LPHN 3基因与中国汉族人群注意缺陷多动障碍的相关性研究_基因型论文

中国汉族人群LPHN3基因与注意缺陷多动障碍的关联研究，本文主要内容关键词为：汉族论文,中国论文,基因论文,缺陷论文,多动论文，此文献不代表本站观点，内容供学术参考，文章仅供参考阅读下载。

       中图分类号：R749.94 文献标识码：A 文章编号：1000～6729(2015)009～0685～07

       doi:10.3969/j.issn.1000～6729.2015.09.009

       (中国心理卫生杂志，2015，29(9)：685～691.)

       (Chin Ment Health J,2015,29(9):685～691.)

       注意缺陷多动障碍(attention-deficit /hyperactivity disorder，ADHD)是最常见的神经发育障碍性疾病之一，其核心临床表现为注意缺陷、多动和冲动。儿童期患病率为5.29％[1]。ADHD是一种复杂的多基因遗传性疾病，是多个基因共同作用、交互作用的结果，每个易感基因仅发挥微效作用[2]。既往ADHD候选基因研究主要关注的24个热点基因包括：多巴胺(dopamine，DA)系统受体基因(DRD1、DRD2、DRD3、DRD4、DRD5)、转运体基因(SLC6A3)；去甲肾上腺素(NE)系统的受体基因(ADRA2A、ADRA2C)、转运体基因(SLC6A2)；5-羟色胺(serotonin，5-HT)系统的受体基因(HTR1B、HTR2A、HTR2C)、转运体基因(SLC6A4)；合成/代谢酶系统基因(COMT、DBH、MAOA、TPH2、TH、DDC、MAOB、TPH1)；胆碱能系统基因(CHRNA4)、突触相关蛋白基因(SNAP25)及神经营养因子(BDNF)[3]；ADHD全基因组关联研究(genome-wide association study，GWAS)结果提示多数ADHD相关基因涉及细胞粘附/迁移/神经发生、突触可塑性和转录因子[4]；本课题组的GWAS研究发现ADHD样本中存在较多大片段的少见拷贝数变异(copy number variation，CNV)，通路分析结果提示神经发育相关基因，如神经元投射和突触组分，包括细胞粘附分子、谷氨酸突触发育和转录通路可能参与ADHD的病理机制。但ADHD的GWAS研究结果均未达到全基因组水平的显著关联[5]。ADHD属于神经发育障碍性疾病，近5年来，神经发育相关基因与ADHD的关联研究受到研究者们的重视，如LPHN3基因与ADHD的关联。ADHD的危险环境因素主要包括酒精依赖[6]、出生低体重[7]等，ADHD异质性强，病因复杂，其总体遗传度约为0.76[8]，表明遗传因素在ADHD发病中占据重要的地位。

       Latrophilin 3(LPHN3)属于G蛋白偶联受体，与神经发育密切相关，作为突触粘附分子，参与突触细胞间相互作用，轴突导向，突触形成以及突触可塑性的调控，对神经元活动有重要调控作用[9～10]。其编码基因位于染色体4q13.2。LPHN3基因突变小鼠[11]以及LPHN3基因敲低斑马鱼[12]都表现出ADHD相关表型。Arcos-Burgos基于哥伦比亚人群家系的连锁研究中首次发现位于染色体4q13.2的SNP位点可能与ADHD存在关联[13]。随后基于家系和人群的相关研究表明LPHN3基因可能是ADHD的一个危险因素。影像学研究也表明LPHN3在ADHD致病对应的关键脑区表达，影响神经环路中神经元细胞的代谢[14]。以上结果提示，LPHN3可能是ADHD的易感基因之一。本研究首次在中国汉族人群中，采用病例对照的方法，探讨LPHN3与ADHD以及ADHD核心症状之间的关联。

       ADHD病因复杂，异质性强。不同性别[15]、亚型[16]可能遗传机制存在差异。为了降低ADHD异质性对遗传关联的影响，本研究通过精细划分性别、亚型来探讨LPHN3基因对ADHD的致病作用。

       1 对象与方法

       1.1 对象

       ADHD组为2002年9月-2011年8月于北京大学精神卫生研究所儿童门诊就诊儿童。入组标准：符合美国精神障碍诊断与统计手册第4版(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，Fourth Edition，DSM-IV)[17]中ADHD诊断标准，经主治医师以上职称的儿童精神科医师进行确诊，按照美国儿童障碍工作组编制的儿童临床诊断性会谈量表(CDIS)[18]进行临床分型和共患病的评估；采用中国修订韦氏儿童智力量表(Chinese Wechsler Intelligence Scale for Children，CWISC)[19]评定总智商(full-scale Intelligence quotient，FIQ)≥70；父母均为汉族；排除儿童精神分裂症、情感障碍、孤独症、精神发育迟滞及明显的躯体、神经系统异常者；共纳入ADHD患儿1052例，其中男童885例(84.1％)，女童167例(15.9％)，年龄6～16岁，平均年龄(10±2)岁。共患对立违抗障碍(oppositional defiant disorder，ODD)383例(36.4％)，共患学习障碍(learning disorder，LD)365例(34.7％)，共患抽动障碍(tic disorder，TD)168例(16.0％)，单纯ADHD298例(28.3％)。

       对照组来自北京附近的中小学的正常青少年、北京大学医学部学生志愿者、本院工作人员以及北京大学第一医院的健康志愿献血者。入组标准：汉族，排除严重躯体疾病、意识障碍以及ADHD-IV 18条症状量表中注意缺陷型和/或多动冲动条目≥4条、现患或既往有精神疾病及精神疾病家族史、目前有物质滥用或者依赖者。共入组921例，其中男性572例(62.1％)，女性349例(37.9％)。年龄6～53岁，中位数11岁。对照组性别(

=123.28，P＜0.001)年龄(Z=-14.00，P＜0.001)与ADHD组存在统计学差异。

       本研究获得北京大学第六医院伦理委员会的批准。所有受试者均由其本人或其监护人在知情同意情况下签署知情同意书。

       1.2 工具

       1.2.1 中国修订韦氏儿童智力量表(Chinese Wechsler Intelligence Scale for Children，C-WISC)[19]

       采用龚耀先等标化的C-WISC评定ADHD患儿的智力水平，计算总智商(FIQ)。

       1.2.2 儿童临床诊断性会谈量表(Clinical Diagnostic Interview Scale，CDIS)[18]

       为半定式访谈量表，用于评定患儿的临床症状并进行临床分型及共患病的评估。根据DSM-IV的标准该量表将ADHD分为3个亚型：注意缺陷为主型(ADHD-I)、多动冲动为主型(ADHD-HI)和混合型(ADHD-C)。依据CDIS量表对共患病进行评估，包括对立违抗障碍(ODD)、学习困难(LD)及抽动障碍(TD)。

       1.2.3 ADHD评定量表(ADHD Rating Scale)[20]

       该评定量表包括18条ADHD症状，有3个维度，包括注意缺陷分、多动分、冲动分。以DSMIV为依据，每个条目分值等级为0～3分。得分越高，症状越严重。

       1.3 标本采集及SNP位点选取

       1.3.1 标本采集与DNA提取

       采集受试者2mL外周静脉血，EDTA抗凝，通过全血基因组DNA提取试剂盒(OMEGA，美国，货号：D3184-02TM)离心柱法提取基因组DNA。DNA样本均经纯度检测以及浓度标化。

       1.3.2 SNP位点选取及检测

       根据Ensemble(http：//asia.ensembl.org/index.html? redirect=no)上的信息，该基因有26个外显子，外显子包含12636bp。人类基因组单体型图(Hapmap)计划(http//www.hapmap.org)汉族人群遗传学数据提供了541个SNP信息。依据本课题组外显子组芯片的数据及检测结果(未发表)，考虑到统计效率，我们只纳入MAF＞0.10的位点；同时根据既往文献报道[21～22]，筛选出3个SNP：rs2172802、rs11131347以及rs1397548。根据Hapmap中国汉族人群的数据，3个位点的MAF分别是0.378、0.500、0.400。其中rs2172802、rs11131347位于内含子区，rs1397548位于外显子区。

       1.4 统计方法

       采用PLINK1.07软件进行等位基因遗传关联分析。采用Haloview4.2进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验(Hardy-Weinberg Equilibrium，HWE)及基因连锁不平衡域构建。使用SPSS17.0统计软件，计数资料采用

检验，非正态分布计量资料采用独立样本非参数检验。采用协方差分析，对可能存在关联的位点进行基因型与症状间的关联分析，将年龄、性别、亚型和智商作为协变量。自变量是基因型，因变量是ADHD症状，包括注意缺陷分、多动分、冲动分和总分。采用Bonferroni法对等位基因关联分析、基因型关联分析及LPHN3基因与症状之间的关联分析进行校正。等位基因关联分析校正后检验水准设置为0.05/3=0.017)；考虑性别(n=2)及亚型因素(n=2)，基因型校正水准设置为0.05/2×2=0.013；考虑到ADHD四方面的症状，LPHN3基因与ADHD核心症状关联分析的校正后检验水准设置为0.05/4=0.013。通过遗传Power计算软件(http：//pngu.mgh.harvard.edu/-purcell/gpc/)计算统计效率，设置参数：危险基因频率=0.555，prevalence=0.05，OR值=1.3，一类错误α值=0.05，计算所得Power值为42.5％。

       2 结果

       2.1 SNP信息及HWE检验

       通过Haloview4.2软件对对照样本进行计算，得到SNP位点的Hardy-Weinberg平衡(HWE)、最小等位基因频率及位置等详细信息。3个SNPs均符合HWE(P＞0.01)，最小等位基因频率MAF＞0.10(表1)；软件进行基因连锁不平衡域构建。结果显示，3个SNP均为独立SNP(图1)。

      

       2.2 病例—对照关联分析

       分析结果显示，rs11131347与ADHD关联有名义统计学意义[P=0.022，OR=0.86(0.76～0.98)]，最小等位基因C在病例与对照组中的分布频率为0.409 vs.0.445；分性别分析发现，rs11131347与男性ADHD存在显著关联[P=0.012，OR=0.82(0.71～0.96)]，最小等位基因C在病例与对照组中的分布频率为0.402 vs.0.449(表2)。在ADHD女孩中，未发现任意位点的任意等位基因与对照组的分布频率差异有统计学意义(均P＞0.05)。分亚型分析，结果显示rs11131347位点与ADHD-C[P=0.028，OR=0.85(0.74～0.98)]及男性ADHD-C关联存在名义统计学意义[P=0.018，OR=0.82(0.70～0.97)]，最小等位基因C在病例与对照组中的分布频率分别为0.407 vs.0.445及0.401 vs.0.449(表3)。在ADHD-C女孩中，未发现任意位点的任意等位基因在病例与对照中的分布频率存在差异(均P＞0.05)。

       在ADHD-I，男性ADHD-I、女性ADHD-I样本中，均未发现任意SNP位点的任意等位基因在病例和对照中存在统计学差异(均P＞0.05)。

       对等位基因关联分析中存在显著关联或者名义关联的位点进行病例与对照组间基因型频率分布的比较。分别通过加法模型，显性和隐性模型进行基因型的关联分析。基因型分析结果显示，rs11131347位点基因型分布频率在ADHD(隐性模型，P=0.022)、在ADHD男孩(加法模型，P=0.043；显性模型，P=0.045；隐性模型，P=0.038)，ADHD-C(隐性模型，P=0.033)及男孩ADHDC(显性模型，P=0.040)中，病例与对照组的基因型分布频率存在名义统计学意义(表4)。在ADHD-I，男性ADHD-I、女性ADHD-I样本中，未发现基因型分布频率在病例与对照中存在统计学差异。

       2.3 症状的关联分析

       根据等位基因及基因型分析结果，只将rs11131347位点与ADHD核心症状进行关联分析。协方差分析结果显示，rs11131347位点对ADHD冲动症状存在名义统计学差异(P=0.040)。三种基因型冲动症状得分分别为TT(6.9±2.8)、CT(6.7±2.8)、CC(6.2±3.0)，呈现一定的剂量效应。

      

      

      

      

       3 讨论

       本研究病例对照关联分析结果支持LPHN3的rs11131347与男性ADHD存在显著关联；与ADHD、ADHD-C、男性ADHD-C存在关联。为了更深入理解LPHN3基因在ADHD致病过程中的作用，本研究进一步探讨了该基因对ADHD症状的影响。ADHD患者行为表现形式存在差异。而易感基因可能通过不同的机制对症状严重程度存在一定的影响。当症状严重程度达到一定的阈值，可能就会导致疾病的发生。在本研究中，LPHN3基因rs11131347 TT基因型携带者的冲动症状分更高，表明携带该基因型者冲动症状更严重，提示LPHN3可能通过影响ADHD症状而致病。本研究首次在中国汉族样本中验证了LPHN3可能是ADHD的易感基因。

       近5年内已有多项研究支持LPHN3基因可能参与ADHD的致病过程。2010年，Arcos-Burgos首次提出LPHN3可能是ADHD的易感基因，该结果在5个独立样本中都得到了重复验证[14]。Ribases等针对LPHN3基因43个SNP位点，基于西班牙人成人ADHD患者的病例对照研究发现LPHN3的rs6858066位点与ADHD-C存在关联，单体型分析发现由rs1868790/rs6813183/rs12503398构成的单体型与成人ADHD-C相关[22]。Jain等人的研究结果显示LPHN3与11q(包括DRD2和NCAM1基因)的交互作用使得ADHD的发病风险增加，该研究还发现LPHN3～11q之间的交互作用影响神经元代谢以及对中枢兴奋性药物的治疗反应[23]。Acosta等的研究结果表明LPHN3与11q染色体上DRD2、NCAM1之间的交互作用影响ADHD的严重程度以及预后[24]。ADHD基因环境交互作用研究发现LPHN3基因与母孕期焦虑情绪的交互作用可能与ADHD存在关联[25]。Fallgatter等人的研究表明LPHN3基因多态与ADHD完成Go-NoGo任务的质量存在一定的关联[26]。动物实验结果显示LPHN3基因功能异常导致模式动物出现ADHD相关表型。Wallis通过研究出生后第一天LPHN3突变小鼠全脑组织基因表达情况发现，与野生型小鼠相比较，多巴胺和5-羟色胺受体、转运体，神经递质代谢相关基因以及神经发育相关基因表达水平都出现改变。4～6周大的小鼠的背侧纹状体的多巴胺以及5-羟色胺神经递质增多。行为学实验发现，突变小鼠表现出多动行为[11]。斑马鱼的LPHN3基因研究发现通过干扰单细胞期的胚胎，分析6天幼鱼在5min内的游泳距离，游泳速度以及游泳时间，发现经过干扰的幼鱼6天后的游泳距离、时间以及速度都较野生型幼鱼多(快)。这些研究结果都表明LPHN3可能与ADHD发病存在关联[12]。

       ADHD属于神经发育性疾病。Poelmans等人将5项GWAS研究综合进行通路分析，发现大部分ADHD候选基因都介导神经突生长信号通路[27]。本课题组的GWAS研究发现ADHD样本中存在较多大片段的少见CNV，三种通路分析提示一些基因本体细胞组分与ADHD神经发育的病理机制有关，其中包括神经元投射和突触组分，如细胞粘附分子、谷氨酸突触发育和转录通路。这些通路相关蛋白都是粘附分子、谷氨酸受体和影响轴突/突触形成以及发育的蛋白。该结果提示异常的脑神经发育网络，包括神经元迁徙、神经突生长、神经元形态以及突触可塑性等神经元活动异常可能是ADHD的病理机制之一[5]。LPHN3对于突触细胞间信号传递，包括在调节轴突导向，突触形成以及突触可塑性方面都发挥一定的作用。任何基因多态导致的LPHN3基因编码蛋白发生变化都可能导致与ADHD相关的神经活动的异常，从而导致ADHD。

       本研究结果显示LPHN3基因rs11131347位点可能对ADHD冲动症状表现有影响。结果中可看出3个基因型间冲动分差值比较小，分别为CC(6.2±3.0)、CT(6.7±2.8)、TT(6.9±2.8)，呈现一定的剂量效应，说明基因的主效应。本研究结果发现LPHN3基因的rs11131347位点与ADHD、ADHD-C、男性ADHD存在关联；与男性ADHD存在显著关联；基因型分析结果也提示rs11131347基因型频率在ADHD、男性ADHD、ADHD-C、男性ADHD-C中，病例与对照组间分布频率存在差异，但校正后关联消失。通过计算样本的统计效率，Power值为42.5％，统计效率偏低。所以对于此结果的解释需要慎重，有可能是样本量不足导致校正后关联消失。今后研究中需要增加样本量，大样本才能保证高的统计效率。共患病增加ADHD的异质性，可能会影响基因与疾病之间的关联[28]。本研究未进行共患病的基因关联分析，今后的研究中有待于进一步阐述共患病对基因与ADHD关联的影响。

       4 未来研究方向

       本研究只纳入了3个SNPs位点，这3个位点远不足以覆盖LPHN3基因的遗传信息；为了更深入地探讨LPHN3与ADHD之间的关联，需纳入更多的SNP位点进行分析；同时，可以探讨该基因与其他相关基因的交互作用对疾病的影响；本研究样本量较大，但某些精选表型样本量仍然有待于扩充，如单纯ADHD。单纯ADHD排除了共患病的影响，样本纯度较高，有利于揭示基因与ADHD的真实关联，因此后续研究中，可补充单纯ADHD的样本量，验证LPHN3基因在ADHD中的致病机制。

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