何辉 李开春 李浩然 董擂 程雷 金实通讯作者 李克军
大连医科大学附属第一医院腹腔镜外科 辽宁 大连 １１６０００ 辽宁省教育厅计划项目(批准号:L２０１２３１６)课题名称,ALDH 启动子重组Ad/３－△２４对胰腺癌肿瘤干细胞溶瘤作用的研究项目基金:大连市科技局项目批准号２０１３E１５SF１６７项目编号２０１３C００９
【摘要】 目的 探索不同胰岛受损程度的糖尿病伴肥胖动物模型的造模方式.方法 采用高脂饮食联合不同浓度链脲佐菌素(STZ)腹腔注射的方式,测定Lee’S指数,造模后血糖、血胰岛素、血脂含量等的变化,筛选胰岛受损程度不同的糖尿病动物模型.结果 肥胖组成模率８６．９６％,STZ注射一周L组成模率１００％,S组成模率７５．０％.结论 高脂饮食联合不同浓度STZ腹腔注射能建立不同胰岛受损程度的２型糖尿病动物模型. 【关键词】 ２型糖尿病; 动物模型【中图分类号】R５８７．１【文献标识码】A 【文章编号】１００８－６３１５(２０１５)１２－０３５６－０１
据估计,世界范围内有３．３６亿人患有糖尿病,这个数字到２０３０年将增加至５．５２亿[１].在目前数量急剧增加的糖尿病患者中,２型糖尿病占绝大多数,其中８０％是肥胖患者,同时,６０％的肥胖患者存在糖耐量异常.如果BMI超过正常值２０％,糖尿病患病率为２％;BMI超过５０％,患病率可高达１０％[２].因此,研究２ 型糖尿病伴肥胖的疾病及相关并发症,建立一种与之相近的动物模型尤为重要. 目前应用于科研的糖尿病动物模型有自发性动物模型,转基因动物和基因剔除模型及实验性动物模型,后者又包括:部分胰腺切除法、化学药物诱导法、单纯高脂饮食诱导法、高脂饮食联合药物等[３－５].由于价格昂贵,来源受限等因素, 限制了对自发性动物模型、转基因动物模型的选择.胰腺部分切除法由于成模率低,过程复杂不易复制等因素限制了较大规模的应用.因此,高脂饮食联合小剂量链脲佐菌素(STZ)法成为２型糖尿病动物模型的主要方法[６].本研究采用标准化的高脂饲料建立肥胖SD大鼠,使用两种不同剂量的STZ,成功建立不同胰岛损坏程度的肥胖２型糖尿病动物模型.
１ 材料与方法１．１ 实验材料 SPF级SD雄性大鼠２３只,６周龄,１５０－２００g;由大连医科大学实验动物中心供应并饲养.采用经典糖尿病造模饲料:高脂饲料、对照饲料(低脂饲料)[７];１．１．１ 肥胖动物模型的建立 适应性饲养:动物首次称重后普通饲料饲养１周, 体重为１７８±６．６７g,血糖:４．４±０．４８mmol/L.随机分为２组,对照组(LFD)４只; 高脂饲料组(HFD)１９只.稳定期饲养:给予对照饲料和高脂饲料喂养８周.成模标准:超过对照组平均体重２０％以上[８]１．１．２ 检测项目及检测方法(１)血糖(BG):葡萄糖氧化酶－－过氧化物酶法及尾尖血;甘油三酯(TG), 总胆固醇(TC)及甘油三酯(TG):生化法;胰岛素抵抗指数:HOMA－IR＝空腹胰岛素(μIU/ml)x空腹血糖(mmol/L)/２２．５ (２)体重、肥胖指数:[(体重①电子秤称重②测量身长、尾长、胸围,Lee’Sindex(大鼠肥胖评定指数)＝ g)１/３/(身长cm)]×１０００[９]１．１．３ 糖尿病伴肥胖动物模型的建立(１)实验动物分组及饲养:造模成功的肥胖组１６只SD大鼠(剔除肥胖抵抗大鼠３只)随机均分为２组,S组(n＝８只)和L组(n＝８只),对照组为N组(n＝４ 只)(２)糖尿病模型的建立:造模前禁食１２h,测定体重、血糖,配制１％的STZ,给予S组５０㎎/㎏,L组３５㎎/㎏,N组给予２ml缓冲液,２h后进食.第３天早８:００ 测量非空腹血糖,禁食１２h,晚８:００恢复喂食饲料.造模后第３－７天内３次测量空腹血糖均≥１１．１mmol/L,即达到DM 模型成模标准.[１０](３)OGTT试验:STZ造模后第１周禁食１２h,２０％葡萄糖１g/(kg??bw)腹腔注射,测０min及３０、６０、１２０min血糖水平.按照公式:葡萄糖曲线下面积(AUC)＝(０min血糖值＋３０min血糖值)×０．５/２＋(３０min血糖值＋６０min血糖值)×０．５/２＋((６０min血糖值＋１２０min血糖值)×１/２ ４)统计学处理方法:结果用均值±标准差(X±s)表示,应用SPSS１９．０行统计分析;方差齐时采用方差分析及t检验进行均数比较,方差不齐采用Kruskal－Wallis秩和检验及Wilcoxon秩和检验进行组间比较,P＜０．０５有统计学意义
２ 实验结果２．１ 体重、肥 胖指数 适应性喂养１周后,大鼠体重和进食量之间无统计学差异(P＞０．０５).各组大鼠初始体重:LFD组１８８±７．９g:HFD组１８９±６．６g.８周后,LFD组３３５±１３．３g,HFD组４２０±３２．６g.LDF组平均体重的１２０％为４０２g,以此为肥胖大鼠(DIO)成模标准,HFD组中体重超过４０２g为肥胖组,１６只.其余为肥胖抵抗组(DIO－R),３只.肥胖组成模率为８６．９６％.存活率为１００％第８周肥胖指数:HFD组３００．１±６．２;LFD组２８８．７±４．７(P＜０．０１);胸围:HFD组１７．５±０．６㎝;LFD组１５．４±０．２(P＜０．０１);STZ造模后第７天,S组血糖:１４．７±１．３mmol/L和L组:１５．６±１．２mmol/L(P＞０．０５).对照组:５．４±０．２４mmol/L,(vs．S&L组,P＜０．０５).造模一周内存活率为１００％,一周后S组有２只死亡,L组成模率１００％,S组７５．０％. ２．２ OGTT试验及AUC结果 STZ造模后第１周OGTT检测S组、L组在０、３０、６０及１２０min血糖水平均显著高于N 组(P＜０．０１),S组vs．L组在６０min、１２０min血糖均高于L组(P＜０．１).因２型糖尿病动物模型普遍存在血糖峰值延迟现象,峰值出现在糖负荷后６０min.AUG结果与OGTT相似.AUG表现为S 组、L组均和N组有差别(P＜０．０１),S组明显高于L组(P＜０．０５)． 表１ STZ注射一周各组大鼠OGTT检测结果
与N组相比较(P＜０．０１),＃与L组相比较(P＜０．０１) ２．４ 胰岛素抵抗指数HOMA－IR 用第８周时测定的空腹血糖和空腹胰岛素计算HOMA－IR ,S组:１４．４±１．１,L组:１７．６±１．４(P＜０．０１),二者与N组相比有统计学意义(P＜０．０１).
３ 造模中遇到的问题及讨论实验动物的选择:因为雌性大鼠摄食量与卵巢激素水平有关:有材料证明雌激素水平高时雌性大鼠摄食量低,而雌激素水平低时摄食量高,故选择雄性大鼠,摄食量更稳定、体型相对较大、抵抗力强,且生长更快、实验过程中更易探知体重变化[１１]. 研究发现,预实验中使用植物油肥胖造模周期要长于动物脂肪含量高的饲料,使用同等热量的植物油(主要是花生油与动物脂肪的饲料饲养对比发现,含量为动物脂肪的饲料在第８周时,高脂组较对照组能明显区别,体重均大于对照组的１２０％.
STZ使用柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液配制好后的溶液容易分解,因而药效会随注射时间的延长而降低,应尽量在３０min内注射完毕[１２].如果需注射的模型组数量较多,注射的浓度可能因时间的后移而降低.同时,体重越重的大鼠,同组内注射STZ后死亡的可能性就越大.因为除了按每千克体重STZ注射浓度对体重大的大鼠毒性作用强之外,还可能因对胰岛损毁的程度与注射的总量相关,而非单与药物浓度相关. 腹腔注射同等浓度STZ较尾静脉注射安全性高,成模率高.因为腹腔注射能局部充分与靶器官直接接触,对非靶器官的损害较尾静脉注射方法轻,因而能获得更高的成模率.此外,尾静脉注射是否成功与操作者的熟练程度有关,如果因尾静脉注射而引起尾部坏死,后续使用尾尖采血测定血糖的方法也会受到限制.另外,腹腔注射STZ浓度过低(＜３５㎎/㎏),糖尿病动物模型成模率低,不能达到预期目的;STZ浓度过高(＞６５㎎/㎏),则动物模型死亡率高,并且存活的动物生存质量较差,对后期实验影响较大. 研究发现SD大鼠的空腹血糖随着周龄不同而变化,８W 时雄性为５．４３±０．８６mmol/L(血清生化检测),又与其饲养环境和测定方法等有关[１３],关于大鼠糖尿病血糖指标的设定没有特定参考值,其诊断标准有待进一步的明确. 在整个动物模型成模期间,我们全程监测了空腹血糖的变化,未发现因遗传、基因突变偶发或饮食等原因引起的糖尿病大鼠的出现.STZ注射后一周后S 组较L组胰岛素抵抗指数明显下降,推测这与S组胰岛受损程度严重有关.
４ 结论本实验使用标准化的高脂饲料,通过肥胖造模过程的检测,数据采集及分析,建立了一组肥胖的大鼠模型,并在此基础上进一步使用不同剂量的STZ进行胰岛损坏,成功的建成了两组不同胰岛受损程度的２型糖尿病伴肥胖的动物模型,该造模方式造模周期短、成模率高、造假经济,经过各种指标的检测能基本满足糖尿病研究后续的实验.
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论文作者:何辉 李开春 李浩然 董擂 程雷 金实通讯作者 李克军
论文发表刊物:《中国综合临床》2015年12月供稿
论文发表时间:2016/3/2
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