-5p, miR-22-3p, miR-4270, let-7b-3p,以及miR-29a-3p可以预测到靶基因，而miR-483-5p与miR-16-5p未能预测到靶基因。④我们采用CytoScapeR软件对miRNA–mRNA靶基因之间的相互作用的网络作了分析，结果显示，每一个miRNA可以有数十个乃至上百个靶基因，许多靶基因可以是多个miRNA的潜在靶基因，即多个miRNA可以调控同一个靶基因，这些靶基因中的绝大多数与肌动蛋白骨架、粘着斑、胞外基质受体的交互作用以及肿瘤的信号通路有关。特别是许多靶基因与干细胞相关的一些重要的信号通路有关，这些信号通路包括Notch、Wnt/β-catenin、 MAPK、mTOR以及JAK-STAT信号通路等。结论：miRNA在胃癌细胞株MKN-45肿瘤干细胞中存在特异性的表达谱，研究miRNA在胃癌干细胞中特异性的表达谱将为深入研究胃癌的发生、发展以及制定针对胃癌干细胞的治疗策略提供新的方法，为彻底根治胃癌带来希望。
王娜[10]2010年在《幽门螺杆菌及TNF-α对胃癌培养细胞α4GnT基因表达的调控的研究》文中指出幽门螺杆菌﹙Helicobacter pylori,Hp)是一种革兰氏阴性微需氧菌,1983年Marshal和Warren首次从慢性胃炎患者中分离出来,在人群中的感染率约50%以上。幽门螺杆菌与胃炎、胃溃疡和胃癌的发生密切相关,通过诱导宿主的炎症性因子、转录调节因子、细胞凋亡相关因子、信号转导因子等多种基因的表达而致病。1994年世界卫生组织将其归为Ⅰ类致癌原。肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)是体内重要的炎症性细胞因子之一,其表达增加与幽门螺杆菌感染存在密切关系,并且促进了胃炎的发展。虽然幽门螺杆菌的感染率很高,但多数感染者并无临床症状,因此推测人体对幽门螺杆菌有自然防御能力。近年来的研究表明,在胃粘膜的贲门腺、幽门腺、颈粘液细胞等部位存在α-1,4-N-乙酰葡糖胺转移酶(α-1,4-N-acetyglucosaminyltransferase,α4GnT)。它是一种糖基转移酶,转移N-乙酰葡糖胺到具有核2分支O-聚糖的β半乳糖残基上形成α-1,4-N-乙酰葡糖胺末端。研究发现,胃腺粘液中末端连接有α-1,4-N-乙酰葡糖胺的O-聚糖粘蛋白具有天然抗菌素的功能。它通过影响幽门螺杆菌的细胞壁成分胆固醇-α-D-吡喃葡糖苷的生物合成来抑制幽门螺杆菌的增殖、游动并使之变形。推测胃腺粘液细胞中的α4GnT通过在胃腺粘液蛋白的O-聚糖上生成α-1,4-N-乙酰葡糖胺,来阻隔幽门螺杆菌侵入深层胃粘膜,从而对胃粘膜具有自然保护作用。因此,我们应用胃癌培养细胞从基因转录水平和蛋白水平探明幽门螺杆菌及TNF-α对α4GnT基因的调控作用。目的:应用表达α4GnT基因的胃癌细胞,从mRNA水平和蛋白水平探讨幽门螺杆菌与细胞因子TNF-α对α4GnT基因表达的诱导作用。方法:1.细胞培养:胃癌细胞株MGC803复苏后,培养于含10%FBS、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI1640培养基中,置于37℃,5%CO2饱和湿度的培养箱内培养,传代后以每毫升3×105个细胞数接种于新的培养瓶,将接种后48h的细胞用于实验。2.细菌培养:幽门螺杆菌标准菌株J99复苏后,接种于哥伦比亚琼脂培养基(含5%羊血、11μg/ml万古霉素、11μg/ml两性霉素B、0.47μg/ml多粘菌素B),置于37℃微需氧条件下培养。3.实验分组:幽门螺杆菌组:将密度1×105-1×106CFU/ml的幽门螺杆菌与MGC803细胞共培养6h,换液后继续培养至48h。TNF-α组:将终浓度10ng/ml的TNF-α加入细胞作用48h。对照组:细胞内加入等量无幽门螺杆菌和TNF-α的培养基,培养48h。4.应用RT-PCR检测各组α4GnT基因的mRNA表达水平,扩增片段进行8%琼脂糖凝胶电泳,电泳结果与内参照物GAPDH比较判断。5. Western Blot检测各组α4GnT蛋白表达水平,近红外双色激光成像系统扫描后,与内参照物GAPDH进行比较、判断结果。6.免疫组织化学染色方法检测各组α4GnT蛋白表达水平,DAB显色后,光镜下观察细胞,每张盖玻片计数5000个细胞,计算阳性率,各处理组与对照组进行比较。7. RT-PCR与Western Blot检测结果应用凝胶-蛋白分析系统进行相对定量分析,以均数±标准差(x±s)表示,应用SPSS17.0统计软件分析,两组间比较用t检验。免疫组化结果以各组细胞阳性率表示,应用SPSS17.0统计软件分析,两组间比较用χ2检验。显着性检验水准为p﹤0.05。结果:1.RT-PCR检测α4GnTmRNA表达结果:幽门螺杆菌作用于人胃癌细胞MGC803后,α4GnT基因mRNA表达量(0.1160±0.011)与对照组(0.1258±0.00531)比较没有明显的差别,统计结果显示无显着性差异,p﹥0.05;TNF-α作用于人胃癌细胞MGC803后,α4GnT基因mRNA表达量(0.474±0.072)与对照组(0.1520±0.001)比较明显增加,p﹤0.05。2.Western Blot检测α4GnT蛋白表达结果:幽门螺杆菌组α4GnT蛋白表达量(0.2200±0.59)与对照组(0.2120±0.3271)比较没有明显的差别,也无统计学意义, p﹥0.05 ; TNF-α组α4GnT蛋白表达量(0.6180±0.0672)与对照组(0.2080±0.0148)比较增加了3倍,统计学上具有显着性,p﹤0.05。3.免疫组化检测α4GnT蛋白表达结果:免疫组化染色后,光镜下观察,幽门螺杆菌组α4GnT阳性细胞数(2.8%)与对照组α4GnT阳性细胞数(3.4%)比较,没有明显的增多,统计学无显着性差异,p﹥0.05;TNF-α组阳性细胞数(20.9%)与对照组α4GnT阳性细胞数(5.4%)比较有明显的增加,两组间的差异有统计学意义,p﹤0.05。结论:1.人胃腺癌细胞MGC803表达α4GnT基因2.幽门螺杆菌与胃癌细胞MGC803共培养,并未影响α4GnT基因的mRNA及蛋白表达水平发生明显的变化。3. TNF-α作用于胃癌细胞MGC803使其α4GnT基因的mRNA及蛋白表达水平升高,表明TNF-α对MGC803细胞α4GnT基因表达具有诱导作用。4. MGC803细胞系可作为探讨α4GnT基因表达诱导因素的细胞系。
参考文献：
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[9]. microRNA在胃癌细胞株MKN-45肿瘤干细胞中的表达谱研究[D]. 刘建明. 苏州大学. 2014
[10]. 幽门螺杆菌及TNF-α对胃癌培养细胞α4GnT基因表达的调控的研究[D]. 王娜. 河北医科大学. 2010
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