摘要：死胎的原因很多，一部分死胎与染色体核型异常有关，死胎的遗传学分析在死胎的原因和复发性风险的评估中十分必要，传统染色体检测技术存在缺陷，单核苷酸多态性微阵列技术（SNP-array）是目前最新的细胞分子遗传学诊断技术，本文就SNP-array的原理、特点及其在死胎的应用作一综述。
关键词：遗传学分析；死胎；单核苷酸多态性微阵列技术
妊娠20周后胎儿在子宫内死亡者称为死胎。导致死胎的原因很多，包括胎盘、脐带异常、胎儿因素，母体因素等等，还有些原因不明。文献报道，一部分死胎的发生源自染色体异常，其中6%-13%的死胎与染色体核型异常有关[1-2]，解剖结构异常的死胎中核型异常者比例可高达5%-40%[3]。因此，对死胎的遗传学分析在死胎的病因和复发性风险的评估中十分必要。它有助于临床医生向患者提供遗传咨询，给予精神安慰，增加她们下次妊娠的信心。
单核苷酸多态性微阵列技术（single nucleotide polymorphism array，SNP-array）是目前最新的细胞分子遗传学诊断技术，克服了传统细胞遗传学技术：如G 显带染色体核型分析技术、荧光原位杂交（fuorescence in situ hybridization，FISH）技术、比较基因组杂交（comparative genomic hybridization，CGH）等以上各检测方法的缺点，从速度、自动化、分辨率、敏感性方面，较传统细胞遗传学检测方法有很大提高，本文就传统细胞学遗传技术特点，以及目前最新的细胞分子遗传学诊断技术SNP-array的原理、特点及其在死胎的应用作一综述。
一、传统细胞遗传学技术特点
传统细胞遗传学技术，如G 显带染色体核型分析技术，虽然可以检测整套染色体的数目和明显的结构异常，其具有高度的可靠性并可能成为染色体分析的金标准，但可能受到多种因素的限制，其耗时长、分辨率低，人为误差大、且需要有丝分裂中期细胞，操作费时费力，尤其对于死胎样本，细胞培养失败率高达 30％[4-5]。而荧光原位杂交（fuorescence in situ hybridization，FISH）技术，是用荧光标记的DNA 探针检测与探针序列互补的基因组区域，虽然能够以较高分辨率检测亚显微缺失和重复，但需要预先知道待测基因拷贝数的类型和位置，无法诊断没有任何确定条带模式的未知染色体异常；且一次检测，仅能对少数位点进行分析，缺乏整体性，不适合于基因组的筛查[6]。比较基因组杂交（comparative genomic hybridization，CGH）通过一次试验就能对待测样本整个基因组进行筛查。其原理是用绿色或红色荧光标记待测 DNA 和对照 DNA 并制成探针，与人中期染色体进行共杂交，以在染色体上显示的待测与正常对照的荧光强度的不同来反映整个待测基因组DNA 表达状况的变化，再借助于图像分析技术可对染色体拷贝数量的变化进行分析研究。所需DNA 样本量较少，一次杂交即能检测染色体的非整倍体和基因组的拷贝数量的变化。但分辨率低（约 5-10Mb），且需要中期染色体作为杂交靶，费时费力[7]。鉴于以上传统染色体检测技术的各种缺陷，临床上迫切需要在检测率、检测时间、分辨率、敏感性、自动化上均占优势的技术应用于死胎的遗传学研究，以达到明确病因，提供正确的遗传咨询和临床指导等目的。
二、单核苷酸多态性微阵列技术的原理
单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）指不同个体或物种基因组DNA序列同一位置上的单个核苷酸变异。它是最微小的变异单元，是由单个核苷酸对置换、颠换、插入或缺失所形成的变异形式。SNP是高密度的遗传基因标志。人类基因组大概每1000个核苷酸即可能出现一个SNP，其中有些SNP可能与疾病有关[8]。单核苷酸多态性微阵列技术是将大量单核苷酸位点序列采用特殊方法固定在硅芯片上，从而获得高密度的SNP微阵列（30万个位点，400多个基因）。其工作原理为将待测样本全基因组扩增后的 DNA 碎片化后变性并与芯片上探针杂交、洗涤和单碱基延伸反应（不同荧光标记的A、G、C、T）后荧光染色，扫描荧光信号，由计算机对每个荧光信号进行分析，它能同时对大量的核酸进行高通量的检测和分析，经过数据分析软件判断对应片段或位点是否有重复或缺失，从而能提供快速、高能量、精准的基因分析。
三、单核苷酸多态性微阵列技术的优点
SNP微阵列技术克服了现有的染色体分析技术的局限性，是一种高通量、高分辨率、高敏感性的检测方法，一次实验即可检测待测样本整个基因组DNA 拷贝数的变异。SNP微阵列具有高通量系指其一次检测相当于对基因组同时进行了成千上万个独立的FISH，而不用事先知道染色体异常的发生位置，并且出报告时间快速和操作程序自动化，通常检测时间只需 3 天，比G显带核型分析和比较基因组杂交省时省力。近年来Johnson等[9]发表了SNP array24 小时内完成检测的操作流程，更是将检测时间大大缩短。SNP array 技术对染色体异常结构的分辨率为1.5kb，能识别染色体的亚显微结构缺失和重复、单亲二倍体（UPD）、三倍体、杂合性缺失、嵌合体等细胞遗传异常，以及300多种综合症如智力缺陷、自闭症、Prader-Willi综合症、Angelman症等。SNP微阵列芯片与传统的FISH、比较基因杂交或其他染色体分型技术不同，它能以快速并低成本筛选与疾病相关的SNP，分析结构变异，并鉴定杂合子丢失。欧阳宁等[10]相关实验报道，使用绒毛细胞培养核型分析检测的成功率为40%，染色体异常率为50%，而通过SNP-array技术检测流产绒毛组织样本的成功率为100%，异常率为70%，差异有统计学意义（P＜0.05%），证明微阵列技术的成功率及染色体异常率均明显高于传统方法。Treff 等[11]验证了SNP 的可行性，即每个SNPs 位点精确性达 99.2%，全染色体的精确性可达99.8%。SNP微阵列不仅能够可靠地检测出所有因染色体微缺失或微重复引起的基因组不平衡畸变，并且精确地确定基因拷贝变异的断裂点和大小，清楚显示畸变片段内的基因含量，有助于发现、鉴定与疾病临床表型相关的基因。此外，SNP微阵列不需要制备细胞分裂中期染色体，不需要细胞培养，可以直接对浸润无活力的死胎组织进行DNA提取，芯片检测，弥补传统核型分析需要活细胞培养的缺点，避开常规核型分析在细胞培养中可能出现的母源性细胞污染和培养失败等风险，大大提高了检测率，获得更多的结果。在样本用量上也有很大优势，只需要不多于 1ug 的 DNA 量，无论有或无全基因组扩增，一次实验即可检测全基因组 DNA 拷贝数的变化（copy number variants，CNVs）进行高能量、高分辨率的分析、快速、精确地检测传统核型分析所无法检测的亚显微结构的染色体失衡[12-16]，将序列变异的某一DNA准确定位到染色体上，确定致病性CNVs，增加了染色体及基因异常导致的死胎的原因检出率，为死胎的原因探查提供了方便、快捷、可行、准确、有效的分子遗传学诊断方法。因此，在分子细胞遗传学诊断中，运用 SNP具有较大的可行性和优越性。
四、单核苷酸多态性微阵列技术在死胎的应用
基因芯片技术自从出现以来，主要被应用于肿瘤、遗传病（如智障、发育迟缓、自闭症、精神分裂症、先天性疾病等）方面的诊断和研究[17-23]。在死胎、流产方面的研究鲜有报道。近几年，基因芯片技术在产前诊断中应用的兴起使人们开始关注基因芯片应用于死胎的价值，并致力于研究导致死胎的遗传学病因。Raca等人采用基因芯片技术成功对细胞培养失败的15存在结构异常的死胎标本进行染色体检测[24]。Uma M等人[25]使用微阵列技术对532例死产胎儿进行染色体分析，染色体异常诊断率提高了41.9％。张慧敏等[26]运用SNP全基因组染色体微阵列分析技术对60列自然流产或死胎的妊娠产物进行检测，结果检测成功率100%，；总共检测出23例异常标本，异常检出率为38.3%。除13例非整倍体（9例常染色体三体，3例XO单体和1例XXY）外，SNP全基因组染色体微阵列分析技术还检测出6例CNV，2例三倍体，1例杂合性缺失（LOH）和1例低水平嵌合体（嵌合比例约20%），将异常检测率提高了16.7%。说明微阵列技术更优于核型分析技术，能检测出死胎亚显微结构的基因组拷贝数变异，为存在结构异常的死胎的遗传学病因诊断提供了更有价值的信息。
SNP微阵列技术无需细胞培养，可以直接对无活力或活力较低的死胎组织进行 DNA 提取和进一步的芯片检测，弥补传统核型分析需要活细胞培养的严格条件，较染色体核型分析大大提高了检测成功率。且其自动化程序高，省时省力，结果分析受人为主观因素影响小，结果可靠。SNP微阵列还能够高通量、高分辨率地检测显微镜下无法识别的基因组细小缺失和重复。因亚显微结构的基因组拷贝数变异是死胎的重要遗传病因[27]。所以运用单核苷酸微阵列技术对死胎进行遗传学分析，并完成此项技术在死胎研究的临床应用，对降低妊娠失败率、为妊娠失败夫妇提供更专业、更人性化的生育指导具有重要意义。
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论文作者:陈梅,马刚,王力川,王锦,莫琳玲,彭丹（通信作者）
论文发表刊物:《健康世界》2018年2期
论文发表时间:2018/4/10
标签：死胎论文; 染色体论文; 基因组论文; 阵列论文; 技术论文; 遗传学论文; 核型论文; 《健康世界》2018年2期论文;