李小玉[1]2002年在《四倍体刺槐高频再生体系的建立及农杆菌介导的甜菜碱醛脱氢酶基因转化的研究》文中进行了进一步梳理四倍体刺槐是韩国培育出的刺槐新品种，属无刺类型，其叶片大小为普通二倍体刺槐的4倍，蛋白质含量为1.4倍多，不但可以作为先锋树种广泛应用于环境美化和生态建设中，还可作为饲料、蜜源和木材等不仅具有较好的生态效益，同时还具有很高的经济价值。为了进一步提高四倍体刺槐的耐盐性和抗旱性，进一步扩大其适宜种植的生态范围，充分发挥其固氮、改良土壤的特性，在我国的城镇绿化、荒山造林、盐碱地改良以及采矿迹地、公路、铁路边坡等植物生长困难土地的植被恢复中发挥其优势，本实验对四倍体刺槐进行了农杆菌介导的甜菜碱醛脱氢酶基因转化的研究。据资料检索，该研究属首次将具有生产意义的目的基因导入四倍体刺槐，也是首次将甜菜碱醛脱氢酶基因导入林木树种，在培育耐盐抗旱型林木品种方面进行了有益的探索。 本实验首先以生长良好的四倍体刺槐优株上当年生新梢的带腋芽茎段为外植体，研究了在四倍体刺槐高频再生体系的建立过程中不同基本培养基、不同激素浓度及其配比、不同蔗糖浓度对愈伤组织的诱导、芽的分化及生根的影响；然后在得到高频再生体系的基础上，通过农杆菌介导法转化甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因，以GUS染色组织分析为依据探讨了影响转化效率的各种因素，建立了高效、可重复的基因转化体系，为四倍体刺槐目的基因的导入打下了基础。试验取得如下研究结果： 1．建立了四倍体刺槐高频再生基因转化受体系统。在四倍体刺槐以茎段为外植体诱导愈伤组织的过程中，以MS+6-BA 1.0 mg.L-1+NAA 0.5mg.L-1+蔗糖30g.L-1效果最好，愈伤组织的诱导率可高达88.4％；在芽的分化中以MS+6-BA2.0mg.L-1+IBA0.2mg.L-1+蔗糖30g.L-1分化率最高，每块愈伤组织的平均分化芽数可达到11.3个；诱导生根以I／2MS+NAA1.0mg.L-1+蔗糖30g.L-1效果最佳，生根率可达95％以上；在移栽时，先在温室中驯化炼苗15～20天后移入大田，成活率可达93％以上。 2．建立了四倍体刺槐高效遗传转化体系。以农杆菌菌株LBA4404介导甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)的转化，首先确定了转化培养中最佳的抑菌素及其浓度和选择压：头孢霉素(Cef)400mg／L可有效地抑制农杆菌菌株 LBA4404的生长；卡那霉素50炒时四倍体刺槐愈伤组织的白化死亡率 达973％。并进一步优化了转化体系：以愈伤组织为外植体，转化效率较 理想；用叩值＊．8）较低的分化培养基 MS历E 刀mg／L＋IBAO．Zing／L 活化农杆菌可提高转化效率；AS可显着提高转化效率，其浓度以 20 t 时效果最好；菌液浓度对转化效率也有影响，以OD。s。值0．3～0．7为宜； 侵染前预培养1～2天，可显着提高转化效率；侵染时间以4～8分钟为宜； 共培养时间3～4天较适合；转化后暗培养对转化效率没有影响；选择方 法以延迟选择15天选择转化率最高。
王文强[2]2003年在《农杆菌介导的四倍体刺槐BADH基因高效转化体系的建立和转基因植株的检测》文中进行了进一步梳理四倍体刺槐是我国于1995年从韩国引进的刺槐新品种，和普通刺槐相比，具有速生、枝密、叶大等特点，有一定的抗旱、耐盐、耐瘠薄、抗风沙能力，是生态建设的先锋树种；同时，叶片蛋白含量高，是很有推广价值的优良饲料。为利用基因工程对四倍体刺槐进行进一步的改良，提高其耐盐、抗旱能力，本实验在已建立的四倍体刺槐高频组培再生体系的基础上，进行了农杆菌介导的甜菜碱醛脱氢酶基因转化的研究。主要结果如下： 1．建立了农杆菌介导的四倍体刺槐高效遗传转化体系。在农杆菌介导的基因转化中，首先确定了最适脱菌素类型及浓度为400mg／LCef、愈伤组织的选择压为50mg／LKan、再生植株的选择压为60mg／LKan。然后以GUS~+阳性发生率、抗性愈伤组织率、抗性芽分化率和抗性植株率为转化指标研究并优化了影响基因转化的各个因子。结果表明：四倍体刺槐的最佳转化外植体为继代20天的愈伤组织、最佳预培养时间为1～2天、适宜的菌液浓度OD_(600)值为0.3～0.7、侵染时间为6～10分钟、农杆菌活化培养基为1／2MS+1／2YEB、共培养培养基为MS培养基、共培养培养基的最适pH值为4.8～5.8、共培养时间为3～4天、乙酰丁香酮的最适用量为20mg／L、最佳选择方法为延迟10天选择。同时，外植体的创伤方式、侵染方式和培养条件等对转化均有影响。 2．转化植株的PCR检测。转化研究获得了大量Kan抗性植株，以未转化植株基因组DNA为阴性对照，质粒DNA为阳性对照，甜菜碱醛脱氢酶基因的两端序列为特异引物进行PCR检测，在316个被检测的Kan抗性株系中有221个株系呈阳性反应。结果表明BADH基因成功、高效、稳定地整合到四倍体刺槐基因组 3.转基因植株的耐盐性检测。在组培条件下，对转基因植株进行了NaCI抗性试验，结果表明:未转化四倍体刺槐愈伤组织在0.5%NaCI浓度下停止分化，转基因四倍体刺槐愈伤组织在0.8%NaCI浓度下基本正常分化，抗盐性提高0.3%~0.4%;未转化四倍体刺槐组培苗在0.3%NaCI浓度下生长受到抑制，在0.4%NaCI浓度下生长受到严重抑制，转基因四倍体刺槐组培苗在O.50/6NaCI浓度下生长基本正常，在0.6%NaCI浓度下生长受到明显抑制，抗盐性提高0.2%~0.3%。说明BADH基因在转基因植株中得到了表达，转基因植株比未转化植株具有更强的耐盐性。同时也进一步证明BADH基因转化的成功。
夏阳, 梁慧敏, 孙仲序, 陈受宜, 王太明[3]2003年在《四倍体刺槐转甜菜碱醛脱氢酶基因的研究》文中认为试验以所建立的四倍体刺槐高频再生体系为基础,通过农杆菌介导法转化甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因,以GUS染色组织分析法为依据探讨了影响转化效率的各种因素,建立了优化转化体系,结果如下:20mg·L~(-1)乙酞丁香酮可显着提高转化效率;菌液浓度OD_(600)值0.3～0.7、预培养2d为宜;转化后暗培养对转化效率没有影响。并在以上研究基础上,成功地建立了高效、可重复的遗传转化体系,选择培养基上头孢霉素400mg·L~(-1)可有效地抑制农杆菌;卡那霉素50mg·L~(-1)时愈伤组织的白化死亡率达96.4％。经PCR检测,外源基因已成功的整合到植株的基因组DNA中,获得了15个转基因株系。
参考文献：
[1]. 四倍体刺槐高频再生体系的建立及农杆菌介导的甜菜碱醛脱氢酶基因转化的研究[D]. 李小玉. 甘肃农业大学. 2002
[2]. 农杆菌介导的四倍体刺槐BADH基因高效转化体系的建立和转基因植株的检测[D]. 王文强. 甘肃农业大学. 2003
[3]. 四倍体刺槐转甜菜碱醛脱氢酶基因的研究[J]. 夏阳, 梁慧敏, 孙仲序, 陈受宜, 王太明. 山东林业科技. 2003