何新华[1]2004年在《CD4抑制剂的设计与合成及其免疫抑制作用》文中提出器官功能衰竭已经成为一类严重威胁人类生命和生活质量的常见疾病。而器官移植是脏器功能衰竭终末期的有效且必须的治疗手段。经过半个多世纪的发展，器官移植取得了巨大的成就，给无数患者解除了痛苦，延长了生命，提高了生活质量。展望21世纪，器官移植作为外科领域的发展重点，将得到进一步提高，并为人类的健康做出更大的贡献。 当前，外科手术和器官分离与保存技术日益成熟、完善，而移植物的排斥反应成为器官移植发展的瓶颈。患者在移植手术后须终生服用免疫抑制剂，因此，研究和发现高效低毒的免疫抑制剂就尤为重要。 现代免疫学发现移植排斥反应的本质是受者的T细胞介导的针对移植抗原的免疫应答。在各类同种异基因移植排斥反应过程中，CD4+T细胞都扮有重要的的角色，而T细胞(包括CD4+T细胞)的活化需要两种信号的刺激，其中，TCR与抗原肽／MHC分子复合物的形成是关键的信号之一。在该复合物的形成过程中，CD4分子与MHC-Ⅱ类分子的结合是其稳定的一个重要条件。故抑制CD4活性形式的形成或阻断CD4与MHC-Ⅱ类分子的结合就不能形成稳定的TCR与抗原肽／MHC分子复合物，从而导致T细胞的活化需要双信号刺激中的一个关键信号无能，因而可以预防或抑制同种异基因移植排斥反应。CD4抑制剂作为一种具有全新机理的免疫抑制剂被给予厚望。 本论文以李松等发现的CD4免疫抑制剂TJU103为先导化合物，运用传统的药物设计和计算机辅助药物设计相结合的方法对先导化合物进行了结构优化设计。首先，我们综合运用传统的药物设计方法，如剖裂，拼合，同系物变换，开环或关环，引入烯键，引入、去除或置换大基团，改变基团的电性、经典或非经典生物电子等排等方法构建改造物
吕国凯[2]2009年在《海洋糖脂glycolipids simplexides和系列鞘糖脂类化合物的合成及其生物活性研究》文中研究说明糖脂(glycolipids)是指含有糖基配体的脂类化合物,依脂质部分的不同可分为鞘糖脂(glycosphingolipids,GSL)、甘油糖脂(glycoglycerolipids)、含有磷酸多萜醇衍生的糖脂(polyprenol phosphate glycoside)和类固醇衍生的糖脂(steryl glycoside)。糖脂及其衍生物被认为在细胞生长、分化、凋亡方面具有重要的调节作用,并且某些是潜在的治疗药物。已有证据表明糖脂分子参与免疫应答过程。免疫抑制剂在临床上主要用于治疗自身免疫性疾病和防止脏器移植排斥,但目前常规使用的免疫抑制类药物大多治疗窗狭窄、价格昂贵,而且多具严重毒副作用,因此新型免疫抑制剂的开发研究已成为医药研发领域的热点。本文主要对具有免疫抑制活性的海洋天然糖脂glycolipids simplexides及系列鞘糖脂类衍生物进行了合成和生物学方面的研究,以期探究此类化合物的构效关系,为开发新型免疫抑制剂奠定坚实基础。(1)本文发展了一条简洁高效的(1→4)-分枝半乳糖脂的合成路线,采用“一锅法”合成策略,首次完成了具有免疫抑制活性且结构新颖的叁个海洋糖脂bis(hexadecyl)methyl 4-O-(α-D-glucopyranosyl)-β-D-galactopyranoside (1a) ,bis(heptadecyl)methyl 4-O-(α-D-glucopyranosyl)-β-D-galactopyranoside (1b)和bis(octadecylselyl)methyl 4-O-(α-D-glucopyranosyl)-β-D-galactopyranoside (1c)的全合成。发展了p-methylphenyl 2, 3, 4 tri-O-benzyl-6-O-tert-butyldiphenylsilyl -1-thio-β-D-glucopyranoside供体,利用该供体可以高选择性的形成葡萄糖α-糖苷键。通过改变两步糖苷化反应体系这一关键步骤,以较高的“一锅法”糖苷化产率得到前体化合物18a-c,脱除保护基后便得目标化合物1a-c。(2)本文设计并合成15个鞘糖脂类衍生物:β-半乳糖鞘糖脂及不含脂肪酸的β-半乳糖鞘糖脂,鞘氨醇种类包括神经鞘氨醇、二氢鞘氨醇及植物鞘氨醇;半乳糖2-OH衍生化的鞘糖脂;鞘氨醇长链衍生化的鞘糖脂。找到一条通用的、适合不同糖基供体的合成二氢鞘糖脂的路线。由关键中间体34出发,Pd/C氢解后得到双键还原及苄基脱除的化合物35,35与迭氮化钠发生SN2历程的亲和取代反应,迭氮基亲核取代35上的磺酸酯后,构型发生翻转,得到含有迭氮基的二氢鞘氨醇36。36经过保护基操作后便可直接用于糖苷化反应。发展了3, 4, 6-tri-O-acetyl-2-O-Lev-α-D-galactopyranosyl trichloroacetimidate供体,利用该供体可以简便有效的制备2-OH衍生化的半乳糖鞘糖脂。(3)通过对T1-T20的抗真菌(Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida tropicalis)活性测定,初步了解了二氢鞘氨醇的抗真菌构效关系:①游离氨基是活性必须基团;②糖基部分在此处不仅是作为药动基团,而且有可能是药效基团,与抗真菌活性的特异性具有重要关系。③疏水性长链脂肪烃为活性必须结构。
伦玉宁[3]2013年在《四氢嘧啶类化合物ZL-5015的免疫抑制作用及其作用机制研究》文中提出目的新型四氢嘧啶类化合物ZL-5015(1,3-二环戊基-1,2,3,6-四氢嘧啶-4,5-、甲酸二乙酯)兼具抗炎和免疫抑制活性,本研究采用体内和体外实验模型探讨ZL-5015的免疫抑制作用特点及作用机制,为后续的结构改造及深入的作用机制研究提供参考信息。研究内容1.ZL-5015对正常小鼠免疫功能的影响1.1对体液免疫功能的影响---兔红细胞免疫小鼠产生血清溶血素(IgM)模型1.1.1材料与方法BALB/c小鼠50只,随机分为5组,各组动物均连续7天给药,给药后第2天上午,每只鼠腹腔注射20%(V/V)的兔红细胞生理盐水0.2ml进行免疫,同日下午继续给药,免疫后第6天(免疫当天为第0天),动物摘眼球取血,分光光度法检测各组小鼠血清中的溶血素水平。1.1.2结果ZL-5015高、中剂量组(200.100mg/kg.b.w)能明显抑制小鼠血清溶血素水平,抑制率分别为32.8%和20.0%(P=0.000,P=0.000),ZL-5015低剂量组(50mg/kg.b.w)能轻微抑制小鼠血清溶血素水平,但与溶媒对照组比较差异无统计学意义(P=0.131)。1.2对细胞免疫功能的影响---二硝基氟苯(DNFB)诱导小鼠迟发型超敏反应(DTH)模型1.2.1材料与方法BALB/c小鼠50只,随机分为5组,给药第一天用1%DNFB致敏小鼠,连续给药7天,于致敏后第7天,取1%DNFB丙酮-橄榄油(1：1)20gL均匀涂布于每只小鼠右耳的两面进行攻击。于攻击24h后,给小鼠称重,颈椎脱臼处死,剪下左右耳廓,以左右耳片质量差值作为肿胀度,并计算肿胀率。取出脾脏和胸腺称重并计算相应的器官指数。1.2.2结果ZL-5015高、中、低剂量组(200、100、50mg/kg.b.w)与模型组比较,均能显着抑制二硝基氟苯诱导的小鼠耳廓肿胀(P=0.000,P=0.000,P=0.015),抑制率分别为：56.45%、47.58%、29.84%。ZL-5015高剂量(200mg/kg.b.w)能抑制小鼠的脾脏指数(P=0.013),中、低剂量组(100、50mg/kg.b.w)无抑制作用(P=0.482,P=0.418)。ZL-5015高、中、低剂量组(200、100.50mg/kg.b.w)对小鼠的胸腺指数无显着影响(P=0.384,P=0.527,P=0.570)。1.3ZL-5015对网状内皮细胞(巨噬细胞)吞噬功能的影响(碳粒廓清实验)1.3.1材料与方法BALB/c小鼠50只,随机分为5组,连续给药7天。末次给药1h后,先称小鼠体重,每只小鼠尾静脉均注射印度墨汁(用生理盐水稀释6倍),按0.1ml/10g注射。分别于注射后于1min(t1)和10min(t10)小鼠眼球取血,检测OD450值,最后将小鼠颈椎脱臼处死,同时摘取小鼠肝脏、脾脏,并称湿重,计算廓清指数(K)及吞噬指数(A)。1.3.2结果化合物ZL-5015高、中、低剂量组(200、100、50mg/kg.b.w)对小鼠吞噬指数A无明显影响(P=1.000,P=0.999,P=1.000)。2.ZL-5015对大鼠佐剂性关节炎模型的影响2.1ZL-5015对大鼠佐剂性关节炎模型关节炎指数、足趾肿胀度、体重的影响2.1.1材料与方法雌性SD大鼠48只,随机分为6组,每只鼠左后足趾皮内注射100μL弗氏佐剂,致炎后第16天开始给药和测量,共给药12天。采用排水法测足部体积：在大鼠足部踝骨关节突出部位划一条线作为标记,用足趾肿胀仪测量,间隔4天测一次足趾肿胀情况及体重。SD大鼠免疫后,根据大鼠四肢关节炎症的红、肿及硬化程度,计算多发性关节炎指数。2.1.2结果致炎后第20天,ZL-5015高剂量(200mg/kg.b.w)处理组关节炎指数与模型组比较明显下降,下降率为20.0%(P=0.010),说明此时高剂量药物开始起效。对足趾肿胀及体重无显着影响。致炎后第24天,ZL-5015高、中、低剂量(200、100、50mg/kg.b.w)使关节炎指数分别下降34.5%、25.0%、19.0%(P=0.000,P=0.001,P=0.010)。高剂量能使足趾肿胀度下降49.5%(P=0.048),中、低剂量使足趾肿胀度分别下降40.4%及21.5%,但无统计学意义(P=0.194,P=0.845)。对体重有增重趋势,但差异无统计学意义。致炎后第28天,ZL-5015高、中、低剂量(200、100、50mg/kg.b.w)使关节炎指数分别下降43.0%、36.7%、26.6(P=0.000,P=0.000,P=0.001)。高、中剂量使足趾肿胀分别下降54.0%及48.7%(P=0.034,P=0.041),低剂量下降39.4%,但差异无统计学意义(P=0.150)。对体重有增重趋势,但差异无统计学意义。2.2ZL-5015对弗氏佐剂关节炎大鼠血清促炎细胞因子的影响2.2.1材料与方法于佐剂关节炎造模第28天,股动脉取血,3000rpm离心10min,取上清,ELISA方法检测IL-1β及TNF-α活性2.2.2结果ZL-5015高、中剂量(200、100mg/kg)与模型组比较,均可显着降低关节炎大鼠血清IL-1β的水平(P=0.006,P=0.049),且有浓度依赖趋势,抑制率分别为：27.0%,19.1%；ZL-5015低剂量组(50mg/kg)可以轻微降低大鼠血清IL-1β的水平(P=0.426)。ZL-5015高、中剂量组(200、100mg/kg)均可以显着降低大鼠血清TNF-a的水平(P=0.000,P=0.005),且有浓度依赖趋势,抑制率分别为：29.2%,21.6%；ZL-5015低剂量组(50mg/kg可以轻微降低大鼠血清TNF-α的水平,但差异无统计学意义(P=0.173)。2.3ZL-5015对关节炎部位促炎细胞因子的影响2.3.1材料与方法于造模第28天,大鼠断头处死,在非致炎侧踝关节上方0.5cm处摘取肿胀的足爪,剪碎,生理盐水浸泡过夜,离心取上清,ELISA方法检测IL-1β及TNF-a活性。2.3.2结果ZL-5015高、中剂量(200、100mg/kg)与模型组比较,均可显着减少关节炎部位IL-1β的含量(P=0.000,P=0.019),且有浓度依赖趋势,抑制率分别为：30.3%,19.3%；ZL-5015低剂量(50mg/kg)可以轻微减少炎症部位IL-1β的含量,但差异无统计学意义(P=0.123)。ZL-5015高、中、低剂量组(200、100、50mg/kg)均可显着减少炎症部位TNF-α的含量(P=0.000,P=0.004,P=0.039),且有浓度依赖趋势,抑制率分别为：31.9%,22.0%和15.2%。3.ZL-5015对淋巴细胞功能的影响3.1ZL-5015对Con A和LPS诱导小鼠脾细胞增殖反应的影响3.1.1材料与方法Balb/c小鼠两只,常规制备脾细胞悬液,Con A(4μg/ml)和LPS(10μg/ml)刺激小鼠脾细胞增殖作为体外免疫模型,检测给药48小时后各组细胞的代谢活力。3.1.2结果ZL-5015高、中、低剂量均可以显着抑制Con A诱导的小鼠脾细胞增殖反应,(P=0.000,P=0.000,P=0.000),且有浓度依赖趋势,抑制率分别是：33.10%、21.0%和13.28%。ZL-5015高、中剂量组均可以显着抑制LPS诱导的小鼠脾细胞增殖反应(P=0.000,P=0.000),且有浓度依赖趋势,抑制率分别是：25.90%、14.95%,ZL-5015低剂量组有轻微抑制LPS诱导的小鼠脾细胞增殖反应的趋势,但差异无统计学意义(P=0.087)。3.2ZL-5015对混合淋巴细胞培养反应的影响3.2.1材料与方法将BALB/c小鼠和C57BL/6J小鼠的脾细胞分别制成悬液,按照1：1混合制成细胞浓度为6x106个/mL的细胞悬液,按分组加入药物,用96孔培养板培养72h后各组细胞的代谢活力。3.2.2结果ZL-5015高、中、低剂量组均可以显着抑制混合淋巴细胞的增殖反应(P=0.000,P=0.000,P=0.037),且有浓度依赖趋势,抑制率分别是：37.2%、17.4%和5.0%。3.3ZL-5015对Con A刺激小鼠脾细胞分泌白介素2和干扰素γ的影响3.3.1材料与方法Balb/c小鼠两只,常规制备脾细胞悬液,Con A(4μg/ml)刺激小鼠脾细胞活化,检测给药48小时后各组细胞中上清液白细胞介素2和干扰素γ的含量。3.3.2结果ZL-5015高、中、低剂量组(40、20、10μM)均可显着抑制Con A诱导的小鼠脾细胞分泌白介素2(P=0.000,P=0.000,P=0.007),且有浓度依赖趋势,抑制率分别是：29.37%、20.31%和11.35%。ZL-5015高、中、低剂量组(40、20、10μM)均可以显着抑制Con A诱导的小鼠脾细胞分泌干扰素γ(P=0.000,P=0.002,P=0.030),且有浓度依赖趋势,抑制率分别是：31.9%、23.6%和15.9%。3.4ZL-5015对小鼠脾细胞细胞因子mRNA表达的抑制作用3.4.1材料与方法Balb/c小鼠两只,常规制备脾细胞悬液,Con A(4μg/ml)刺激小鼠脾细胞活化,使用荧光定量PCR检测给药48小时后各组细胞中白细胞介素2和干扰素γmRNA表达的变化。3.4.2结果ZL-5015(40.20.10μM)可抑制由Con A诱导的IL-2mRNA的表达(P=0.010,P=0.024,P=0.048)。ZL-5015(40、20、10μM)可抑制由Con A诱导的INF-γmRNA的表达(P=0.005,P=0.013,P=0.043)。3.5ZL-5015对LPS刺激小鼠脾细胞分泌IgG1和IgG2a的影响3.5.1材料与方法Balb/c小鼠两只,常规制备脾细胞悬液,LPS(10μg/ml)激小鼠脾细胞活化,各组给药作用48小时后,收集培养上清液检测IgGl和IgG2a的含量。3.5.2结果ZL-5015高、中剂量组(40、20μM)均可以显着抑制LPS诱导的小鼠脾细胞分泌IgGl,(P=0.000,P=0.001),且有浓度依赖趋势,抑制率分别是：27.8%、18.0%；ZL-5015低剂量组(10μM)可以轻微抑制LPS诱导的小鼠脾细胞分泌IgGl,但差异无统计学意义(P=0.105)。ZL-5015高、中、低剂量组(40、20、10μM)均可以显着抑制LPS诱导的小鼠脾细胞分泌IgG2a(P=0.000,P=0.000,P=0.011),且有浓度依赖趋势,抑制率分别是：31.6%、22.7%和13.7%。3.6ZL-5015对T细胞亚类的影响3.6.1材料与方法脾细胞制备、实验分组及给药均同3.5.1所述,48小时后收集细胞,用荧光标记的抗小鼠CD3、CD4、 CD8抗体染色,流式细胞仪检测。统计方法3.6.2结果ZL-5015主要降低Con A诱导的CD4弱表达和CD3弱表达T细胞亚群(CD4LowCD3Low)的比例。统计学处理应用SPSS11.5统计软件进行统计分析。T细胞亚类占细胞总数的比例以百分数表示,先采用RxC表资料的卡方检验对各组细胞的百分率差异进行多组间的总体检验,然后采用四格表资料的卡方检验进行组间细胞百分率的两两比较。定量数据结果以均数±标准差表示,采用单向方差分析法分析,先进行方差齐性检验,若方差齐用LSD方法多重比较；若方差不齐,采用Welch F检验和Dunnett's T3法多重比较。显着性水准取α=0.05,以P<0.05时,组间差异具有统计学意义。结论1、ZL-5015可降低兔红细胞诱导小鼠产生血清溶血素的活性,降低二硝基氟苯诱导的小鼠耳廓的肿胀度,对小鼠碳粒廓清的速率无明显影响,提示对小鼠的体液免疫及细胞免疫功能有抑制作用,对非特异性免疫功能无影响。2、ZL-5015可以减轻弗氏佐剂关节炎模型的关节炎指数,足趾肿胀,提示对类风湿关节炎具有一定的临床应用前景。3、ZL-5015可以减少弗氏佐剂关节炎模型血清及炎症部位中的促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的含量,提示对佐剂性关节炎的治疗作用与抑制促炎细胞因子的产生与关。4、ZL-5015可抑制Con A和LPS诱导的小鼠脾细胞的增殖反应,提示对T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖反应有直接的抑制作用。5、ZL-5015可以显着抑制混合淋巴细胞的增殖反应(代谢活力),提示对特异抗原诱导的淋巴细胞增殖反应有直接的抑制作用。6、ZL-5015可以显着抑制Con A诱导的小鼠脾细胞分泌白介素2和干扰素γ,提示其免疫抑制作用与抑制细胞因子的产生与分泌有关。7、ZL-5015可抑制由Con A诱导的IL-2及INF-y mRNA的表达,提示其抑制细胞因子产生的作用环节在mRNA表达水平。8、ZL-5015可以显着抑制LPS诱导的小鼠脾细胞分泌IgGl和IgG2a,提示其可直接作用于B淋巴细胞而抑制抗体的产生。9、ZL-5015可降低Con A诱导的CD4弱表达和CD3弱表达T细胞亚群(CD4LowCD3Low)的比例,提示其作用机制可能是抑制CD4+CD3+细胞的活化与增殖,从而抑制免疫反应。10、总之,ZL-5015对体液和细胞免疫反应均有抑制作用,对T和B淋巴细胞的增殖与分泌功能具有直接抑制作用,对自身免疫性疾病动物模型有效,但需要高剂量(100mg/kg以上),与现有临床药物相比其作用强度还不够理想,需要进一步结构改造。
吕庆康[4]2016年在《吗替麦考酚酯在炎症性肠病中的作用及对相关细胞因子的影响》文中研究说明炎症性肠病(IBD)是一种慢性复发性消化道紊乱性炎症,它可分为克罗恩病(Crohn’s,CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)两种类型。IBD以免疫反应失调,细胞因子的产生发生改变和细胞炎症为特征,最终导致小肠末端和结肠粘膜的损伤。当前,IBD的发病机理非常复杂且仍然未知,但是它与许多因素有关,例如免疫、遗传、肠道环境和细菌感染等。尤其是免疫学因素已经被发现在炎症性肠病的持续发展和发病机理中起着相当重要的作用。近年来,CD4+T细胞亚群(Th1/Th2)失衡导致促炎和抗炎细胞因子比例失调和免疫反应异常的假说被广泛接受并在IBD的发病机理中具有重要的作用。吗替麦考酚酯(Mycophenolate mofetil,MMF),麦考酚酸的2,4-吗啉代乙酯,是一种新型的免疫抑制药物,并且已经证明在治疗同种异体移植接受者和多种自身免疫紊乱的病人时相当有效。在肝脏中,吗替麦考酚酯(MMF)被转化成MMF的活性形式吗替麦考酚酸(MPA)。吗替麦考酚酸是嘌呤从头合成途径关键限速酶——2型次黄苷酸脱氢酶的非竞争性可逆性抑制剂。MMF能选择性抑制T、B淋巴细胞的增殖,因为它们不像其他类型的细胞能够通过补救途径再循环利用核苷酸,T、B淋巴细胞仅仅能依靠核苷酸的从头合成途径合成嘌呤。因此,MMF的作用可以认为是抑制这类特定的细胞群的增殖。MMF能减少淋巴细胞和单核细胞的募集,从而减少体内炎症部位TNF-α和IL-1β的产生。MMF仅有很低的毒性,其在IBD病人上的使用,特别是在对类固醇依赖,难治或对常规治疗不耐受的病人上使用已经有记录。然而MMF在IBD发生发展中的作用及其免疫抑制的机制尚不明确。本研究将BALB/c小鼠随机分为正常组、对照组、TNBS组、灌胃组和腹腔注射组5个组,使用叁硝基苯磺酸(TNBS)诱导小鼠的IBD模型,然后分别在第-1、0、1、2和7天的时候通过灌胃和腹腔注射的方式给予不同剂量的MMF(1mg或2mg/只)。记录小鼠10天的体重和死亡率的变化。分别在第3天和第10天的时候杀死小鼠,采集小鼠的血液和结肠组织,使用q PCR和ELISA方法检测血清和结肠组织中相关细胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-12、IL-6、IL-1β和IL-10)表达的变化及观察结肠组织评分、MPO活性和病理组织切片的变化。收集实验组小鼠的脾淋巴细胞和体外MPA刺激后的正常小鼠脾淋巴细胞,通过流式细胞术分别检测在体和离体情况下,MMF对小鼠脾淋巴细胞特别是CD4+T细胞分化的影响。通过以上试验以期明确MMF在IBD中的免疫抑制机制。结果表明,MMF的治疗不仅能明显改善小鼠腹泻和体重减少等症状,而且缓解了病理组织学的严重性并减轻了结肠的炎症反应,增加了TNBS诱导的结肠炎小鼠的存活率。此外,MMF可明显抑制TNBS诱导的结肠炎小鼠的促炎细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-12、IL-6和IL-1βm RNA的表达,但是MMF没有抑制IL-10 m RNA的表达。ELISA结果表明MMF处理后的TNBS模型组小鼠血清IFN-γ、TNF-α、IL-12、IL-6和IL-1β的水平被显著下调。流式细胞术分析表明MMF可明显减少IBD模型小鼠的Th1/Th2淋巴细胞的比例,在体外试验中,MPA也可明显减少脾淋巴Th1/Th2细胞的比例。这些结果表明MMF的治疗可改善实验性结肠炎,并可通过调节Th1/Th2细胞的分化,下调促炎细胞因子的表达从而诱导IBD炎症反应的缓解。
刘剑[5]2011年在《受体来源大鼠ADSCs分化的类肝细胞诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究》文中指出第一部分大鼠原位肝移植模型的建立目的：建立稳定的大鼠肝移植反应模型的方法,为肝移植的相关研究提供稳定可靠的模型基础。同时对比DA→Lewis与SD→SD大鼠组合,了解高排斥反应组合模型DA-Lewis术后的生存率和生存时间。为进一步的实验摸索条件。方法：通过Kamad“二袖套法”,建立大鼠肝移植模型。并观察大鼠术后存活率和并发症的发生情况。第一阶段：进行200次双人肝移植训练,主要是熟悉手术过程,总结经验,同时对二袖套管法进行改进；第二阶段：进行了DA→Lewis与SD→SD大鼠组合肝移植对比,对比一般状态、生存期、肝功能、病理表现。结果：总共实施大鼠原位肝移植248例,在训练阶段主要要克服麻醉问题,血管吻合问题,如何缩短无肝期以及无肝期结束后的管理问题；在成熟期时手术,供体手术时间(35.78±5.78)min,热缺血时间(0.5±0.22)min,供肝修整时间(15.13±3.45)min,受体手术时间(57±16.5)min,受体手术开始至无肝期开始(37±7.11)min,无肝期为(21.33±3.65)min,无肝期结束至关腹(13.98±3.83)min,手术成功率为93.5%,成功地建立了稳定的大鼠肝移植模型。在正式实验中DA-Lewis表现出高排斥反应的表现,存活时间短,平均时间为8.900±0.390天,术后肝功能急剧上升,病理表现出明显的重度排斥反应。结论：大鼠原位肝移植模型的建立,需要在一定的显微外科基础和熟悉大鼠的腹部解剖结构的前提下,经过4-6月的不间断训练,方能获得成功。正确的供肝灌注、严密的腹腔止血、熟练的显微血管缝合技术、尽量缩短的无肝期、完善的术中补液纠酸及术后复温是保证手术成功的关键。DA-Lewis组合可以成功地复制出大鼠高排斥肝移植模型。第二部分大鼠脂肪源性干细胞诱导形成的类肝细胞的免疫调节作用的体外实验研究目的：在脂肪源性干细胞传统的分离方法的基础上进行改进,克隆筛选纯化脂肪源性干细胞；建立大鼠脂肪源性干细胞转化为类肝细胞的程序化诱导体系。并在诱导过程中观察细胞分化的变化及对类肝细胞功能进行鉴定；并进一步研究该类肝细胞的免疫特性并探讨可能的机理。方法：1.消化离心法分离Lewis大鼠脂肪源性干细胞,有限密度稀释法克隆化及条件培养基筛选,进行原代培养,以克隆筛选的脂肪源性干细胞为实验组,未克隆筛选的脂肪源性干细胞为对照组,观察细胞形态,对比生长曲线、倍增时间,流式细胞仪鉴定脂肪源性干细胞表面标记CD49d、 CD34. CD44。2.将分离纯化的Lewis大鼠脂肪源性干细胞,分叁个阶段加入含有FGF-4、 FGF-a. HGF及OSM细胞因子的诱导培养体系中,使脂肪源性干细胞向肝细胞转化。用RT-PCR检测ALB、 AFP及CK18mRNA的动态变化,进一步采用免疫荧光组织化学法及对氨的代谢及尿素合成能力鉴定该细胞向肝细胞转化的性能。3.检测诱导前后的Lewis大鼠脂肪源性干细胞对DA/lewis大鼠脾T淋巴细胞混合培养体系的免疫调节作用,并检测上清液中的IL-2、IL-10的浓度。结果：1.经克隆筛选的脂肪源性干细胞与未经克隆筛选的脂肪源性干细胞相比,前者形态均一,生长力旺盛,倍增时间短,多代培养后生长曲线无明显改变,通过流式细胞仪鉴定,实验组与对照组在3-6代之间均表达表面标记CD49d、CD44, CD34亻(?)表达。2.纯化后的脂肪源性干细胞大鼠脂肪源性干细胞通过向肝细胞的分段诱导方案,在0、14、21、28d分别检测ALB、AFP及CK18mRNA的表达,表达随诱导的延长而增强,通过荧光免疫分析,类肝细胞具有合成白蛋白的功能。对氨的代谢和尿素的合成功能在9-12d出现并持续存在。3.通过混合淋巴细胞培养以DA大鼠脾T淋巴细胞为刺激细胞,Lewis大鼠脾淋巴细胞为反应细胞的体系中淋巴细胞的增殖反应受到Lewis大鼠脂肪源性干细胞的抑制,抑制的强度与干细胞的浓度正相关,与是否诱导无关。结论：结果证实克隆筛选的纯化方法是脂肪源性干细胞原代培养的有效、经济的纯化方法。脂肪源性干细胞在体外通过阶段诱导可成功转化为类肝细胞,该诱导分化方法可为肝细胞移植、肝组织工程等临床治疗提供一个有效可靠的种子细胞来源。经过纯化的脂肪源性干细胞在体外可以成功转化为类肝细胞,该细胞同时具有干细胞下调免疫反应及肝细胞的特征的双重特性。第叁部分脂肪源性干细胞诱导形成的类肝细胞对大鼠肝移植免疫排斥的影响目的：在大鼠原位肝移植高排斥模型(DA→Lewis)术中经门静脉注入由脂肪源性干细胞诱导形成的类肝细胞之后,研究由脂肪源性干细胞诱导形成的类肝细胞在移植肝的定位,及其对受体肝功能、免疫排斥、生存期的影响,初步探讨脂肪源性干细胞及其分化而来的类肝细胞运用于器官移植的安全性、效能以及机制。方法：1.随机DA与Lewis大鼠分为4组,每组各31对,采用改良Kamada两袖套法建立DA-Lewis大鼠肝移植模型：a.A组(排斥组)行原位肝移植术；b.B组(免疫抑制组)行原位肝移植术+口服他克莫司胶囊FK506(0.15mg/kg/d,灌胃1次/d×14d,术后2d开始)；c. C组行原位肝移植术+术中门静脉输注ADSCs:d.D组行原位肝移植+术中门静脉输注诱导后的类肝细胞；2.观察并记录每组实验大鼠的一般情况(大鼠皮毛、眼睛色泽、活动和精神状态)；每组各留6只观察生存期；3..每组术后第3、7、10、14天随机活杀6只大鼠,进行抽血,测定肝功能并用ELISA法测定外周血的细胞因子(IL-2、INF-Y、IL-10及IL-4)水平；4.用BrdU体外标记脂肪源性干细胞及类肝细胞,并用免疫荧光染色单标及双标记的方法了解BrdU标记的成功与否,在4个时相点将一部分肝组织制作成冰冻切片,行BrdU免疫荧光检测,了解类肝细胞在肝脏中的定位情况；5.取每只大鼠肝脏组织做成石蜡切片,HE染色光镜下观察,并计算排斥指数了解移植肝的排斥程度；6.于实验第30d将实验各组中尚存活的大鼠中,挑选出状态最好的大鼠进行取材,行混合淋巴培养,了解术后T淋巴细胞增殖能力。用流式细胞仪测定各组CD4+、CD8+变化,计算CD4+/CD8+。结果：1.4组均在相同的条件下采用相同的手术方式(改良两袖套法)建立动物模型,在术前体重及手术时间的比较4组间无明显差异(P>0.05),即具有可比性。存活率为94.66%(124/131)。2.从术后3天以细胞核BrdU染色阳性的脂肪源性干细胞及其形成的类肝细胞开始出现,散在分布于肝组织,同时有部份阳性细胞密集于汇管区及血管旁,随着时间的延长,逐渐形成灶状分布。3.B、C、D组中位生存时间明显高于A组(对照组),均存在统计学差异(P<0.05),D组中位生存时间最长,与C组相比有统计学意义,与B组相比无统计学差异。4.移植术后各组大鼠血清生化检查：在移植术后3、7、10d, B、C、D组肝功能逐渐好转,A组ALT、AST、TBIL急剧上升,与存活时间表现一致。在术后第14天,A组动物已完全死亡,数据缺失；B、C、D组肝功能进一步恢复,B、D组恢复较快,C组较慢,在部分指标(ALT、AST) D组优于B组(P<0.05)。5.A组IL-2、INF-Y明显高于其它各组(P<0.05), B、C、D组水平逐渐下降,B、D组与C组比较,下降更明显(P<0.05),B、D组之间无明显差异(P>0.05)；A组IL-10及IL-4明显低于其它各组(P<0.05), B、C、D组水平逐渐升高,B、D组与C组比较,升高更明显(P<0.05)。6.肝脏病理示术后7d、10d,A组的急性排斥评分明显高于B、C、D组(p<0.05),B、D组随着时间延长,呈下降趋势,但两者之间无明显差异(P>0.05),C组排斥指数高于B、D组(P<0.05)。7.混合淋巴细胞培养：以DA大鼠脾细胞为刺激细胞,移植受体的脾细胞为反应细胞的混合淋巴培养体系中,B、C及D组OD值较阳性对照组降低(p<0.05),以SD大鼠脾细胞为刺激细胞移植受体的脾细胞为反应细胞的的混合淋巴培养体系中,B组的OD值低于阳性对照组,而C、D组与SD阳性对照组之间的比较没有明显差异,C、D实验组对DA及SD两种不同的刺激细胞反映出的OD值之间的比较有统计学差异(P<0.01),说明脂肪源性干细胞处理组及类肝细胞对DA刺激细胞刺激后建立起来的免疫下调状态是特异性的。8.A组CD4+/CD8+的比值进行性上升,显着高于B组、C和D组(P<0.05),第10天达到高峰(4.683±0.775)。术后3-10天B组、C和D组比值缓慢上升,到14天开始回落,但各时间点各组差异不大,无显着性差异。结论1.成功建立大鼠肝移植高排斥模型。2.单纯脂肪源性干细胞治疗组的移植肝内有肝纤维化出现以及脂肪变性,MSCs可能参与此过程的发生,可能影响其在体内的分化,不足以完全抑制移植术后的免疫排斥反应。3.由脂肪源性干细胞分化形成的类肝细胞治疗组受鼠对供肝产生耐受,且为供者特异性免疫耐受。4.由脂肪源性干细胞分化形成的类肝细胞治疗组对耐受的产生发挥一定的作用,并促进了肝细胞再生从而避免使用免疫抑制剂。
李鑫[6]2018年在《CTLA-4 mRNA 3'UTR靶向性脱氧寡核苷酸的疫苗佐剂效应》文中提出细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)是表达在活化T细胞表面的一种重要的免疫抑制性分子。T细胞活化需要两个信号:抗原提呈细胞(APCs)表面MHC分子提呈的抗原肽与T细胞表面的T细胞受体(TCR)相互作用产生T细胞活化的第一信号;APCs表面的CD80或CD86与T细胞表面的CD28相互作用产生T细胞活化的第二信号。CTLA-4可通过与T细胞表面的CD28竞争结合APCs表面的CD80或CD86对T细胞活化发挥抑制作用。因此,抑制CTLA-4介导的免疫抑制性信号,可以促进T细胞活化,从而增强T细胞依赖的抗体应答,使CTLA-4抑制剂发挥疫苗佐剂效应。基于此,本研究设计并筛选了靶向CTLA-4 mRNA 3’非编码区(3’UTR)的单链脱氧寡核苷酸(ODNs),以此抑制CD4~+T细胞表面CTLA-4的表达水平,并确定其作用机制及对抗体应答的促进作用,为新型疫苗佐剂的研究提供了一个新策略。中文摘要CTLA-4 mRNA 3’UTR靶向性脱氧寡核苷酸的疫苗佐剂效应T细胞活化在T细胞依赖的抗体应答中发挥着重要作用,而细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)是表达在活化T细胞表面的一种重要的抑制性分子,可以与T细胞表面的CD28竞争结合抗原提呈细胞(APCs)表面的CD80或CD86,从而抑制T细胞活化。因此,阻断CTLA-4介导的免疫抑制性信号,可以促进T细胞的活化,从而增强T细胞依赖的抗体应答。本研究以人和小鼠CTLA-4 mRNA 3’非翻译区(3’UTR)的保守序列为靶点,设计了两个CTLA-4mRNA 3’UTR靶向性脱氧寡核苷酸(ODNs),CMD-1和CMD-2,并对这两个ODNs对CTLA-4表达的抑制作用及增强抗体应答的疫苗佐剂效应进行了研究,结果如下:1.CTLA-4 mRNA 3’UTR靶向性ODN的设计、筛选及鉴定为了获得CTLA-4 mRNA 3’UTR靶向性ODNs,我们通过网络数据库和生物信息软件,以人和小鼠CTLA-4 mRNA 3’UTR的保守序列为靶点,设计了一系列CTLA-4 mRNA 3’UTR候选靶向性ODNs,并通过生物信息软件对ODNs二级结构、自由能及靶点序列的二级结构等进行了分析,初步筛选并合成了两个ODNs,分别命名为CMD-1和CMD-2。结果显示,CMD-1和CMD-2形成分子间或分子内二级结构所需的自由能较高,而与靶区mRNA结合所需的自由能较低,并且不易非特异性地结合其他与CTLA-4无关的mRNA。由此可见,从理论上看,CMD-1和CMD-2相对不易形成分子间或分子内二级结构,易与靶区mRNA结合,并且具有良好的特异性。2.CTLA-4 mRNA 3’UTR靶向性ODN对CTLA-4抑制作用的研究为了研究CTLA-4 mRNA 3’UTR靶向性ODN对CTLA-4的抑制作用,我们首先对ODNs进入靶细胞的动力学进行了分析,然后分别采用流式细胞术和实时定量PCR(RT-PCR)法分析了ODNs对CTLA-4蛋白质及mRNA水平的影响,并对其作用机制进行了探讨。2.1 CMD-1及CMD-2进入靶细胞的动力学分析由于CTLA-4主要在CD4~+T细胞上发挥在生物学功能,因此,我们采用荧光标记的CMD-1和CMD-2,以体外和体内示踪的方法检测了两种ODNs进入CD4~+T细胞的情况。结果显示:1)CMD-1和CMD-2能以相似的效率进入体外培养淋巴结细胞中的CD4~+T细胞,并随着孵育时间的延长,CMD-1或CMD-2进入CD4~+T细胞的比例逐渐增加;2)CMD-1和CMD-2在CD4~+T细胞中的分布情况相似;3)当以肌肉注射的给药方式注射于na?ve ICR小鼠的右后肢时,CMD-1和CMD-2主要分布在注射部位同侧的腘窝淋巴结,在注射6、12及24 h后,注射部位同侧腘窝淋巴结的CD4~+T中均可以检测到CMD-1或CMD-2。以上结果提示,CMD-1和CMD-2可以进入CD4~+T细胞,这为ODNs在体内发挥作用提供了可能。2.2 CMD-1及CMD-2对CTLA-4表达的抑制作用为了研究CMD-1和CMD-2在进入CD4~+T细胞后是否可以对CTLA-4的表达发挥抑制作用,我们用重组Cp蛋白刺激Cp蛋白免疫小鼠的脾细胞,使T细胞活化,诱导小鼠CTLA-4的表达,在刺激细胞的过程中加入CMD-1或CMD-2,检测CMD-1或CMD-2对小鼠CD4~+T表面CTLA-4表达水平的影响。结果显示,CMD-1可以显着降低小鼠CD4~+T细胞表面CTLA-4的表达水平,而CMD-2对CTLA-4的表达没有显着抑制作用。为了进一步检测CMD-1和CMD-2是否可以抑制人CD4~+T细胞表面CTLA-4的表达,我们用佛波酯(PMA)和离子霉素(IONO)刺激人外周血细胞,使其中的T细胞活化,诱导CTLA-4的表达,同时加入CMD-1或CMD-2,检测CMD-1或CMD-2对人CD4~+T细胞表面CTLA-4表达的影响。结果显示,CMD-1和CMD-2均能显着降低人CD4~+T细胞表面CTLA-4的表达水平;尽管两种ODNs对CTLA-4的抑制作用没有统计学差异,但用CMD-1处理的CD4~+T细胞表面表达CTLA-4百分率的平均值要低于CMD-2处理的细胞。以上结果提示,CMD-1对人和小鼠CD4~+T细胞表面CTLA-4的表达均有显着抑制作用,这不仅使我们可以在小鼠模型上研究CMD-1是否可以通过抑制CTLA-4的免疫抑制信号而发挥佐剂效应,也使CMD-1有应用于人的潜力。2.3 CMD-1及CMD-2对CTLA-4 mRNA的作用为了验证CMD-1对CTLA-4的抑制作用是否是通过干扰CTLA-4 mRNA实现的,我们检测了CMD-1和CMD-2在细胞内对CTLA-4 mRNA水平的影响。结果显示,与CMD-2相比,CMD-1在细胞内可以有效下调CTLA-4 mRNA的水平,并且随着CMD-1被消耗,其对CTLA-4 mRNA的干扰作用逐渐消失,甚至可以出现负反馈上调。为了研究CMD-1干扰CTLA-4 mRNA的作用机制,我们通过体外转录的方法合成了CTLA-4 mRNA,然后将CMD-1或CMD-2与CTLA-4 mRNA共孵育,并在反应体系中加入RNase H,检测RNase H对mRNA的切割效率。结果显示,与CMD-2相比,CMD-1可以更好的与CTLA-4 mRNA结合,诱导RNase H对mRNA的切割。以上结果提示,CTLA-4 mRNA 3’UTR靶向性ODN CMD-1是一种有效的CTLA-4抑制剂,它可以进入CD4~+T细胞,通过与CTLA-4的mRNA结合,诱导RNase H对靶mRNA的切割降解,进而抑制小鼠或人CD4~+T细胞表面CTLA-4的表达。3.CTLA-4 mRNA 3’UTR靶向性ODN的疫苗佐剂效应研究为了研究CMD-1是否可以通过抑制T细胞的CTLA-4抑制性信号而发挥增强抗体应答的疫苗佐剂效应,我们检测了CMD-1对疫苗免疫小鼠后抗体水平和免疫细胞的影响,并探究了其作用机制。3.1 CMD-1对疫苗免疫小鼠血清抗体水平的影响为了研究CMD-1是否具有作为疫苗佐剂的潜能,我们将ODNs与灭活病毒疫苗或重组亚单位疫苗联用免疫小鼠,检测ODNs对抗体水平的影响;并且对小鼠品系、ODN剂型及ODN剂量对ODNs佐剂效应的影响进行了研究。结果显示:1)在与灭活口蹄疫病毒(FMDV)疫苗联用免疫小鼠时,CMD-1可以在免疫的第21天和第28天显着提高小鼠的血清抗体水平;2)在与重组CPAC VLPs疫苗联用免疫小鼠时,CMD-1在免疫的第14、21及28天均能显着提高小鼠的血清抗体水平;3)CMD-1不仅能在ICR小鼠中发挥佐剂效应,也可以在BALB/c小鼠中发挥佐剂效应;4)CMD-1的佐剂效应在一定程度上受到乳化剂的影响;5)CMD-1的疫苗佐剂效应有剂量依赖性,5μg/只或10μg/只的CMD-1均能显着上调免疫小鼠的血清抗体水平。3.2 CMD-1对疫苗免疫小鼠免疫细胞的影响为了探索CMD-1在体内对免疫细胞的影响,我们用ODNs和CPAC VLPs疫苗联用免疫小鼠,于第二次免疫后的48 h检测了小鼠的免疫同侧引流区淋巴结细胞和脾细胞中CD4~+T细胞、CD11c~+细胞及CD19~+B细胞的变化。结果显示,CMD-1在与疫苗联用免疫小鼠时,可以显着抑制CD4~+T细胞表面CTLA-4的表达,从而使CD4~+T细胞的比例及CD11c~+细胞表面CD80表达比例显着上调,但对CD19~+B细胞的影响不明显。3.3 CMD-1发挥佐剂效应的机制研究为了对CMD-1发挥疫苗佐剂效应的机制进行研究,我们通过利用Cp蛋白刺激Cp蛋白免疫小鼠的脾细胞的体外实验体系诱导T细胞活化,在刺激过程中加入ODNs,进一步检测ODNs对CD11c~+细胞表面CD80/CD86的表达、CD4~+T细胞和CD19~+B细胞的增殖活化能力及T_H2重要细胞因子IL-4的影响。结果显示,CMD-1可以通过抑制T细胞的CTLA-4免疫抑制性信号,促进CD4~+T细胞的增殖活化,进而促进CD11c~+细胞表面CD80及CD86的维持,上调IL-4的表达并促进B细胞的增殖活化。以上结果提示,CMD-1可以通过抑制T细胞的CTLA-4免疫抑制性信号,促进T细胞依赖的抗体应答,从而在灭活病毒疫苗和重组亚单位疫苗中发挥提高抗体水平的佐剂效应。综上所述,CMD-1可以作为一种新型疫苗佐剂,通过抑制T细胞的CTLA-4免疫抑制性信号而发挥增强抗体应答的作用,这种通过抑制免疫抑制性信号从而增强免疫应答的思路为疫苗佐剂的设计提供了一种新策略。
郑强[7]2007年在《肾靶向雷公藤内酯醇—溶菌酶结合物研究》文中研究表明肾脏疾病，尤其是免疫相关的肾脏疾病的，正成为威胁人类健康的常见疾病之一。常见的肾脏疾病包括原发性和继发性肾小球、肾小管、肾介质及肾血管等疾病，其中最常见的有急性肾炎、慢性肾炎、原发性肾病综合症及尿路感染等上述疾病不断发展，在后期可出现发展成为末期肾病(ESRD)。病人不得不依靠昂贵的血液透析或肾移植来延长生命，给患者家庭和社会带来沉重负担。目前国内临床上治疗肾脏疾病常采用激素冲击治疗，雷公藤多甙片维持治疗的治疗方案。大剂量使用激素和长期服用雷公藤多甙片所带来的毒副作用严重限制了肾脏疾病的治疗。因此，肾脏疾病临床治疗中，研究发展肾脏的靶向给药系统，以提高肾脏药物浓度和降低毒副作用，具有十分重要的意义。1977年我国科学家在国际上首创应用中药雷公藤治疗慢性肾炎获得成功。其制剂采用雷公藤根(去皮)经粉碎、提取、精制得雷公藤多甙，压制成片剂，其成分复杂、质量不稳定和不良反应较多。本课题采用其主要有效成分雷公藤内酯醇为模型药物，选用溶菌酶为载体，研究雷公藤内酯醇的溶菌酶前体药物的合成、表征、体内外特性。为研究可以产生局部的免疫抑制和抗炎作用、毒副作用低的肾靶向新药提供科学基础。本研究制备了雷公藤内酯醇—溶菌酶结合物(TPS-LZM)。首先合成了雷公藤内酯醇丁二酸酯，应用熔点、UV、HPLC、IR、MS、~1H-NMR等进行了鉴定，确证了雷公藤内酯醇丁二酸酯的结构。然后雷公藤内酯醇丁二酸酯与溶菌酶反应制备了目标结合物(TPS-LZM)。TPS-LZM中TP／LZM摩尔比约为1∶1，质量比约为0．25％。以3％甘露醇为冻干保护剂，将TPS-LZM结合物制成了溶液型冻干粉针剂，剂量每瓶1mg，并进行了制剂综合性能评价；本制剂有一定吸湿性，其相对临界湿度为72％，应密闭贮存。体外理化性质研究表明：TPS-LZM：结合物在不同pH值缓冲液以及小鼠血浆中的稳定性研究结果显示其在体外环境中比较稳定。在pH=2～8溶液中，37℃下放置12 h水解产生游离TP的量小于2％；在30％大鼠血浆中，37℃条件下放置2 h，水解产生游离TP的量小于10％。在大鼠肾溶酶体溶液中能够12 h释放80％以上游离原药，表明结合物能够在到达肾脏之前稳定存在一段时间，避免在到达靶组织之前被降解；到达目的细胞器后又能够释放出活性母药。体外吸收模型实验表明：结合物能够与近端小管细胞迅速结合，雷公藤内酯醇对溶菌酶的结合没有改变其能够被近端小管细胞摄取的特性。单层近端小管细胞吸收和释放实验发现结合物能被吸收，其活性药物的释放主要向细胞的基底膜侧。采用MTT比色法考察了结合物与原药的对近端小管上皮细胞的毒性。研究显示，结合物和原药浓度越高，对肾近段小管上皮细胞作用时间越长，则细胞毒性越大，但结合物的毒性小于原药，特别是在高药物浓度下毒性差距更大。体内分布实验显示：与原药相比，结合物综合表现为：具有较短的血浆半衰期；具有较好的肾靶向性和滞留时间；在其它各脏器中的分布减少。药理学研究表明：结合物能够明显改善实验所致大鼠肾炎和缺血再灌注引起的损伤，其对肝脏和睾丸的毒性降低，对机体整个免疫系统的影响较小，有一定局部免疫抑制效果。综上所述，本研究成功制备了雷公藤内酯醇—溶菌酶结合物，并对其靶向性质进行了定位、定性和定量研究，实现了本课题的设计目标。
李家丽[8]2014年在《叁氧化二砷在异种胰岛移植中作用研究》文中研究说明背景：糖尿病可行有效的治疗方法之一是胰岛移植,现今临床同种免疫抑制剂得到极大发展使得部分移植患者术后长期生存过上类似正常人生活,但是依然有大部分患者达不到理想免疫抑制效果并且忍受着免疫抑制剂的诸多副作用。同时供体不足限制了胰岛移植的发展,异种移植就能解决这个问题。虽然异种来源的胰岛细胞较充足,但异种移植面临的排斥反应机制非常复杂,目前对异种移植排斥都没有得到充分的认识,限制了临床异种移植发展的进程。因此我们目前亟需认识同种和异种移植的差别并开发适用于异种移植的免疫抑制剂。方法：我们提取出Lewis大鼠胰岛,然后进行Lewis大鼠到C57BL/6小鼠肾被膜下的胰岛移植。首先,我们尝试开发中药传统药物As2O3,研究其在异种胰岛移植中的作用。其次,为了达到更理想的效果,我们把As2O3和RAPA联合应用于异种胰岛移植,探讨两者联合应用效果及其机制。结果：Lewis大鼠到C57BL/6小鼠(对照组)的胰岛移植物中位生存期(median survival time, MST)为12天, As2O3组中位生存期15天,两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。As203通过诱导脾细胞凋亡和降低血清中IFN-γ水平发挥作用。As2O3联合RAPA中位生存期28天,而前期同种移植联合用药组有2/6生存期超过100天。异种移植联合用药效果不如同种胰岛移植主要是因为异种胰岛移植排斥较同种胰岛移植强烈尤其是体液免疫更为明显。RAPA联合As203组在排斥时间点IgG抗体处于高水平。结论：As203能够延长异种胰岛移植生存期；As203能够诱导脾细胞凋亡、降低部分细胞免疫水平,但不能降低体液免疫水平。异种胰岛移植As203联合RAPA应用不能对抗体液免疫反应。
王丁[9]2010年在《CD14~+单核细胞增强人脐带间充质干细胞的免疫抑制作用》文中研究指明背景：间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)是存在于多种组织中的一种具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞。因其具有易于分离扩增、多向分化、造血支持、低免疫原性和免疫调节等特性,而成为组织工程和再生医学中理想的种子细胞。目前,试验研究和治疗性临床应用均以成体骨髓来源的间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BM-MSC)作为研究对象。但成人骨髓间充质干细胞(hBM-MSC)存在来源有限、取样时要进行侵袭性操作以及间充质干细胞的绝对数量和增殖分化能力会随着供者年龄增加而下降等不足,急需科研人员寻找一种新的更具优势的替代细胞。大量的实验研究表明,人脐带间充质干细胞(human umbilical cord matrix stem cell, hUC-MSC)具有以下不可比拟的优势：第一,利用胎儿分娩后的废弃物,组织来源广泛,无伦理学限制；第二,具有更强的增殖能力,易于长期培养,经体外扩增可获得丰富的细胞；第叁,具有成体干细胞和胚胎干细胞(embryonic stem cell, ESC)的双重表面标记；第四,连续多次传代后仍然维持干细胞特性。因此,人脐带间充质干细胞作为细胞治疗中一种非常有希望的干细胞替代来源,具有无限的潜力和广泛的临床应用前景,而其免疫学特性正是细胞治疗成功与否的决定性因素。目的：淋巴细胞(lymphocyte)和单核细胞(monocyte)是外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMC)重要的组成部分。本研究旨在揭示人脐带间充质干细胞、T淋巴细胞以及单核细胞叁者之间的相互作用关系及其机制,为人脐带间充质干细胞的临床应用提供必要的理论基础。方法：(1)应用流式细胞技术检测成人骨髓间充质干细胞和人脐带间充质干细胞的免疫表型以及胚胎干细胞的全能标志物。(2)在诱导体系中,定向诱导人脐带间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化,用油红0染色、Von Kossa染色、茜素红染色以及二型胶原组化染色观测脂滴形成、钙盐沉积和二型胶原合成情况以鉴定人脐带间充质干细胞的多向分化潜能。(3)体外建立人脐带间充质干细胞和CD4+／CD8+T淋巴细胞的共培养体系以及人脐带间充质干细胞、CD4+／CD8+T淋巴细胞和CD14+单核细胞的叁者共培养体系。利用流式细胞技术(Brdu掺入试验)检测T淋巴细胞的增殖情况,并且用酶联免疫吸附试验试剂盒检测其IFN-γ(interfern-γ)的分泌水平,从而反映人脐带间充质干细胞对活化后的T淋巴细胞的免疫抑制作用以及CD14+单核细胞对于这一作用的影响。(4)用transwell培养板培养人脐带间充质干细胞和CD4+／CD8+T淋巴细胞以研究人脐带间充质干细胞发挥免疫抑制作用是否需要细胞直接接触。(5)外源添加TGF-β(transforming growth factor-β)单克隆中和抗体、吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO)特异性抑制剂1-M-Trp、一氧化氮(N0)合酶竞争性抑制剂L-NMA和前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)合成抑制剂NS-398(环氧化酶-2选择性抑制剂)和吲哚美辛(环氧化酶非选择性抑制剂),以IFN-γ的分泌水平作为评价指标,鉴定介导人脐带间充质干细胞免疫抑制作用的可溶性因子。(6)通过添加外源性PGE2并且应用ELISA试剂盒检测人脐带间充质干细胞和CD4+／CD8+T淋巴细胞共培养体系中PGE2的水平佐证PGE2是否中介人脐带间充质干细胞的免疫抑制作用。(7)制备CD3／CD28抗体交联磁珠(anti-CD3/CD28 Dynabeads)活化的CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和外周血单个核细胞叁种条件培养基,用ELISA试剂盒检测条件培养基中IFN-γ、TNF-α(tumor necrosis factor-a)、IL-1β(interleukin-1β)和IL-6(inter-leukin-6)的水平。同时应用ELISA方法对以上叁种条件培养基以及四种因子的重组蛋白刺激前后,人脐带间充质干细胞分泌PGE2的水平进行定量检测,以明确人脐带间充质干细胞产生PGE2的驱动因子。(8)外源重组IL-1β刺激人脐带间充质干细胞,应用Real-time PCR方法检测环氧化酶-2(cyclooxygenase, COX-2)的表达并用ELISA试剂盒检测PGE2的分泌水平。(9)利用几种特异性的信号通路蛋白抑制剂：PD98059为细胞外信号调节激酶(extra-cellular signal-regulated kinase, ERK)特异性抑制剂、SB203580为p38丝裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK)特异性抑制剂、SP600125为c-Jun氨基末端激酶(c-jun-N-terminal kinase, JNK)特异性抑制剂、H89为蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)特异性抑制剂、Wortmannin为磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylnsitol 3-kinase, PI3K)特异性抑制剂、IKK-NBD肽为NF-κB特异性抑制剂、Go6983和Go6976为蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)特异性抑制剂来初步确定IL-1β激发人脐带间充质干细胞产生PGE2的信号通路相关蛋白。(10)应用ELISA试剂盒检测CD14+单核细胞加入人脐带间充质干细胞与CD4+／CD8+T淋巴细胞共培养体系前后,上清中IL-1β和PGE2的含量。(11)利用流式细胞技术(Brdu掺入试验)和ELISA试剂盒检测IL-1受体拮抗剂(IL-1 receptor antagonist,IL-1RA)加入人脐带间充质干细胞、CD4+／CD8+T淋巴细胞和CD14+单核细胞的叁者共培养体系前后,T淋巴细胞的增殖情况、IFN-γ的分泌水平以及PGE2的含量,以进一步研究单核细胞是否通过分泌IL-1β促进人脐带间充质干细胞产生PGE2,从而增强人脐带间充质干细胞的免疫抑制作用。结果：(1)人脐带间充质干细胞与成人骨髓间充质干细胞免疫表型相似,但人脐带间充质干细胞高表达胚胎干细胞标志物OCT4和SSEA-4。(2)在特定的诱导条件下,人脐带间充质干细胞具有向脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞叁系分化的能力。(3)人脐带间充质干细胞能够抑制CD3／CD28抗体交联磁珠活化的CD4+／CD8+T淋巴细胞的增殖以及IFN-γ的分泌,而且CD14+单核细胞能够增强人脐带间充质干细胞的这一抑制作用。(4)人脐带间充质干细胞发挥免疫抑制作用并不依赖于细胞间的直接接触。PGE2合成抑制剂能够显着反转人脐带间充质干细胞的免疫抑制作用；而外源性PGE2能够模拟人脐带间充质干细胞的免疫抑制作用。(5)炎症因子IFN-γ和IL-1β均能驱动人脐带间充质干细胞产生PGE2。ERK、p38-MAPK和JNK的特异性抑制剂能够显着下调IL-1β诱导的PGE2的分泌。(6)CD14+单核细胞能够显着上调人脐带间充质干细胞与CD4+／CD8+T淋巴细胞共培养上清中IL-1β以及PGE2的水平,并且上调的幅度与单核细胞的数量呈正相关。(7)IL-1RA能够下调人脐带间充质干细胞、CD4+／CD8+T淋巴细胞和CD14+单核细胞叁者共培养上清中PGE2的水平,同时显着逆转T淋巴细胞的增殖活力以及IFN-γ的分泌水平。结论：CD14+单核细胞通过分泌炎症因子IL-1β,经由MAPK信号通路显着上调人脐带间充质干细胞中PGE2的表达,从而增强人脐带间充质干细胞对活化CD4+／CD8+T淋巴细胞的免疫抑制作用。背景：间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)以其卓越的免疫调节能力,日益成为广大科研人员关注的热点。经体内外大量研究证实,间充质干细胞能够调控T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、树突状细胞、巨噬细胞等多种免疫细胞的功能,为治疗免疫相关疾病以及自身免疫性疾病带来了曙光。人胎儿脐带基质来源的间充质干细胞(human umbilical cord matrix stem cell, hUC-MSC)不仅具有许多独特的优势,而且像骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BM-MSC)一样,能够高效调节T淋巴细胞的活性和功能。目的：人脐带间充质干细胞能够分泌多种生长因子和细胞因子。本研究旨在揭示人脐带间充质干细胞产生IL-6的机制,以及IL-6在人脐带间充质干细胞影响肿瘤细胞增殖过程中的作用。方法：建立人外周血单个核细胞(hPBMC)和人脐带间充质干细胞的共培养体系以观察两种细胞之间的相互作用。制备多种条件培养基并建立人脐带间充质干细胞的单独培养体系,以研究可溶性因子对IL-6分泌的影响。用ELISA定量检测培养上清中IL-6、IL-1β和PGE2的水平。应用工L-1受体抑制剂和多种信号通路抑制剂确定CD14+单核细胞是否通过分泌IL-1β而上调IL-6的表达以及相关的信号通路。Western blot用以检测NF-KB的活化。用流式细胞仪检测肿瘤细胞Brdu的掺入情况,以证实人脐带间充质干细胞是否能够影响肿瘤细胞的增殖,同时评估IL-6在这一过程中的作用。结果：(1)共培养体系中IL-6的浓度与人脐带间充质干细胞的数量呈正相关,并随着共培养时间的延长而呈进行性富集。(2)IL-6主要由人脐带间充质干细胞分泌。(3)CD14+单核细胞通过释放IL-1β诱导人脐带间充质干细胞产生IL-6。(4)PGE2并不参与诱导人脐带间充质干细胞分泌IL-6。(5)c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路及转录因子NF-κB均与IL-1β诱导人脐带间充质干细胞表达IL-6紧密相关。(6)由IL-1β刺激人脐带间充质干细胞所制备的条件培养基能够促进MCF-7细胞的增殖,但IL-6中和抗体部分逆转了这一促进效应。(7)木犀草素以剂量依赖性的方式显着抑制人脐带间充质干细胞IL-6的分泌。结论：(1)CD14+单核细胞释放的IL-1β经由c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路活化转录因子NF-κB,从而诱导人脐带间充质干细胞产生IL-6。(2)IL-6中介人脐带间充质干细胞对MCF-7细胞增殖的促进作用。(3)木犀草素以剂量依赖性方式显着抑制人脐带间充质干细胞IL-6的分泌。
陈峰阳[10]2017年在《Stephanthraniline A抑制T细胞活化的作用及分子机制》文中研究表明目的Stephanthraniline A(STA)是我们课题组前期从中药黑鳗藤Stephhanotis mucronata中经化学分离和活性筛选发现的具有较好免疫抑制活性的天然C21甾体化合物。本研究的目的是进一步对STA抑制T细胞免疫反应的作用进行评价,并对其机制进行深入研究。方法1.STA体外对T细胞活化和增殖的影响:采用Nylon Fiber Column T从小鼠脾细胞中分离纯化T细胞。以抗CD3/CD28诱导T细胞活化和增殖,经STA作用后,MTT法测定细胞增殖;ELISA和RT-PCR法测定细胞因子的蛋白分泌和mRNA表达;流式细胞仪测定细胞周期分布。2.STA体外对CD4+T细胞活化和增殖的影响:以Dynabeads从小鼠脾细胞中分离纯化CD4+T细胞。Concanavalin A(Con A)诱导CD4+T细胞活化和增殖,经STA作用后,流式细胞仪测定表面分子CD25和CD69表达。CFDASE示踪法测定CD4+T细胞增殖指数。ELISA和Realtime-PCR法测定细胞因子的蛋白分泌和mRNA表达。3.STA抑制T细胞活化的机制研究:采用糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)拮抗剂RU486观察STA的作用是否依赖于GR受体。采用EMSA法测定STA对转录因子AP1、NFKB及NFAT和DNA结合能力的影响。Western blot法测定STA对NFAT1、IKBα、p38、ZAP-70,PKCθ蛋白及其磷酸化的影响。通过观察Phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA)/lonomycirn或PMA/抗CD28诱导的T细胞活化和增殖确定STA的作用是否依赖于T细胞受体(T cell receptor,TCR)近端信号和Ca2+信号。采用计算机模拟分子对接方法测试STA与PKC蛋白(α、βⅡ、ε、η、θ)之间的相互作用。采用ADP-GIo-rM激酶检测法观察STA对PKCθ活性的影响。采用PKCθ激动剂PMA观察其是否能抑制STA的免疫抑制作用。采用Signal Transduction PathwayFinder PCR观察STA对多重信号传导通路的影响。4.STA对Con A诱导的小鼠爆发性肝炎的影响:STA腹腔注射1h后尾静脉注射Con A诱导小鼠产生爆发性肝炎。8h后,检测小鼠体重变化。收集血清按ELISA法测定TNF-α,IL-1β、IFN-γ和IL-17的浓度。按ALT和AST检测试剂盒说明测定转氨酶活性。肝脏组织切片后苏木精-伊红染色观察组织病理变化情况。部分切片以FITC-anti-CD4、PE-anti-CD69标记免疫荧光染色观察CD4+CD69+阳性细胞的数量。根据体重、血清中ALT和AST水平及炎症因子(TNF-α和IL-1β)含量变化和组织病理变化情况评价STA对爆发性肝炎的治疗作用。根据肝组织CD4+CD69+阳性细胞数,细胞因子(IFN-γ和IL-17)含量评价STA体内对CD4+T细胞在小鼠肝组织内活化和聚集的影响。5.STA和Cyclosporine A(CsA)协同抑制T细胞免疫应答的体内外研究:采用非有效浓度的STA和CsA联合使用观察它们体外对Con A诱导的T细胞免疫应答反应的影响。MTT法测定细胞毒性和细胞增殖指数。ELISA法测定细胞因子IL-2的的分泌量。流式细胞仪测定CD25的表达情况。采用二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene,DNFB)诱导的小鼠迟发型超敏反应(delayed-type hypersensitivity,DTH)模型观察非治疗剂量的STA和CsA联合使用对T细胞免疫应答的体内作用,以耳廓的肿胀程度和的组织病理变化情况评价STA和CsA的协同作用。最后采用P450-GIoTM CYP3A4筛选系统测定STA对CsA代谢酶CYP3A4活性的影响。结果1.STA体外抑制T细胞的活化和增殖:STA能显着抑制抗CD3/CD28诱导的T细胞增殖,抑制T细胞进入S和G2/M期,抑制细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-17的蛋白分泌和mRNA表达。2.STA体外抑制CD4+T细胞的活化和增殖:STA能显着抑制Con A诱导增殖的T细胞中的CD3+ CD4+T细胞的比例,但对CD3+ CD8+ T细胞的比例没有明显的抑制作用;能明显抑制Con A诱导的CD4+T细胞增殖;抑制表面分子CD25和CD69的表达;抑制细胞因子IL-2和IFN-γ的蛋白分泌和mRNA表达。3.STA抑制T细胞活化的机制:糖皮质激素受体拮抗剂RU486不能阻断或减弱STA的作用。STA并不会扩大sub-G1凋亡峰,也不影响抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax的mRNA表达。STA抑制转录因子AP1、NFKB及NFAT和DNA的结合能力,抑制NFAT的去磷酸化以及IkB-α和p38的磷酸化。STA对Zap70的磷酸化没有明显的影响,对PMA/lonomycin或PMA/抗CD28诱导的T细胞活化和增殖均具有显着的抑制作用。STA通过5个氢键结合于PKCθ的ATP口袋域,STA能抑制PKCθ的活性,抑制CD4+T细胞内的PKCθ磷酸化水平。STA对Con A诱导的T细胞活化和增殖作用不能被PMA逆转。STA能调节18条信号通路中Wnt、Hedgehog、Jak-Stat等10条通路相关基因的mRNA表达。4.STA缓解Con A诱导的小鼠爆发性肝炎和CD4+T细胞在小鼠肝组织内活化聚集:STA能明显恢复Con A引起的体重降低、缓解血清ALT和AST水平上升和肝组织病变,明显抑制血清中TNF-α和IL-1β的含量。另外,STA能抑制肝组织中CD4+CD69+T细胞的数量,抑制细胞因子IFN-γ和IL-17的产生。5.STA和CsA协同抑制T细胞免疫应答:低浓度的STA和CsA单独使用或联合使用均不会对正常脾细胞产生细胞毒性。单独使用低浓度的STA或CsA不能抑制Con A引起的T细胞增殖,IL-2产生和CD25表达,但STA和CsA联合使用后均具有显着抑制作用。同样地,非治疗剂量的STA和CsA联合口服给药后能明显抑制DNFB诱导的小鼠耳肿胀,减少小鼠耳廓表皮增生和浮肿,以及炎症细胞的浸润。STA能抑制CYP3A4的活性。结论1.STA体外能抑制T细胞的激活和增殖,且对CD4+T细胞亚型的抑制作用比CD8+T细胞敏感。2.STA可通过阻止细胞进入分裂周期抑制T细胞的增殖,但不会促进激活诱导的T细胞凋亡。3.区别于传统甾体类抗炎药物,STA与GR无竞争性结合,不依赖于GR起免疫抑制作用。4.区别于钙调蛋白酶抑制剂(calcineurininhibitors,CNls),STA抑制T细胞激活不是通过TCR近端信号和Ca2+信号。5.PKCθ极可能是STA作用的分子靶点。STA可通过氢键结合的方式连接于PKCθ的ATP 口袋域,从而抑制PKCθ的磷酸化和活性,进而抑制PKCθ下游NFAT、NFκB和MAPK信号级联传递,最终抑制T细胞的活化。6.STA抑制T细胞活化和增殖还可能与其调控多重信号通路的传导有关。7.腹腔注射或口服给予STA在体内对T细胞介导的免疫性疾病模型均显示较好的治疗作用。STA通过抑制CD4+T细胞活化和在肝脏聚集,从而缓解Con A诱导的爆发性肝炎。8.STA与CsA可通过互补的分子机制,或可能提高CsA的体内生物利用度,在体内外发挥协同作用。以上结果为STA作为用于治疗T细胞介导的炎症和自身免疫性疾病的免疫抑制先导化合物的研究奠定了基础。
参考文献：
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[9]. CD14~+单核细胞增强人脐带间充质干细胞的免疫抑制作用[D]. 王丁. 中国协和医科大学. 2010
[10]. Stephanthraniline A抑制T细胞活化的作用及分子机制[D]. 陈峰阳. 浙江大学. 2017
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