骆蒙[1]2001年在《基于抑制差减杂交方法的小麦抗白粉病相关基因表达谱研究》文中指出白粉病是我国小麦生产中的主要真菌病害之一，由白粉病菌Erysiphegraminis DC引起。深入研究小麦的抗病机制，是寻找培育广谱、高效、稳定、持久抗病品种新途径的有效方法。本研究尝试将抑制差减杂交（SSH）cDNA文库构建技术、高密度点阵膜杂交差示筛选技术、EST技术以及生物信息学分析技术结合起来，通过建立抗病相关基因表达谱，探索从基因表达整体水平研究小麦抗白粉病机制的方法。 实验所用材料为本实验室培育的抗白粉病品系“百农3217×Mardler”BC_5F_4；白粉病菌Erysiphe graminis DC为北京地区流行的15号生理小种。本研究中构建了一个白粉病菌诱导小麦叶片72hr的普通cDNA文库和一个诱导24hr、48hr、72hr混合SSH cDNA文库，从两个文库分别获得387条、760条EST，完成了这些EST与GenBank nr库序列的BLASTn与BLASTx分析。结合文库高密度点阵膜的差示筛选，从普通文库中获得与抗病相关的已知功能基因15种；SSH文库中获抗病相关EST65种，初步建立了小麦在白粉病侵染初期的抗病相关基因表达谱。 通过对获得的信号系统相关成分分析，推测肌醇脂信号系统、SA信号传递系统、MAP相关信号传递系统可能参与了小麦抗白粉病过程。虽然在普通文库与SSH文库中分别发现了乙烯与茉莉酸合成过程中的重要酶，但确定这两个信号途径是否参加了小麦抗白粉病过程，还需进一步证明。SAR系统基因在表达谱中的种类与数量最多，五大类病程关联蛋白均有出现。有较多的证据证明苯丙烷代谢途径参与了抗白粉病中植物保卫素的合成；有几种细胞壁结构修饰酶和抑制病原菌生长的蛋白酶抑制因子被测到。研究还发现伴随着细胞防卫反应的启动，细胞保卫机制也被激活，抗氧化物质基因大量表达。以半胱氨酸蛋白酶为主的几种蛋白酶基因被测到，并且在已知EST中有一定的表达频率，这一现象以前未见报道。 在白粉病菌诱导的普通文库与SSH文库中，都发现了来源于非病原菌胁迫的基因，如热击蛋白、低温诱导蛋白、铝诱导蛋白、盐胁迫相关基因等。在功能未知的EST中，同源比较也发现了许多来源于盐、干旱、低温、高温、暗培养等胁迫cDNA文库的序列。这一结果暗示我们，生物体对外界胁迫反应可能存在某些相同的机制。同时这一结果可能对实际育种工作也具启发意义。 本研究是我们参加国际麦类EST计划（ITEC）的组成部分，按照协议我们已于2000年7月前按时完成了所承担的任务，共向GrainGenes数据库提交高质量不重复序列 1052条。作为完成 1000条以上序列的 15个实验室之一，我们也共享了该计划获得的EST数据资源。 为了高效管理与利用EST数据，本研究中构建了一个小型数据库。其数据来源包含：参加 ITEC获得的交流数据、本实验室产生的数据、NCGR R基因库的数据、GenBank other dbEST的序列。目前基于该数据库可以进行BLASTn比较，也可以完成cDNA的拼接与延长。基于生物信息学分析方法及文库高密度点阵膜杂交筛选结果，从功能未知EST中选定了几条抗病相关基因的目标片段，其中出现频率8 次的序列有两条；具有R基因NBS毛g、Lug结构的片段5条，目前定位工作正在进行。为了满足大规模数据提交与序列加工等研究的需要，我们还开发了SEQEDIT、blastWZ、SEQTOOL等软件。通过开展本项研究工作，目前己经基本建成了满足大量EST产生、加工、分析需要的生物信息学乎台。 通过比较研究我们认为，差减杂交文库构建技术、高密度点阵膜杂交差示筛选技术、EST技术及生物信息学分析方法相结合，是构建抗病相关基因表达谱、研究抗病机制较好的方法。目前我们已初步建立了抗病相关基因表达谱研究的实验技术体系与合理的实验技术流程。这些工作为进一步进行小麦特定性状的功能基因组学研究，在技术与方法上奠定了基础。
王转[2]2003年在《小麦幼苗水分胁迫诱导的基因表达谱》文中指出在各种自然灾害中，旱灾居于首位。世界范围内，干旱缺水对农业和社会造成的损失相当于其他各类自然灾害造成的损失之和。小麦是世界第一大粮食作物，干旱是小麦增产的主要限制因子。利用分子生物学方法从整体水平研究小麦在水分胁迫条件下的代谢机制，进而研究其抗旱机理，对于全面认识作物抗旱性的遗传基础，培育抗旱节水新品种，具有重要意义。 本研究以小麦抗旱品种旱选10号小麦幼苗作为实验对象，构建水分胁迫诱导表达基因的抑制差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)文库，通过对文库的筛选、克隆测序和功能分析，建立小麦幼苗水分胁迫诱导的基因表达谱。为深入认识小麦抗旱性的遗传机理、发掘抗旱相关重要基因奠定基础。 小麦种子在20℃生长箱中水培萌发后，12h/d光照培养幼苗长至一叶一心，用-0.5MPa的PEG-6000水溶液胁迫培养48h作为处理组(Tester)，水培48h作为对照组(Driver)，进行抑制差减杂交，构建具有1530个重组克隆的SSH文库。采用高密度点阵膜技术，利用正向和反向差减探针筛选文库，共得到阳性克隆181个。测序后获得152个质量较好的序列，其中101个为不重复EST，在GenBank里进行同源性比较和功能分析。序列同源性比较结果发现80％以上的EST可以找到同源性较高的cDNA，其中85％以上的cDNA来源于植物在生物与非生物胁迫条件下特异表达的cDNA文库，包括病原菌诱导、水分(干旱)、热、盐、冷害、铝胁迫及ABA处理等。在可以找到同源序列的EST中有50％以上的序列同时与几种胁迫文库的cDNA有较高的同源性，这说明各种逆境胁迫都直接或间接影响植物体的水分代谢，植物体对环境胁迫可能存在着某些共同的反应机制。功能比较分析结果发现84条EST的功能已知，基因产物为31种，大致可分为两类。一类是功能蛋白类，如光合作用相关酶类、热激蛋白、铁蛋白、糖代谢相关蛋白、蛋白酶类等，在细胞内可直接发挥保护功能。另一类是调控蛋白类，如转录因子、蛋白激酶等，在各种胁迫反应的信号转导或基因表达中起调节作用，间接起保护作用。采用反向Northern和RT-PCR方法验证功能已知EST的表达情况。功能未知的EST已经在GenBank注册。通过分析，初步建立了小麦幼苗水分胁迫诱导表达基因的表达谱。
王转, 臧庆伟, 郭志爱, 景蕊莲[3]2004年在《小麦幼苗期水分胁迫所诱导基因表达谱的初步分析》文中指出利用抑制差减杂交 (SuppressionSubtractiveHybridization ,SSH)和高密度点阵膜技术研究小麦 2叶幼苗期水分胁迫诱导表达基因。通过筛选具有 15 30个克隆的SSH文库 ,获得 181个阳性克隆。序列同源性比较和功能查询结果发现 ,83 2 %的水分胁迫诱导表达基因分别与不同逆境胁迫条件下表达的基因具有较高的同源性 ,这些基因在生物体内的功能都是直接或间接对细胞遭受逆境胁迫起保护作用。其中 17个EST未找到同源性较高的匹配序列 ,已经在GenBank注册。用反向Northern、RT PCR和Northern进一步检验所获得的功能已知EST ,初步建立了小麦幼苗期水分胁迫诱导的基因表达谱
参考文献：
[1]. 基于抑制差减杂交方法的小麦抗白粉病相关基因表达谱研究[D]. 骆蒙. 中国农业科学院. 2001
[2]. 小麦幼苗水分胁迫诱导的基因表达谱[D]. 王转. 中国农业科学院. 2003
[3]. 小麦幼苗期水分胁迫所诱导基因表达谱的初步分析[J]. 王转, 臧庆伟, 郭志爱, 景蕊莲. 遗传学报. 2004