摘要 目的 建立牛磺熊去氧胆酸原料药含量的分析方法。方法 采用Thermo Syncronis C18色谱柱（250mm*4.6mm，5μm），流动相为0.02M磷酸二氢钾缓冲液（用磷酸调pH=4.0）：甲醇=35:65流速1.0ml/min，紫外检测器，波长210nm，进样量10μl，柱温35℃。结果 牛磺熊去氧胆酸在0.0459mg/ml～1.3767mg/ml范围内浓度与峰面积呈良好的线性关系(r=-0．9999)；中间精密度良好，RSD=0.65%（n=12）；加样回收率为100.66％，RSD=0.30％(n=9)。结论 采用高效液相色谱法(HPLC)测定牛磺熊去氧胆酸原料药含量，该方法简便准确、精密度和重复性良好，结果准确可靠。
关键词 牛磺熊去氧胆酸含量；高效液相色谱法
熊科动物黑熊经胆囊手术引流而得熊胆汁经干燥制成的熊胆粉，已收载于1989年试行、1996年转为国家正式实行的药品标准[1]，并收载于2015年版《中国药典》附录，作为天然熊胆的替代品入药。而牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）是熊胆粉的有效成分，其化学名为2 -[[（3α，5β，7β）-3，7-二羟基-24-氧代胆甾烷-24-基]氨基]乙烷磺酸二水合物，分子式为C2 H45NO6S·2H20，是由熊去氧胆酸的羧基与牛磺酸的氨基之间缩水而成的结合型胆汁酸,主要用于治疗胆囊胆固醇结石、原发胆汁性肝硬化等。现TUDCA含量的测定方法在药典中未见收载，故本文建立TUDCA含量的HPLC测定方法，该方法简便准确、专属性良好，结果准确可靠。
1.仪器与试药
电子分析天平、高效液相色谱仪、色谱柱（C18，250mm*4.6mm，5μm）、牛磺熊去氧胆酸钠标准品（中国食品药品检定研究院，110816-201509,93.4%）、甲醇（HPLC级）、乙腈（HPLC级）、磷酸二氢钾（AR）、磷酸（AR）、纯净水。
2.方法与结果
2.1色谱条件 以十八烷基键合硅胶为填料；0.02M磷酸二氢钾缓冲液（用磷酸调pH=4.0）：甲醇=35:65为流动相，柱温35℃，流速1．0mL／min，进样量10μl，检测波长为210nm。理论板数按TUDCA峰计算不低于2500。
2.2供试品制备 精密称取本公司研制的牛磺熊去氧胆酸原料药适量，加60%乙腈溶解并稀释制成每1ml含0.5mg的溶液，即得。
2.3对照品溶液制备 精密称取牛磺熊去氧胆酸钠对照品适量，加60%乙腈溶解并稀释制成每1ml含0.5mg的溶液，即得。
2.4专属性考察 将供试品的稀释剂（60%乙腈）作为空白溶液，按上述方法将空白溶液和供试品溶液注入HPLC分析，结果显示空白溶液在TUDCA出峰处无干扰，TUDCA主峰亦无杂质峰干扰，且在供试品下一针接着进一针空白溶液，也未见TUDCA出峰处有干扰峰，说明即使上一针供试溶液有杂质未被完全洗脱，也不会影响下一针供试品溶液的结果检测，如下图空白溶液图谱A和对照溶液图谱B，结果表明，该方法专属性良好。
将以上各溶液依次注入液相色谱仪，记录各主峰峰面积，以测得的峰面积对被测物的浓度作曲线，考察回归曲线的相关系数R，得回归方程为：Y=1.2708E+06X+927.86，相关系数R=0.9999。结果表明：在0.0459mg/ml～1.3767mg/ml范围内，该方法对于TUDCA的浓度与峰面积成较好的线性关系。
2.6精密度考察
2.6.1重复性 取待测供试品按上述供试品制备方法平行制备6份供试品溶液，测定结果，供试品中TUDCA含量分别为：91.92%、90.13%、91.41%、91.64%、91.20%、91.87%，平均值为91.36%，6份检测结果RSD=0.72%，结果表明该方法重复性良好。
2.6.2中间精密度 另一分析员按2.6.1项下方法重复实验，测定结果，供试品中TUDCA含量分别为：92.01%、92.08%、90.67%、91.93%、91.36%、91.77%，平均值为91.64%，6份检测结果RSD=0.59%，两分析员共12份测定结果的RSD为0.65%，结果表明，该方法对于测定TUDCA含量中间精密度良好。
2.7准确度考察 以2.6.1项下测定的结果为供试品中TUDCA的真实含量，精密称取TUDCA供试品12.5mg于50ml容量瓶中，平行9份，精密称取TUDCA对照品256.79mg于100ml容量瓶中，用60%乙腈溶解并稀释至刻度。再分别精密移取上述对照品溶液4.0、5.0、6.0ml至上述容量瓶中，每个浓度平行3份，各取10ul溶液注入液相色谱仪分析，测得回收率结果如下：
各组的溶液回收率平均值为100.66%，RSD=0.30%，结果表明该方法对于TUDCA含量测定的准确度高，结果可靠。
3.讨论
3.1流动相的选择 流动相采用0.02M磷酸二氢钾缓冲液（用磷酸调pH=4.0）：甲醇=35:65，参考文献[2]中使用的流动相有机相为乙腈，但参考了其他文献[1]，以及考虑到乙腈的毒性、经济性以及其粘性对仪器的损伤，最终选择较为常用的甲醇。
3.2检测器以及波长的选择 检测器选择紫外检测器，波长采用210nm，有其他文献[3]选择ELSD检测器,但考虑到检测结果计算的简便性、稳定性等因素，最终采用紫外检测器；而TUDCA仅有末端紫外吸收，为减小溶剂效应的影响，检测波长采用210nm。
3.3本文中提及的供试品为牛磺熊去氧胆酸的二水化合物，在计算含量以牛磺熊去氧胆酸计，并未扣除结晶水，故含量偏低。
3.4因对照品为牛磺熊去氧胆酸钠，而本文供试品中有效成分为牛磺熊去氧胆酸，因此，在计算时需乘以转换系数0.9578.
4.结论 该方法简便准确、专属性、耐用性良好，能够准确的检测出TUDCA的含量。
参考文献
[1].李家泉 郑昆芳.HPLC法测定熊胆汁中牛磺熊去氧胆酸含量的研究--《云南中医中药杂志》2016年第10期78-80.
[2].孙文霞 黄毅岚 张丹.RP—HPLC法测定熊去氧胆酸中的有关物质--《药物分析杂志》2007年第4期590-592.
[3].赵勇 昝丽霞 孙文基.HPLC—ELSD法测定熊胆粉中牛磺熊去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸的含量--《药物分析杂志》2006年第1期127-129.
论文作者:李慧云
论文发表刊物:《科学与技术》2019年第05期
论文发表时间:2019/7/31
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