谭小力[1]2003年在《拟南芥长链脂肪酰辅酶A合成酶基因的克隆及功能鉴定》文中指出油料作物种子中脂的降解对幼苗的建成十分重要，它为幼苗提供从自养生长转化为异养生长所需的能量及生长必需的物质。在成熟期，脂的降解能清除由于衰老而产生的对细胞有害的游离脂肪酸，使这些降解的脂重新进入到合成途径中。种子萌发时，油脂首先被水解成游离的脂肪酸，脂肪酸在脂肪酰辅酶 A 合成酶（LACS, EC6.2.1）的催化下生成脂肪酰辅酶 A，再进入脂肪酸的β-氧化途径。我们克隆并鉴定了一个脂肪酰辅酶 A 合成酶基因 LACS，定名为 LACS1，它编码一个分子量为 74.6KD，含有 660 个氨基酸的多肽。LACS 基因在拟南芥基因组中共有 9 个成员，LACS1 被聚类成独立的一组。在抑制 LACS1 表达的转基因拟南芥中，培养基中不加外源糖时，幼苗不能正常生长，而过量表达 LACS1 的转基因株和对照生长正常。抑制 LACS1 表达的转基因株脂类的降解受到了抑制，脂肪酸的分析表明，LACS1 对催化饱和的脂肪酸有偏好性。过量表达LACS1 基因，能使拟南芥后代种子的含油量比对照提高很多，而抑制表达 LACS1 转基因后代种子含油量比对照下降很多，这两种转基因植株对脂肪酸的组分没有影响。LACS1 参与了脂的降解，但没有参与过氧化物酶体的β-氧化途径，另外 LACS1 的 N 端含有线粒体的信号序列，LACS1 融合 GFP 在洋葱表皮细胞瞬时表达发现，LACS1 定位于细胞质中。可以推定 LACS1 参与了脂肪酸的线粒体β-氧化途径。RT-PCR 和 Northern分析表明，LACS1 在萌发后第 3 天至第 5 天，表达水平最高，随后下降。在成熟期，LACS1主要表达在花、花序及茎中，表明 LACS1 在萌发和幼苗期发挥作用，同时对成熟期的植株生长发育也有影响。 为了在油料作物油菜中利用 LACS1，以得到高含油量的油菜,以 LACS1 为探针，筛选油菜的基因组文库，得到 35 个阳性克隆，用酶切对 35 个阳性克隆分类，有 5 种类型，表明 LACS1 在油菜基因组中有 5 个同源基因。在拟南芥中检验了本实验室克隆的油菜种子特异表达的启动子 Napin,表明 Napin 驱动基因在幼苗的子叶和下胚轴表达，在成熟期驱动基因在角果皮中表达。
陈红, 余春娥, 孙汝浩, 李东栋, 郑育声[2]2017年在《拟南芥长链脂肪酰辅酶A合成酶基因(LACS1)的克隆及功能分析》文中研究说明长链脂肪酰辅酶A合成酶(LACS,EC6.2.1)催化脂肪酸生成脂肪酰辅酶A,进入脂肪酸的β-氧化途径。本课题从拟南芥中克隆了LACS家族成员At LACS1,构建表达载体,通过Li Ac转化法转入酵母表达系统中表达,气质色谱(GC-MS)检测酵母细胞中脂肪酸组成。结果表明,拟南芥LACS1基因全长为1 983 bp,编码一个含660个氨基酸的多肽。以含空载酵母细胞中脂肪酸组成为对照,过表达LACS1的酵母细胞中棕榈一烯酸(16:1)相对含量显着增加,硬脂酸(18:0)的相对含量显着减少。这些结果提示,At LACS1对脂肪酸代谢有一定的影响,能够活化游离的长链脂肪酸,尤其偏好C16和C18底物。
吕佳斌[3]2017年在《油桐长链脂酰辅酶A合成酶基因的克隆与功能表达研究》文中提出油桐(Veernicia fordii)隶属大戟科(Euphorbiaceae)油桐属,是我国四大木本油料树种之一。油桐的种仁含油量高达60%,个别超过70%,桐油的脂肪酸含量主要包含硬脂酸、软脂酸、桐酸、亚油酸、亚麻酸以及油酸,其中,桐酸是油桐所特有的脂肪酸,占总脂肪酸含量的80%左右,对桐油的理化性质起决定性作用。桐油具有良好的耐热、耐寒、耐酸碱、绝缘、防腐等性状,是一种环保型化工原料,可用于制作涂料、油漆、药品等。同时,桐油还是制作生物柴油的重要原料。本研究以油桐'葡萄桐'品种的种子、不同组织部位、器官以及不同种子发育时期为材料,在本实验室已经构建的油桐转录组数据库基础上,对于长链脂酰辅酶A合成酶家族基因中的VfLACS4、VfLACS6和VfL4CS7基因进行了全长cDNA的克隆以及相关表达分析,为进一步研究LACS基因家族以及油桐脂肪酸代谢提供理论依据,主要研究结果如下:1、油桐LACS基因家族中VfLACS6、VfLACS7基因的cDNA克隆以及生物信息学分析。以油桐'葡萄桐'品种近成熟种子为材料,在本实验已构建的油桐转录组数据库基础上,采用常规PCR扩增克隆技术,获得油桐长链脂酰辅酶A合成酶基因家族中两个成员基因的cDNA序列,分别将其命名为VfLACS6(GenBank登录号:KY012243)和 VfL4CS7(GenBank 登录号:KY012244)。其中,VfLACS6基因的 cDNA序列全长2085bp,ORF为2085bp,编码694个氨基酸,有4个比较明显的跨膜区,所编码的蛋白质分子量为76.11kDa,pI理论值为6.55;VfL4CS7基因的cDNA序列全长2088bp,ORF为2088bp,编码695个氨基酸,有8个比较明显的跨膜区,所编码的蛋白质分子量为77.30kDa,pI理论值为6.64。通过氨基酸比对发现,VfLACS6和VfL4CS7基因均具有AMP绑定链接(结合)域保守序列(ICYTSGTGDPK),表明这两个基因属于L4CS家族。2、油桐LACS基因家族中VfL4CS4、VfL4CS6和VfL4CS7基因的原核表达。利用pET30a和BL21(DE3)原核表达体系,在已经获得VfL4CS4、VfL4CS6和VfLACS7基因全长cDNA序列基础上,成功构建了原核表达载体pET30a-VfLACS4、pET30a-VfLACS6 和 pET30a-VfLACS7,并分别获得了表观量约为 74kDa、76kDa 和77kDa相应的目的蛋白。3、油桐LACS基因家族中VfL4CS4、VfL4CS6和VfLACS7基因的酵母表达。利用pYES2酵母表达体系,在已经获得的VfLACS4、VfLACS6和VfLACS7基因全长cDNA序列基础上,成功构建了酵母表达载体pYES2-VfLACS4、pYES2-VfLACS6和pYES2-VfLACS7,绘制相应生长曲线,获得VfL4CS6和VfL4CS7基因的相应目的蛋白。4、油桐LACS基因家族中VfLACS6和VfLACS7蛋白之间的互作关系分析。在已经获得的VfLACS6和VfL4CS7基因全长cDNA序列基础上,成功构建相应诱饵载体pGBKT7-VfLACS7以及文库载体pGADT7-VfLACS6,转入酵母菌株AH109中,经培养基培养以及X-gal显色反应实验验证,均证实VfLACS6和VfLACS7蛋白之间并无相互作用关系,从而说明VfLACS6与VfLACS7蛋白各自独立参与相应油桐油脂合成代谢及分解代谢。5、油桐LACS基因家族中VfLACS6和VfL4CS7时空表达分析。采用实时荧光定量PCR技术,分析了油桐不同组织、器官以及种子不同发育时期中VfLACS6和VfLACS7基因的表达量。VfL4CS6基因在根和茎中表达量最高,在花瓣中表达量相对较低,VfLACS6基因在油桐不同组织、器官的表达量由大到小依次为:根>茎>叶>花萼>雄蕊>柱头>子房>花瓣,说明VfLACS6基因在角质组成,油脂合成代谢中起到重要作用。VfLACS6在种子发育的9月20日相对表达量最高,在10月24日相对表达量最低;VfL4CS7基因在叶中表达量最高,其次为茎,在柱头中表达量最低,油桐VfLACS7基因在不同组织部位中的表达量由高到低依次为:叶>茎>根>花萼>雄蕊>花瓣>子房>柱头,由此推测,VfL4CS7基因有可能在叶片油脂合成中扮演重要角色。VfL4CS7基因只在种子发育的8月15日相对表达量最高,其余时期表达水平大致不变,表明VfLACS7基因在种子油脂合成初期对油脂合成起到关键作用。
郭小婧[4]2014年在《叁角褐指藻长链脂肪酰基CoA合成酶蛋白家族的基因克隆及功能分析》文中研究指明叁角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）是一种单细胞产油硅藻,是研究硅藻生物学的模式藻种。长链脂肪酰基CoA合成酶（long chain fatty acid acyl-CoAsynthetase,LACS）可以促使细胞吸收长链脂肪酸，将其活化生成脂肪酰基CoA，脂肪酰基CoA可以用于甘油叁酯（Triacylglycerol,TAG）的合成，β-氧化等代谢途径。本研究从叁角褐指藻中克隆得到了LACS蛋白家族编码基因（ptacsl），其蛋白家族包含PtACSL1-5。分别在酿酒酵母YB525(faa1Δfaa4Δ)中验证功能，以3种不同脂肪酸为底物测定了PtACSL的酶活。研究了叁角褐指藻在不同培养条件下，ptacsl的表达模式分析，及PtACSL5在faa4Δ酵母中的表达，分析其表达对外源二十二碳六烯酸（Docosahexaenoicacid,DHA）在甘油叁酯中积累量的影响。主要结果如下：（1）BLAST筛选出LACS蛋白家族候选蛋白，获取ptacsl全长序列后分析发现，PtACSL具有LACS蛋白家族典型特征，即AMP结合域、ACS信号基序和真核LACS蛋白所特有的连接域。重组质粒和空载体转化LACS缺陷型酿酒酵母YB525，诱导表达后通过Western blot检测显示，ptacsl1-5在YB525中均有目的蛋白表达。在同时添加油酸和浅蓝菌素的平板中，只有PtACSL1或PtACSL4的表达可以恢复YB525的生长。共聚焦显微镜检测转基因酵母细胞对荧光标记脂肪酸类似物C1-BODIPY-C12的吸收表明：只有ptacsl1或ptacsl4转基因酵母细胞内可以观察到荧光，进一步证实了PtACSL1或PtACSL4的表达可以促使YB525吸收外源脂肪酸。尼罗红染色酵母活细胞显示,表达PtACSL1或PtACSL4的酵母突变株胞内中性脂的合成量明显增加，表明这两个基因在将酵母胞内脂肪酸分拣到储存脂的合成途径中起着重要作用。PtACSL重组酵母初酶液对油酸，亚麻酸和二十二碳六烯酸都表现出一定的活性且不同底物间酶活性差异不大。（2）通过Real-time PCR检测了不同培养条件下ptacsl的表达模式分析。结果显示，叁角褐指藻退出稳定期0-60h内，ptacsl的表达量显着下降,表明在细胞旺盛分裂前期，ptacsl的表达不活跃。叁角褐指藻添加油酸培养0-60h内，ptacsl1-5的表达量均有轻微上调，表明油酸可以诱导ptacsl的表达。叁角褐指藻缺氮培养2d时，ptacsl1的表达量是对照的4倍，表明缺氮对诱导油脂合成起一定作用。（3）海链藻LACS蛋白TplascA在faa4Δ酵母中表达后，DHA在TAG中的含量是对照的6倍，tplacsa与ptacsl5为同源基因。将含ptacsl5的重组质粒和空载体转化faa4酿酒酵母，诱导表达后，检测外源DHA在TAG中积累量的改变，结果显示，以终浓度50μM DHA为底物时，转基因酵母中DHA整合进入TAG的含量是对照的10.6倍，表明PtACSL5的表达可以在一定程度上增加DHA在TAG中的积累。
参考文献：
[1]. 拟南芥长链脂肪酰辅酶A合成酶基因的克隆及功能鉴定[D]. 谭小力. 西北农林科技大学. 2003
[2]. 拟南芥长链脂肪酰辅酶A合成酶基因(LACS1)的克隆及功能分析[J]. 陈红, 余春娥, 孙汝浩, 李东栋, 郑育声. 分子植物育种. 2017
[3]. 油桐长链脂酰辅酶A合成酶基因的克隆与功能表达研究[D]. 吕佳斌. 中南林业科技大学. 2017
[4]. 叁角褐指藻长链脂肪酰基CoA合成酶蛋白家族的基因克隆及功能分析[D]. 郭小婧. 中国农业科学院. 2014