陈雪梅[1]2003年在《大鼠Mint2 PTB结构域的原核表达与多克隆抗体的制备》文中提出背景和目的 阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的病因之一是脑内淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Aβ)的产生和分泌，β来自脑内淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein，APP)。Mints(Munc18 interaction proteins)家族是一个接头分子家族，其家族成员中的Mint1和Mint2特异性表达于神经元中。许多研究表明Mints是调节APP代谢和Aβ产生的重要物质，被认为在阿尔茨海默病的病因、病理过程中发挥着极为重要的作用。 Mint2基因最初是在研究Mint1与APP的相互作用中被发现的。Mint2与APP结合可以调节APP的代谢和Aβ的产生。Mint2的PTB结构域与APP的C端YENPTY基序结合，抑制Aβ40的分泌，却不影响Aβ42的产生。当Mint2-APP复合体以Mint2的N端与XB51结合时，XB51-Mint2便从细胞膜转位到细胞浆中，XB51阻碍了Mint2-APP的结合，消除Mint2对Aβ40分泌的抑制作用。当Mint2的PDZ2结构域与单体NF-KB／P65 PHD域的161-FQV-163基序结合时，导致了Aβ42分泌水平的降低。因此，Mint2对Aβ分泌的抑制作用使其成为一个治疗AD的药物目标。 为在分子水平上深入探索Mint2 PTB结构域在APP代谢过程以及信号转导中的作用，本研究利用重组DNA技术构建大鼠Mint2 PTB结构域的融合蛋白表达质粒，在大肠杆菌中进行了PTB结构域蛋白的原核表达，同时制备了抗大鼠Mint2 PTB结构域小鼠多克隆抗体。获得的蛋白和抗体便于今后用于转染细胞或原代神经元的免疫印迹以及免疫共沉淀的实验，为进一步的功能研究提供了可靠的实验工具。郑州大学2003年研究生毕业论文大鼠M功tZ PTB结构域的原核表达与多克隆抗体的制备方法1.聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，P以)技术扩增大鼠肠ntZ pTB结构域片段:引物设计参照Genbank中大鼠MintZ PTB结构域的创ONA序列，利用DNAstar软件作为辅助工具，反应条件参照分子克隆略加改进。2.序列鉴定:使用双脱氧链终止法在上海基康公司进行DNA序列测序。3 .pGEX4T3一PTB重组质粒的获取:将PCR扩增片段和pGEX4T3载体分别用BamFa和Xhof双酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，获得pGEx4T3一TB重组质粒。4.pGEX4T3一TB重组质粒的扩增和鉴定:将pGEX4T3一，n3转化大肠杆菌TGI扩增后，进行质粒抽提，酶切鉴定。5.蛋白质表达和纯化:用pGEx碑T3一TB重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，正TG诱导表达后经15%SDS一聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS.PAGE)检测GST一珊(Glutathiones一transformase，GST)融合蛋白，利用电泳凝胶成像分析系统对GST一扭融合蛋白进行分析，目的蛋白采用谷光甘肤一sePharose4B亲和层析柱进行纯化。6.P阳结构域抗体的制备与检测:用纯化的GST一珊融合蛋白直接免疫BA工B/C小鼠获得抗血清，用结合有GST的亲和层析珠去除抗GST的抗体，用交联有GST一TB的SePharose一4B珠纯化抗PTB抗体;采用酶联免疫吸附试验(E几刁me linkedimmuno一sorbent ass即，ELIsA)和蛋白质印迹(westem blot)法检测抗体的效价和特异性。结果1 .PcR扩增片段电泳结果:PcR扩增片段有一条亮带，在与Marker soobP对应处。2.DNA测序结果:所得片段长度为sl3bp，测序图第79位至591位碱基对应大鼠珑ntZ PTB的cDNA第1 320位至1 832位碱基。3 .pGEx4T3一TB重组质粒鉴定:双酶切产物经1%琼脂糖电泳后，有二条亮带，一条位于Marker soobp对应处，另一条大于Z000bp。4.融合蛋白的表达和纯化结果:融合蛋白经聚丙烯酸胺凝胶电泳在约43 000处有目的条带，灰度扫描显示约20%的目的蛋白存在于上清液中，纯化后蛋白纯度高于95%。5.PTB结构域抗体效价及特异性检测结果:ELISA检测结果抗体效价可达l:26 730，研触stem blot检测在GST抗原处无免疫反应条带。郑州大学2003年研究生毕业论文大鼠Mixz份P功结构域的原核表达与多克隆抗体的制备结论 本研究成功构建了pGEx4T3一TB重组质粒，在大肠杆菌BL21内完成了GST一TB融合蛋白的可溶性表达，并利用GST一TB融合蛋白免疫BALB/C小鼠获得了最高效价为1:26 730的特异性抗大鼠MintZ PTB结构域的多克隆抗体，为免疫印迹和免疫共沉淀等实验提供了可靠的工具。
王永刚[2]2004年在《Mint2分子在正常大鼠脊髓中表达与分布的研究》文中提出背景和目的 Mints基因最早是作为弗里德赖西运动失调(Friedreich ataxia,FRDA)而被克隆的，命名为X11。在研究可以与阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)淀粉样蛋白前体(amyloid precursor protein,APP)结合的蛋白质时，发现X11分子可以通过其PTB结构域与APP结合，从而延长APP在细胞内的半衰期，并减少具有神经毒性且参与AD老年斑形成的β-淀粉样蛋白(amyloid β,Aβ)的分泌。这一发现为AD的预防和治疗提供了重要线索。随后在运用酵母双杂交技术研究可以与突触囊泡胞吐中发挥关键作用的膜转运蛋白Munc18-1结合的分子时，发现并且鉴定了两个可以与之结合的蛋白质，命名为Mint(Munc18.1 interactingprotein,Mintl,Mint2)。经过序列分析，显示Mint1和Mint2的部分序列是曾经被认为是FRDA的X11基因的表达产物X11蛋白。Masaya Okamoto证实人与鼠的X11蛋白是异构体，而且Mints蛋白在进化中是保守的。 到目前为止我们已知Mints家族有叁个成员，Mint1、Mint2和Mint3。其中Mint1和Mint2分子的分布具有神经元特异性，而Mint3分布较为广泛。Mints分子有着保守的羧基端和各异的氨基端。在羧基端有一个PTB结构域和两个PDZ结构域，同时Mints分子也是目前已知惟一既含有PTB结构域又含有PDZ结构域的蛋白质，通过其PTB和PDZ结构域可以广泛地参与神经元内信号转导、囊泡转运与递质释放、受体靶向定位等，并且可与APP结合调节其代谢，与其他含有PDZ结构域的分子结合形成网络广泛参与细胞的代谢等。通过对Mint分子的研究，我们对阿尔茨海默病的认识不断深入，这将有可能对该病的治疗提供新郑州大学2004年硕士研究生毕业论文M，ntZ分子在正常大鼠脊髓中表达与分布的研究思路。同时，对Mints分子的研究也能够为神经元间经突触的信息传递机制进行新的补充。故此Yatsuka等通过原位杂交技术和免疫组化技术对Mintl与MintZ分子在脑内的分布进行了详尽的形态学研究，对其在大鼠脑内的分布予以描述。在此基础上为了解Minis分子在突触囊泡胞吐过程中的作用，Yatsuka等通过电子显微镜对分布于海马神经元突触进行研究，阐述了Mintl分子在突触前膜和突触后膜的分布情况，Angela等通过western blot证实MintZ而不是Mintl分子在脊髓中有较高的表达。 为进一步阐明Mints分子在中枢神经系统的表达和分布情况，本实验采用原位杂交的厂方法，首次检侧了MintZ mRNA在大鼠脊髓中的表达一与分布。通过W。似，n川。t、荧光免疫组化法结合激光共聚焦显微镜‘c()11角cal)技术一首次阐述 r Min佗分子在脊髓中的分布与表达。实验发现Mi，lt2分子及其mRNA广泛分介:一f脊髓各节段神经元内，在神经元内MintZ分子在核周质和突起内均有表达少其中以前角运动神经元和后角边缘核内Min仅分子表达量较高。以卜这些研究元善了M山，2分子在中枢的分布，也为Mints分子在脊髓中的功能研究奠定形态学基础。方法1.构建表达质粒:通过分子克隆方法将MintZ分子411一656位碱基克隆入表达 载体pGEX4T3中，经酶切和测序鉴定。2.蛋白的表达与纯化:将构建好的质粒转化大肠杆菌BLZI，破菌提取诱导前与 诱导后总蛋白经SDS一PAGE电泳确认蛋白表达后，过柱纯化。3.MintZ自制抗体特异性检侧:通过Westem blot与商业抗体进行比较抗体的特 异性。4.用Westem blot检测MintZ分子在脊髓中的表达:正常大鼠脑和脊髓裂解处 理后，经10%SDS一聚丙烯酸胺电泳分离，再经电转膜后，加入抗体显色。5.构建转录模板质粒:利用DNAstar来设计探针序列，并在Genebank中进行 比较后确定体外转录序列，设计引物，通过PCR方法将体外转录探针序列扩 增，通过BamHI和EcoRI双酶切连入载体中。送测序鉴定。6.MintZ cRNA探针的体外转录:用BamHI将测序后的质粒模板线性化，在 r3转录酶作用下合成地高辛标记的cRNA探针。郑州大学2004年硕士研究生毕业论文MilltZ分子在正常大鼠脊髓中表达与分布的研究7.通过原位杂交来检测MintZ mRNA在脊髓各节段的表达:正常大鼠经灌注取 材后，冰冻切片，采用漂浮法进行原位杂交显色。8.免疫荧光组织化学染色:取大鼠脊髓，冰冻切片，采用贴片两步法显色。封 片后，用激光共聚焦显微镜(confocal)扫描切片并记录结果。结果1.SDS一队GE结果显示大肠杆菌BLZI经诱导后表达37kD的GST一MintZ融 合蛋白，与设计的蛋白大小一致。2.Westem blot结果显示自制抗体的特异性与商业抗体是一致的，并经免疫组化 吸收实验和空白对照实验证实其特异性。3.Westem blot结果显示在大鼠脑和脊髓中均有MintZ分子表达，而在阴性对照 肾脏中MintZ分子不表达。4.原位杂交结果:在脊髓颈段、胸段和腰段均可见到MintZ mRNA广一泛的分布 于脊髓灰质神经元中，在白质内无特异性染色;脊髓灰质各板层的神经元均表 达MintZ mRNA，其中前角运动神经元和后角边缘核中表达量较高，前角运 动神经元的外侧群表达更为明显;在神经元内MiniZ mRNA主要分布于核周 质和突起中，细胞核内未见有MintZ mRNA表达。同时通过与阴性组织大鼠 肝脏进行原位杂交?
张燕, 薛耀明, 郭爱林, 张文敏[3]2005年在《GST-IRS-4原核表达载体的构建、表达及抗GST-IRS4多克隆抗体的制备》文中研究说明目的:在大肠杆菌中表达胰岛素抵抗受体底物-4(insulinreceptorsubstrate4,IRS4)与谷胱甘肽-S转移酶的融合蛋白,并制备抗IRS4的多克隆抗体(pAb)。方法:从肝癌细胞系HepG2提取总RNA,用RT-PCR扩增出IRS4PTB结构域的cDNA,克隆入表达载体pGEX-Teasy中,重组载体酶切鉴定后,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达获得GST-IRS4蛋白,SDS-PAGE分析表达产物,包涵体经变性复性后,通过亲和层吸法纯化表达的GST-IRS4融合蛋白,并以此为抗原制备pAb。Westernblot检测重组抗原的免疫活性。结果:酶切及测序鉴定证明,IRS4基因已正确插入到pGEX-Teasy中,经IPTG诱导后,表达出相对分子量为44ku的融合蛋白。用Westernblot鉴定所制备的多克隆抗体可以与IRS4特异性结合。结论:IRS4片段在大肠杆菌中的成功表达及制备得到多克隆抗体,为检测IRS4及其在其他组织中的表达,进一步研究磷酸化酪氨酸结合结构域(PTB)的结构和生物学功能奠定基础。
张骐[4]2004年在《神经生长因子受体TrkA与胞内信号分子Mint2相互作用的研究》文中进行了进一步梳理NGF是最早发现的神经营养因子，它的作用除促进发育中的交感、感觉神经元分化、成熟、维持成年期的生存等功能外，还可阻止成年神经损伤后死亡。TrkA是NGF的高亲和力受体，分子量为140kDa，膜内域具有酪氨酸蛋白激酶活性。TrkA在NGF作用下发生二聚化，使胞内域中酪氨酸激酶区激活，从而使TrkA中酪氨酸自磷酸化，并进一步激活胞内信号转导通路，从而实现神经营养信号传递。 本实验室以往研究显示，运用酵母双杂交方法筛选人脑LexA cDNA文库，发现胞内信号分子Mint2可能与神经生长因子受体TrkA的胞内域相互作用。信号分子Mint2属于Mint胞浆蛋白家族，目前Mint家族已有叁个成员，即Mintl、2、3。Mintl、2仅在神经组织中表达，Mint3分布广泛，且Mint家族成员均含有一个中央保守的PTB功能域和C端两个PDZ功能域。文献报道，当Mint蛋白在哺乳动物细胞中过量表达时，它们可以增加细胞内β-APP蛋白的半衰期及其表达水平，并可以改变β-APP的代谢进程。β-APP可经β-和γ-分泌酶蛋白水解代谢后形成淀粉样蛋白Aβ，Aβ在老年斑中大量积聚是阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)发病机制淀粉假说的核心。因此，进一步明确TrkA受体与信号分子Mint2的相互作用，对于深入认识Mint2分子的生物学功能，以及深入了解老年性痴呆等神经退行性疾病的发病机制和寻求新的防治手段具有重要意义。 本研究主要结果如下： 将TrkA胞内域与LexA蛋白融合构建成的诱饵蛋白质粒pGilda-TrkA~(IC)，与构建成的Mint2全长及Mint2各结构域-AD融合蛋白质粒pB42AD-Mint2、pB42AD-Mint2-N、pB42AD-Mint2-PTB、pB42AD-Mint2-PDZ1、pB42AD-Mint2-PDZ2分别共转化HLY819。共转化子的β-半乳糖苷酶活力检测以及SD／Gal Ura~- His~-。Trp~-Leu~-平板生长实验发现：在酵母中Mint2-PTB象Mint2全长一样与TrkA~(IC)有较强的相互作用；Mint2-PDZ1、Mint2-PDZ2与TrkA~(IC)的结合较微弱；而Mint2-N与第二军医大学顿士学位论文H中英文摘要TrkAIC未见结合。 将MintZ一N段以及MintZ一PTB、MintZ一PDZI、MintZ一PDZZ结构域亚克隆到pGEX一4T3质粒中，构建成MintZ一pTB、MintZ一pDzl、MintZ一PnzZ结构域以及MintZ一N段的GST融合蛋白的表达质粒，利用大肠杆菌BL一21实现融合蛋白的原核表达，利用交联葡聚糖亲和层析法纯化，得到了MintZ各个功能域融合蛋白GST-PTB、GST-PDZI、GST-PDZZ以及GST-N段重组蛋白。培养PC12细胞，当细胞量达到1 x 107时裂解，收集裂解液。将各种融合蛋白分别加入PC12细胞裂解液中，进行谷肤甘肤S转移酶共沉淀分析。结果表明，GST-PTB与肠kA在体外存在相互作用;GST-PDZI、GST-PDZZ可与TrkA结合，但亲合力较弱;GST-N段不能与TrkA结合。 取大鼠基底前脑、小脑、脊髓组织匀浆液，用anti一MintZ抗体进行免疫共沉淀(IP)，用anti一肠kA进行western blotting检测(IB)。结果表明，大鼠基底前脑、脊髓的IP组在140KD处能检测到肠kA，而小脑IP组则未能检测到肠kA。用anti一TrkA抗体进行IP，再用anti一MiniZ进行IB。结果亦发现，在大鼠基底前脑、脊髓IP组12OKD处能检测到MintZ，小脑IP组则未能检测到MintZ。以上结果表明，TrkA与MintZ在大鼠基底前脑及脊髓组织中确实存在结合。 综上所述，本课题运用酵母双杂交、谷肤普肤S转移酶共沉淀、免疫共沉淀等实验方法，发现TrkA与MintZ在体内外均存在相互结合。本研究为今后更深入探索MiniZ参与受体胞内信号转导的可能作用、在特定部位神经元中的功能，以及了解MintZ与TrkA结合的生物学意义奠定了坚实基础。
王永刚[5]2007年在《Mint2与神经生长因子受体TrkA结合的生物学功能研究》文中研究表明本研究通过免疫共沉淀证实了TrkA与Mint2在大鼠DRG和基底前脑确实存在结合。利用特异性的Mint2抗体和TrkA抗体标记脊髓DRG组织切片,发现Mint2和TrkA在DRG神经元内共存。构建EGFP-Mint2、EGFP-TrkA和Myc-Mint2融合蛋白表达质粒,瞬时转染PC12细胞后,EGFP-Mint2、Myc-Mint2和EGFP-TrkA的细胞内分布与定位与文献相符,且在NGF作用下EGFP-TrkA会发生内化。通过PC12细胞分化实验发现Mint2过表达后抑制NGF诱导的PC12细胞分化。同时Mint2过表达后明显抑制DRG神经元突起生长,内源性Mint2被干扰后可促进DRG神经元突起生长。免疫细胞化学然色发现GFP-TrkA,myc-Mint2和WGA在细胞内有很强的共定位,提示GFP-TrkA与myc-Mint2在Golgi体有共定位。生物素标记后,免疫印迹检测发现myc-Mint2抑制GFP-TrkA上膜。应用生物素和streptavidin标记后染色显示发现NGF刺激后内化的GFP-TrkA弥散分布于细胞内,没有出现Golgi体聚集现象。提示Mint2分子引起的GFP-TrkA聚集发生在NGF刺激之前。
陈小玲, 王欢, 黄志清, 周波, 贾刚[6]2014年在《猪磷酸酪氨酸互作结构域1基因的融合表达及其多克隆抗体的制备和鉴定》文中认为本文旨在通过原核表达获得猪磷酸酪氨酸互作结构域1(p PID1)重组蛋白,并制备p PID1多克隆抗体。将p PID1基因插入p ET28a(+),构建重组p ET28a(+)-p PID1大肠杆菌表达质粒,然后将重组质粒p ET28a(+)-p PID1转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中,获得的重组子以不同异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)浓度、温度和时间诱导,确定p PID1融合蛋白表达的最适条件。将表达产物经镍离子-亚氨基二乙酸(Ni2+-IDA)亲和层析纯化后进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MSMS)鉴定。同时,将纯化获得的p PID1融合蛋白免疫SD大鼠,制备p PID1多克隆抗体,并检测抗体效价。结果表明:p PID1融合蛋白表达的最佳条件为30℃以0.1 mmol/L IPTG诱导4 h;纯化的融合蛋白经MALDI-TOF-MSMS鉴定为p PID1;特异性的p PID1多克隆抗体成功制备,抗体效价为1∶20 480。本试验成功制备了高纯度的重组p PID1及其多克隆抗体。
谢兴巧[7]2013年在《Mint2以“打开—闭合”构象变化来调节APP的代谢》文中提出阿尔兹海默病(Alzheimer's disease, AD)是一种神经退化性失调,困扰着全球数百万的老龄人。本文基于晶体结构及后续的生化和功能手段研究了在AD发病机制中起着重要作用的两个蛋白Mint2和amyloid-β protein precursor (APP)。Aβ的沉积是AD病的一个重要标志,它的产生来自APP有序分解。APP的转运和代谢的调节取决于结合到APP胞内末端的蛋白,这其中就包括Mint蛋白家族。Mint蛋白家族,是一个含多个蛋白-蛋白相互作用结构域的支架蛋白家族。Mint蛋白家族包括一个变化的氮端区域和一个保守性很高的碳端区域,其碳端区域包含一个重要的phosphotyrosine-binding (PTB)结构域,一对串联排列的PDZ结构域和最末端的C端(之后简称PPC)。通过这些结构域,Mints介导组装成功能各异的蛋白复合体,最引入注目的是能够调节APP的代谢过程和参与amyloid-β多肽(Aβ)的生成。Mint蛋白家族的PTB结构域能结合APP的YENPTY模序。但是APP动态结合Mint2的分子机制还不清楚。本文报道了结合及没有结合APP多肽的Mint2-PPC的两个晶体结构,其分辨率分别为3.3A和2.7A。这些结构表明没有结合APP多肽的Mint2-PPC以“闭合”的构象存在,在这个状态中ARM结构域盖住了PTB结构域的APP多肽结合口袋。而与之完全相反的是,结合APP多肽的Mint2-PPC以“打开”的构象存在,此时ARM结构域彻底从结合多肽处旋转开来。体内和体外实验证明了控制Mint2“打开—闭合”构象变化的不同突变体动态调节APP代谢。我们的实验结果揭示了PTB结构域一种崭新的“打开—闭合”构象变化动态地结合它的多肽底物的机制。此外,这种构象变化可能代表Mint蛋白家族调节APP蛋白家族的一种普遍模式,为AD疾病的治疗提供有用的信息。
林玲[8]2007年在《环加氧酶-2启动子区抑制性结合蛋白Nono的原核表达和多克隆抗体的制备》文中研究指明环加氧酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)是体内催化产生前列腺素(PGs)等炎症活性物质的关键酶。作为一种诱导型合酶，COX-2可被细胞因子、生长因子、有丝分裂原等多种刺激因素诱导表达。研究已证实，COX-2的异常高表达与炎症、肿瘤、心血管疾病以及糖尿病等多种疾病的发生发展密切相关。本实验室在前期工作中发现，小鼠COX-2启动子区-655／-632位置上存在着一个转录抑制元件，并且质谱鉴定提示与该元件相结合的其中一种DNA结合蛋白为Nono(non-POU-domain-containing，octamer-binding protein)。Nono是一种功能复杂的核蛋白，参与细胞核内RNA加工、基因的转录调控、DNA重组配对等多个核事件过程。为了在前期电泳迁移率改变实验的基础上，进一步验证Nono蛋白确实与此抑制性序列结合，本课题拟在大肠杆菌中表达Nono蛋白，作为抗原免疫小鼠制备Nono的多克隆抗体，用于超迁移实验。结果显示，pET-28a(+)-Nono重组表达质粒构建成功，在大肠杆菌中诱导表达出的His-Nono融合蛋白达到了作为抗原免疫小鼠的要求。最终获得了滴度较高，特异性较好的抗Nono抗血清，纯化出的抗Nono多克隆抗体不仅用于超迁移实验，也为以后进一步研究Nono蛋白在COX-2转录调控方面所起的作用打下基础。
王永刚, 张勇, 刘秀杰, 张照环, 何成[9]2005年在《Mint2分子在脊髓中的表达与分布研究》文中研究表明Mints蛋白质家族包括Mint1,Mint2和Mint3,其中前两者分布具有神经元特异性。在神经元内Mint1,Mint2通过Munc18-1结合结构域与囊泡胞吐关键分子Munc18-1结合,参与神经元内囊
刘翾[10]2005年在《信号分子Mint2与神经生长因子受体TrkA在体结合与功能研究》文中研究说明神经生长因子NGF(nerve growth factor)是神经营养素家族成员之一,该家族还包括BDNF,NT-3,NT-4/5,对于神经元的存活、生长、分化等具有重要的调节作用。NGF的效应受两类不同的细胞表面受体调控:受体酪氨酸激酶TrkA和p75神经营养素受体。NGF与TrkA结合后,可以促进TrkA发生二聚化和自磷酸化,激活与TrkA结合的下游信号分子,通过一系列的酶促级联反应,最终激活Ras-Raf-MAPK,PI-3K,PLCγ等信号传导通路,调控神经元的生长、分化、存活等生物学效应。TrkA属于受体酪氨酸激酶,分为胞外配体结合区,跨膜区和胞内的酪氨酸激酶区。胞内区含有多个接头蛋白的结合位点,如Shc、Grb2、SH2-B等,其中Y499、Y547、Y638、Y634等酪氨酸位点对于TrkA受体的激活及信号转导起关键作用。 Mint家族包括Mint1,Mira2和Mira3叁个成员,是一类含有多个结构功能域的蛋白分子,叁者除N端序列有所不同外,中间的PTB结构域和C端的2个PDZ结构域都具有很高的同源性。通过不同的结构域,Mint可以与不同的分子结合,如munc18-1、Cask、APP、NF-κB/p65、早老因子-1等,进而在突触囊泡递质的释放、β-淀粉样前体蛋白的代谢等方面起一定的调节作用。 本室在前期研究中,以TrkA胞内段为诱饵进行酵母双杂交筛选人脑cDNA文库,发现信号分子Mint2可以与之结合。在随后的研究中,利用免疫共沉淀和GST-PULL DOWN技术证实了Mint2和TrkA在脊髓和海马组织裂解液内存在结合。本研究拟运用免疫荧光标记等技术进一步确证Mint2和TrkA在神经元内的共定位,通过FRET技术检测两者在活细胞内的结合以及这种结合的配体依赖性,并进一步探索两者结合的功能意义。 本研究取得的结果如下: 1.利用特异性的Mint2抗体和TrkA抗体标记脊髓组织切片和体外培养的海马神经元,发现Mint2和TrkA在脊髓前、后角的神经元和海马神经元内均有共存,两者的共存部位主要集中在胞浆和部分突起中。 2.构建ECFP-Mint2和EYFP-TrkA融合蛋白表达质粒,瞬时共转染PCI2细胞,发现EYFP-TrkA和ECFP-Mint2在胞浆内有共定位,所得结果与内源性
参考文献：
[1]. 大鼠Mint2 PTB结构域的原核表达与多克隆抗体的制备[D]. 陈雪梅. 郑州大学. 2003
[2]. Mint2分子在正常大鼠脊髓中表达与分布的研究[D]. 王永刚. 郑州大学. 2004
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[4]. 神经生长因子受体TrkA与胞内信号分子Mint2相互作用的研究[D]. 张骐. 第二军医大学. 2004
[5]. Mint2与神经生长因子受体TrkA结合的生物学功能研究[D]. 王永刚. 第二军医大学. 2007
[6]. 猪磷酸酪氨酸互作结构域1基因的融合表达及其多克隆抗体的制备和鉴定[J]. 陈小玲, 王欢, 黄志清, 周波, 贾刚. 动物营养学报. 2014
[7]. Mint2以“打开—闭合”构象变化来调节APP的代谢[D]. 谢兴巧. 南开大学. 2013
[8]. 环加氧酶-2启动子区抑制性结合蛋白Nono的原核表达和多克隆抗体的制备[D]. 林玲. 南京医科大学. 2007
[9]. Mint2分子在脊髓中的表达与分布研究[C]. 王永刚, 张勇, 刘秀杰, 张照环, 何成. 中国神经科学学会第六届学术会议暨学会成立十周年庆祝大会论文摘要汇编. 2005
[10]. 信号分子Mint2与神经生长因子受体TrkA在体结合与功能研究[D]. 刘翾. 第二军医大学. 2005
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