李琦[1]2002年在《一、色氨酸类似物标记法研究蛋白质的结构和功能 二、大肠杆菌硫氧化还原蛋白DsbA和DsbE的氧化还原性质、构象变化和功能关系》文中指出本论文分为两部分,第一部分是用色氨酸类似物标记法研究蛋白质的相互作用(第一章);第二部分是大肠杆菌硫氧化还原蛋白DsbE和DsbA的氧化还原性质、构象变化和功能关系(第二章,第叁章)。在研究蛋白质的构象、相互作用以及动力学过程中,色氨酸残基常常被当作探针来使用。但是,在涉及两个以上蛋白质的复杂体系中,无法从多个色氨酸残基中有效地区别其中一个色氨酸残基的光谱信号,从而限制了它的使用。利用生物合成的办法,可以在蛋白质的色氨酸位点引入它的类似物。这些类似物具有不同于天然色氨酸的光谱性质。在论文的第一章中,分别用色氨酸类似物5HW (5-hydroxytryptophan)或7AW (7-azatryptophan)对PGBD(IgG binding domain of Streptococcal protein G)进行生物标记。由此产生的新的激发波长和荧光变化(包括荧光强度及各向异性),有利于研究该蛋白与配体IgG片段相互作用的细节,从而可以评价它们之间的结合能力。所得到的它们之间的解离常数(人和鼠Fc 片段与PGBD的解离常数分别为0.28 (M 和8.0 (M),与文献中用其它得到的结果相吻合。第二章中的部分内容,利用定点突变结合色氨酸类似物标记技术,研究了DsbA蛋白的氧化还原性质和构象的变化。结果表明,这种标记方法,可以在不影响蛋白质结构和功能的前提下,来定量研究一个复杂的蛋白体系中蛋白质间的相互作用以及一个蛋白质的局部构象变化。DsbA是第一个被发现的细菌周质硫氧化还原蛋白。第二章中,利用定点突变结合色氨酸类似物标记技术,我们研究了DsbA蛋白的氧化还原性质和局部构象的变化。结果显示:1)DsbA可以有效地催化二硫键的形成,是一个氧化酶;同时DsbA蛋白的还原态比氧化态的结构更加稳定,说明DsbA的氧化性来源于氧化态在构象上的紧张状态。2)DsbA氧化、还原态间特殊的荧光变化,主要来源于Trp76周围局部构象在不同状态间的差异。3)利用19F-NMR进一步证实了DsbA氧化还原状态间的变化主要影响Trp76的局部环境,而对Trp126的局部环境没有太大的影响。大肠杆菌的DsbE蛋白(也被称为CcmG 蛋白),全长含189个氨基酸残基,其中N端的疏水肽段可以引导蛋白质跨越细胞膜,进入周质空间,且停留在膜上,使蛋白质其余部分朝向周质空间。DsbE含有一个硫氧化还原蛋白(thioredoxin)结构域,该结构域通常存在于催化二硫键拆合的蛋白质中(如PDI、Thioredoxin和DsbA等)。细菌遗传学实验显示,DsbE蛋白是细胞色素c成熟所必需的,而且活性位点CPTC的两个半胱氨酸残基十分重要。在论文的第叁章中,我们表达、纯化了引导肽缺失的DsbE蛋白(称DsbEL-), 并研究了它的结构和功能性质。我们所得到的结果对于了解这个蛋白提供了重要的证据。1)DsbEL- 是一个弱还原蛋白,它可以催化底物蛋白二硫键的拆开。但是活性位点半胱氨酸残基的反应性很低,仅为DsbA的万分之一。 2)在氧化还原反应过程中,氧化态DsbEL-经历构象变化,变成更为稳定的还原态;不同氧化-还原状态下,内源荧光发射谱、圆二色性谱以及对色氨酸对化学修饰剂的敏感性等都显示出差异。我们还表达、纯化了DsbE的<WP=3>thioredoxin结构域 (称为Δ57DsbE)。对它的研究得到了与DsbEL- 类似的结果,而且氧化态、还原态间的差异与DsbEL-相比更加明显。基于以上的实验结果,我们推测:DsbE 可以维持脱辅基细胞色素c(apocytochrome c )的巯基处于还原态,以利于卟啉的插入。推测在这个过程中,还原态的DsbE既可能直接作为一个还原剂,也可能作为其它硫氧化蛋白或小分子的辅助因子,参与电子的传递过程。FBP11是一个与发育相关的蛋白质,它同时含有多个结构域并且可以专一地与其它蛋白的脯氨酸丰富区相结合。第四章中,我们表达和纯化了其羧基端一个FF结构域,探讨了FF结构域与磷酰化丝氨酸的结合性质。并对FF结构域进行了15N标记,进一步用NMR解析它的空间结构。
佚名[2]2004年在《化学生物学》文中研究表明03-I-001膜透性cADPR类似物的合成及其钙诱导活性的评价古险峰,黄力军,杨振军,张亮仁,张礼和,S.Kunerth,A.H.Guse 北京大学药学院,北京100083,zdszlh@bjmu.edu.cnUniversity Hospital Hamburg-Eppendorf,Center of Experimental Medicine,Hamburg,Germany N1-[(5”-O-磷酰-乙氧基)-甲基]-5’-O-磷酰基-肌苷-5’,5”-环焦磷酸酯(cIDPRE)(2)是由N1-[(5"-乙酰-O-乙氧基)一甲基]-2',3’-0-异亚丙基肌苷经过7步反应合成。在人的完整的膜透性Jurkat T-淋巴细胞中,cIDPRE不仅能够透过细胞膜诱导细胞内cADPR(1)敏感的Ca2+库释放,而且能够通过钙诱导钙内流的机制引起钙离子释放。定量分析表明cIDPRE诱导钙离子释放的活性要略低于cADPR,激光共聚焦显微镜对单细胞的考察结果显示,cIDPRE引起钙信号从细胞边缘局部的小区域逐步蔓延到整个细胞。实验结果表明,cIDPRE是新颖的膜透性的cADPR类似物,可作为研究完整细胞中cADPR介导的钙信号通道的重要工具。
杨海军[3]2004年在《L-色氨酸发酵条件优化及其发酵动力学分析》文中认为本文以代谢控制发酵理论为指导,对L-色氨酸产生菌TQ2223进行了摇瓶发酵条件、5L发酵罐发酵条件的优化,并对其发酵动力学分别进行了研究。主要研究内容和结果如下: [1]对供试菌株L-色氨酸产生菌TQ2223(Phe~-+Tyr~-+5-MT~r+5-FT~r+SG~r+CIN~r)进行了抗性标记和缺陷型标记的验证,并对其产酸能力进行了验证。该菌株在未优化的条件下摇瓶发酵72h产酸6.86g/L。 [2]研究了菌株TQ2223摇瓶发酵条件。对种子培养基和发酵培养基进行了优化,并研究了种子培养条件和发酵培养条件。在优化的条件下,TQ2223在摇瓶上发酵72小时产量达到达8.65g/L。 [3]以摇瓶分批发酵最优条件为基础,对菌株TQ2223进行了5L发酵罐分批发酵试验,并进行了溶氧对发酵影响的研究。在此基础上对L-色氨酸分批发酵动力学进行了研究,建立了菌体生长、产物形成和底物消耗的动力学神经网络模型,拟合模型能较好地反映L-色氨酸分批发酵过程。 [4]以分批发酵最优条件为依据,对菌株TQ2223进行了补料摇瓶分批发酵试验和5L发酵罐补料分批发酵试验,研究了在不同添加量及不同添加方式下,添加葡萄糖、硫酸铵及TQ2223缺陷型物质L-苯丙氨酸、L-酪氨酸对L-色氨酸发酵的影响。通过以上研究,在5L罐上发酵72h产L-色氨酸13.4/L。
王健[4]2004年在《直接发酵法生产L-色氨酸的研究》文中指出本论文在代谢控制发酵和代谢网络分析理论的指导下,研究了直接发酵法生产L-色氨酸的发酵条件及其分离提取方法。主要研究内容和结果如下: [1]确定了改进的比色法测定L-色氨酸的测定条件,所开发的方法对L-色氨酸测定的范围为0~100μg/mL,工作曲线方程为C=23.56A(其中C为色氨酸浓度,A为吸光度)。相关指数为R~2=0.9972。与经典比色法相比,用改进比色法测定L-色氨酸的含量,具有很高的准确度,且简单、快速。 [2]应用正交设计试验法,确定了种子培养基的最佳组成,并研究了最佳种子培养条件;应用模式识别法,优化出摇瓶分批发酵培养基的最佳组成,并研究了发酵培养条件。优化条件与初始条件的摇瓶分批发酵比较试验结果表明,菌株TQ2223在优化条件下的L-色氨酸产量(8.6g/L)比初始条件下(6.86g/L)提高了25.4%。 [3]应用途径分析方法分析了谷氨酸棒杆菌TQ2223菌株由葡萄糖发酵生产L-色氨酸的途径,确定了L-色氨酸合成的最佳途径及其代谢流分布和最大理论产率;建立了谷氨酸棒杆菌合成L-色氨酸(L-Try)的代谢流量平衡模型,通过MATLAB软件计算出发酵中后期的代谢流分布,通过发酵中后期的代谢流分布与途径分析所得到的理想代谢流相比较,提出减少铵离子、增加磷酸盐浓度和改善溶氧水平的代谢控制策略,为L-色氨酸发酵过程控制提供理论指导。同时,提出了L-色氨酸基因工程菌构建的策略。 [4]在代谢网络定量分析理论的指导下,研究了NH_4~+扰动和磷酸盐扰动对L-色氨酸发酵的影响,结果表明氨水用量为62mL,于发酵16h、28h、40h和52h流加氨水调节pH,每次流加15.5mL,其它时间流加NaOH调节pH;KH_2PO_4浓度10g/L,有利于L-色氨酸代谢流的增加。根据5L发酵罐中溶氧变化情况,结合发酵过程的动力学分析及发酵过程中代谢流分配的特点,提出了发酵0~36h控制溶氧为30%、36h后控制溶氧为20%的分阶段供氧控制模式,并加以试验验证,发酵64h谷氨酸棒杆菌TQ2223菌株L-色氨酸的产量达到10.13g/L。以5L罐分批发酵试验数据为依据,利用神经网络对L-色氨酸分批发酵动力学进行了初步研究,建立了菌体生长、产物形成和底物消耗的动力学模型并加以拟合,结果表明拟合模型能较好地反映L-色氨酸分批发酵过程。
田伦富[5]2011年在《蛋白质与金属配阴离子和生物大分子相互作用的共振瑞利散射光谱研究》文中研究指明本文主要研究蛋白质与[Hg(SCN)4]2-、[Zn(SCN)4]2-等金属配阴离子、蛋白质与蛋白质、蛋白质与肝素钠之间发生相互作用时对吸收光谱、荧光光谱和共振瑞利散射光谱的影响。研究探讨了它们之间相互作用的机理、结合模式、结合位点以及结合作用力等,并发展和建立了测定蛋白质和肝素钠的新方法。主要研究内容如下:1. [Hg(SCN)4]2-与蛋白质相互作用的共振瑞利散射光谱及其分析应用在pH 1.0-4.5的稀硫酸介质中,[Hg(SCN)4]2-配阴离子与人血清白蛋白(HSA)、α-糜蛋白酶(α-Chy)、牛血清白蛋白(BSA)、溶菌酶(Lyso)和Y-球蛋白(γ-G)等蛋白质反应形成复合物,此时将导致共振瑞利散射(RRS)的显着增强,也能引起吸收光谱的变化和荧光猝灭,同时还观察到圆二色(CD)光谱特征的改变。本文主要研究[Hg(SCN)4]2--蛋白质复合物的RRS光谱特征,适宜的反应条件和影响因素以及某些分析化学性质,并以[Hg(SCN)4]2--Lyso体系为例,结合吸收、荧光和圆二色光谱的变化,对复合物的结合位点、结合模式以及散射增强的原因进行了讨论。RRS法具有较高的灵敏度,它对不同蛋白质的检出限在4.6-10.8ng/mL之间,据此建立了以[Hg(SCN)4]2-配阴离子作探针测定人血液和尿液中蛋白质的新方法。2. [Hg(SCN)4]2-与血红蛋白相互作用的荧光和共振瑞利散射光谱研究在pH7.4的生理条件下,[Hg(SCN)4]2-配阴离子能与血红蛋白(Hb)发生相互作用并形成10:1的复合物,此时将导致溶液的共振瑞利散射(RRS)的显着增强并出现相应的散射光谱,其最大散射波长位于313 nm附近。本文根据反应产物对共振光散射光谱的影响,结合[Hg(SCN)4]2-对Hb的荧光猝灭作用和圆二色光谱的变化,讨论了[Hg(SCN)4]2-与Hb的相互作用、结合位点和结合模式。3. [Hg(SCN)4]2-对蛋白质的荧光猝灭反应及其分析应用在pH 1.4-3.4的酸性介质中,[Hg(SCN)4]2-配阴离子可与牛血清白蛋白(BSA)、γ-球蛋白(γ-G)和血红蛋白(Hb)等蛋白质反应形成复合物,此时将引起蛋白质荧光的猝灭。荧光猝灭程度在一定范围内与Hg(Ⅱ)的浓度成线性关系,对Hg(Ⅱ)测定的线性范围为0.015-1.25μg/mL,检出限(3σ)分别为4.4 ng/mL (BSA)、6.5 ng/mL (y-G)和12.9 ng/mL (Hb)。文中研究了适宜的反应条件和影响因素,考察了共存物质的影响,表明方法有良好的选择性,可用于红药水和乙肝疫苗中汞的测定。此外,通过研究[Hg(SCN)4]2--BSA体系吸收光谱的变化、温度的影响以及Stern-Volmer作图,判断该反应为静态猝灭反应。4. [Zn(SCN)4]2-与蛋白质相互作用的共振瑞利散射光谱及其分析应用在pH 1.75-1.90的酸性介质中,[Zn(SCN)4]2-与某些非酶蛋白质[如人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、血红蛋白(Hb)、γ-球蛋白(γ-G)]和某些蛋白质酶[如α-糜蛋白酶(α-Chy)、溶菌酶(Lyso)]相互作用时,不能使吸收光谱和荧光光谱发生改变,但是却能引起共振瑞利散射(RRS)和二级散射(SOS)、倍频散射(FDS)等共振非线性散射(RNLS)的显着增强。不同蛋白质体系具有相似的散射光谱特征,其最大RRS、SOS和FDS波长分别位于290 nm、552 nm和392 nm附近,但相对强度有一定差异,其中以HSA、y-G和Hb体系灵敏度更高。当用RRS法时,对于HSA、y-G和Hb的检出限在4.9-7.8ng/mL之间,本文研究了反应体系的RRS光谱特征,适宜的反应条件和影响因素,考察了方法的选择性,并建立了以[Zn(SCN)4]2-作探针RRS法测定人血清和人尿液中总蛋白质的方法。文中还以[Zn(SCN)4]2--HSA体系为例讨论了复合物的结合比、它们之间的主要作用力和可能的结合模式。表明RRS法是研究蛋白质中非芳香族残基与其它分子相互作用的有效手段,这也是吸收光谱法和荧光法所不具备的优点。同时还可以从研究的体系中发展出用RRS技术高灵敏度测定蛋白质的新方法。5.胃蛋白酶与溶菌酶相互作用的共振瑞利散射和共振非线性散射光谱及其分析应用研究在pH 4.8-5.6的酸性介质中,带多个负电荷的胃蛋白酶(Pep)与带大量正电荷的溶菌酶(Lyso)可借静电引力、氢键作用力和疏水作用力而形成1:2的结合产物,这将引起共振瑞利散射(RRS)和二级散射(SOS)、倍频散射(FDS)等共振非线性散射(RNLS)的显着增强,其最大RRS波长位于290 nm附近。散射增强(ΔI)在一定范围内与Lyso的浓度成线性关系,可用于痕量Lyso的测定。叁种方法对Lyso的检出限分别为4.3 ng/mL(RRS)、4.5 ng/mL(SOS)和23.6ng/mL(FDS),灵敏度均较高,据此建立了以Pep作探针测定人唾液和鸡蛋清中Lyso的新方法。本文研究了反应体系的RRS、SOS和FDS光谱特征,适宜的反应条件和影响因素。干扰实验表明其他常见蛋白质基本不干扰Lyso的测定,因此本法对Lyso的测定具有较好的选择性。文中还对复合物的结合模式和散射增强的原因进行了讨论。6.肝素钠与蛋白质相互作用的共振瑞利散射和共振非线性散射光谱及其分析应用研究在适当酸度的NaAc-HCl缓冲溶液介质中,肝素钠(Hep)因其硫酸酯基离解而以带多个负电荷的大阴离子存在,而人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、Hb血红蛋白(Hb)、木瓜蛋白酶(Pap)和鸡卵白蛋白(Alb-egg)等蛋白质因处于其等电点(pI)之下,则以带多个正电荷的大阳离子存在,两者可借静电引力、氢键作用、疏水作用而结合形成复合物,此时将引起RRS和SOS、FDS等RNLS的显着增强并出现新的散射光谱。3种散射的增强程度(ΔI)均在一定范围内与Hep的浓度成正比,均可用于对Hep的测定,其中Hep-HSA体系的RRS法灵敏度最高,对Hep的检出限为3.1ng/mL。本文研究了适宜的反应条件,考察了共存物质的影响,表明方法有较好的选择性。基于此建立了一种灵敏度高、简便、快速测定Hep的新方法。7.肝素钠与溶菌酶相互作用的吸收、荧光和共振瑞利散射光谱研究在pH 7.4的生理条件下,带多个正电荷的碱性蛋白Lyso可通过静电引力和疏水作用力与带多个负电荷的Hep结合形成1:1的复合物,此时不仅会引起吸收光谱的变化和Lyso的荧光猝灭,而且将导致RRS显着增强,我们研究了Hep-Lyso复合物的RRS光谱特征,适宜的反应条件和影响因素以及某些分析化学性质,并结合吸收、荧光和圆二色光谱的变化,讨论了Hep与Lyso之间的反应机理和结合模式,认为静电引力和疏水作用是二者间的主要作用力,而分子体积增大、疏水界面的形成及荧光-散射共振能量转移作用是共振光散射增强的重要因素。
童裳伦[6]2005年在《稀土络合物荧光探针对DNA的分析及其在重金属与DNA作用研究中的应用》文中进行了进一步梳理近年来,离子探针方法及其应用越来越受到人们的重视,正逐步发展成为一种常规的测试手段,广泛应用于生物学、医学、化学等学科,特别是在生物大分子结构与功能研究中,有着广阔的应用前景。目前大多数DNA荧光探针试剂具有很强的毒性,可能为致突变剂,尤其是当其与DNA的结合为不可逆的。因此,对毒性低、选择性好、灵敏度高的DNA探针的研究是一个非常有前景的研究领域。本论文总体分为四个部分,具体的研究内容与取得的结果如下: 第一部分:结合自己在稀土离子荧光探针及其应用领域所做的工作基础上,比较系统地介绍了稀土离子荧光探针在药物与生化分析中的应用以及在生物大分子中的应用研究进展。在稀土荧光探针及其应用方面进行了如下研究:(1)人工合成的双酰代吡唑酮类螯合剂,1,6-双(1’-苯基-3’-甲基-5’-吡唑酮-4’-基)已二酮(BPMPHD)是一种新型的稀土离子荧光配体,具有优良的螯合性能。BPMPHD能与Dy~(3+)离子和阳离子表面活性剂溴代十六烷基叁甲胺(CTMAB)形成稳定的叁元离子缔合物并发射出Dy~(3+)的特征荧光峰,Gd~(3+)离子的加入,能与该体系形成共发光效应,增强了体系的荧光强度,在详细研究该共发光体系的影响因素基础上,建立了灵敏测定痕量稀土Dy~(3+)的分析方法,其测定线性范围为1.0×10~(-7)-1.3×10~(-5)mol/L,检出限为2.0×10~(-8)mol/L(S/N=3)。(2)实验发现稀土铽离子能与去甲肾上腺素发生络合反应,并发射出铽离子的特征荧光。在对铽离子与去甲肾上腺素的络合发光反应进行详细研究的基础上,提出了一种简便、快速、灵敏检测去甲肾上腺素的新方法,其检出限可达1.0ng/mL(S/N=3)。(3)实验发现,抗坏血酸在水溶液中能将无荧光的铈(Ⅳ)离子还原成能发射特征荧光的铈(Ⅲ)离子,加入叁磷酸钠,可使体系的荧光强度大大增强,由此建立了间接灵敏测定抗坏血酸的方法,其检出限为1.0x10~(-8)mol/L(S/N=3)。(4)研究表明,在表面活性剂SDBS存在下,能使氟喹诺酮-铽体系荧光强度大大增强,由此建立了表面活性剂敏化的铽离子荧光探针灵敏测定氟喹诺酮类药物的分析方法,其检出限可达10~(-9)mol/L(S/N=3),为临床检测与药动力学研究以及环境中氟喹诺酮类药物含量的监测提供灵敏,快速,简便的方法。
谢成根[7]2007年在《纳米结构TNT分子印记探针及其仿生敏感性能研究》文中认为分子印记技术是通过模板分子的诱导作用,获得在空间结构和结合位点上与模板分子完全匹配的聚合物材料的过程。由于分子印记材料具有高度机械和化学稳定性、低成本、容易制备等优点,因而被广泛应用在分离、化学传感器、催化剂和药物释放等领域。本文首先对分子印记技术的基本原理、分子印记聚合物的制备、分子印记技术应用状况以及分子印记技术新发展进行了较为全面的综述和评价,探讨了当前分子印记技术所面临的机遇和挑战。一种理想的分子印记材料应该具备模板分子能完全除去,印记材料能后功能化,具有完整、均一和稳定的印记位点,对目标分子具有高亲和力,快速结合动力学等特点。但是通过传统方法制得的印记聚合物上大多数分子识别位点都包埋在高交联密度的聚合物内部,从而导致了分子印记材料虽然具有较高的分子识别选择性,但具有结合容量低、位点可接近性差以及结合动力学慢的特点。因此,通过控制印记位点位于合成印记材料表面,对提高印记位点的有效性和位点可接近性具有十分重要的意义,作为一种可以选择的印记方法,纳米结构分子印记材料具有较高的比表面积,印记材料上大多结合位点位于或接近材料表面,所以发展合成纳米结构分子印记材料有望真正解决传统分子印记遇到的困难,以便进一步推动分子印记技术的发展。本论文重点针对TNT分子识别与探测,运用纳米技术、表面功能化设计和分子印记技术等手段,发展制备具有高密度印记位点、高选择性、高亲和力和快速结合动力学的TNT印记纳米微球、纳米线和纳米管材料,探索纳米结构分子印记材料对痕量目标分子的识别特性和敏感机制。以爆炸物TNT分子为模板分子,采用沉淀聚合法一步合成具有纳米大小的TNT分子印记聚合物微球。实验表明,单体的类型和浓度、聚合温度、引发剂的用量等条件影响聚合物微粒粒径的大小和均匀程度。结合实验表明,相比传统方法制备的大块印记聚合物,纳米尺度的印记聚合物微球对模板TNT分子具有更高的选择性亲和力和更快的结合动力学特性。Scatchard分析结果表明,在TNT印记聚合物微球中存在两类结合位点,这表明在聚合反应之前,TNT与功能单体丙烯酰胺分子之间存在两种不同类型的作用力而自组装成两类的模板分子-功能单体复合物,一类可能是由于富电子的丙烯酰胺和缺电子的TNT的苯环通过p-π配键而形成的电荷转移复合物,另一类可能是由于丙烯酰胺的胺基与TNT的硝基之间的氢键作用而形成的复合物。利用表面分子自组装策略在氧化铝模板中制备TNT分子印记聚合物纳米线/纳米管阵列。印记策略是基于缺电子的TNT与富电子胺丙基(-CH_2NH_2)强烈的电荷转移作用,诱导TNT在APTS修饰氧化铝模板孔壁上的自组装,而不是利用复杂的化学反应将模板分子固定到氧化铝模板孔壁表面。另一方面,在聚合混合溶液中加入了一定量的模板TNT分子,以便在合成的聚合物纳米材料内部形成TNT正常的印记位点,从而进一步增大合成印记材料的TNT印记位点数量。通过采用叁步渐进升温的过程,控制聚合反应以一个缓慢而渐进的速度进行,以便在氧化铝模板中合成出高质量TNT印记聚合物纳米线/纳米管阵列。相比传统印记聚合物材料,具有高密度的表面印记位点和正常内部印记位点的TNT印记纳米线/纳米管能显着提高对TNT分子结合容量、结合动力学和分子识别选择性。氧化硅材料具有刚性强,不易溶胀,结合位点的保持性好,容易进行后功能化修饰等优点,因此氧化硅材料特别适合用于制备具有专属性亲和力和分子结构选择性分子识别材料,本文利用溶胶-凝胶法在APTS修饰的氧化铝模板孔隙中制备具有超薄管壁的TNT印记氧化硅纳米管。在溶胶-凝胶化过程中,富电子的APTS与缺电子的TNT因电荷转移作用形成的APTS-TNT复合物能被有效的保留到氧化硅纳米管中,在氧化硅纳米管壁上形成TNT的分子印记位点。另一方面,APTS修饰的氧化铝模板能诱导TNT分子在氧化铝模板孔壁上表面的自组装,从而有效提高氧化硅纳米管外表面的印记位点密度。氧化硅溶胶与APTS修饰的氧化铝模板孔壁之间存在一定静电和化学亲和力的作用,通过控制氧化铝模板纳米孔隙中氧化硅溶胶的凝胶化温度,使孔隙中氧化硅凝胶化以一个较缓慢速度进行,以保证纳米孔隙中氧化硅溶胶能在静电和化学亲和力的作用下主要向氧化铝模板管壁垂直方向的收缩,有利于在氧化铝模板孔隙中制备具有高质量印记氧化硅纳米管阵列。进一步,利用胺基(-NH_2)与异硫氰(-NCS)的反应生成硫脲键,将含有荧光试剂FITC以共价键形式键合到二氧化硅纳米管壁上,对结合位点进行荧光标记。当TNT分子进入含有荧光标记的氧化硅纳米管上的分子识别位点时,荧光团FITC分子的激发态电子通过共振转移到缺电子的TNT分子的能级上,产生电子共振转移荧光淬灭,从而获得目标分子结合的敏感识别信号。
高大明[8]2007年在《二氧化硅纳米粒子表面的分子印记识别和TNT的荧光探测》文中研究说明分子印迹技术(Molecular imprinting technology)是一种制备对特定分子具有专一识别性能的聚合物的技术,分子印迹聚合物(molecularly imprinted Polymers,MIP)对模板分子的识别具有构效预定性、特异识别性和广泛实用性等优点。并且,基于分子印迹技术制备的分子印迹聚合物材料具有高亲和性和选择性、抗恶劣环境能力强、稳定性好、制备成本低、使用寿命长,应用范围广等优点而在分离提纯、免疫测定、生物模拟、仿生传感、催化、环境的痕量分析、药物释放等以及相关领域显示出广阔的应用前景。本文首先对分子印记技术的基本原理、分子印记聚合物的制备、分子印记技术应用状况以及分子印记技术新发展和荧光发射能量转移机理进行了较为全面的综述和评价,探讨了当前分子印记技术所面临的机遇和挑战。一种理想的分子印记材料应该具备模板分子能完全除去,印记材料能后功能化,具有完整、均一和稳定的印记位点,对目标分子具有高亲和力,快速结合动力学等特点。但是通过传统方法制得的印记聚合物上大多数分子识别位点都包埋在高交联密度的聚合物内部,从而导致了分子印记材料虽然具有较高的分子识别选择性,但具有结合容量低、位点可接近性差以及结合动力学慢的特点。因此,通过控制印记位点位于合成印记材料表面,对提高印记位点的有效性和位点可接近性具有十分重要的意义,作为一种可以选择的印记方法,纳米结构分子印记材料具有较高的比表面积,印记材料上大多结合位点位于或接近材料表面,所以发展合成纳米结构分子印记材料有望真正解决传统分子印记遇到的困难,以便进一步推动分子印记技术的发展。本论文重点针对TNT分子识别与探测,运用纳米技术、表面功能化设计和分子印记技术等手段,发展制备具有高密度印记位点、高选择性、高亲和力和快速结合动力学的TNT印记芯-壳型纳米二氧化硅复合物壳层,同时,探索纳米结构分子印记材料和荧光发射能量转移对痕量目标分子TNT的识别特性和敏感机制。二氧化硅成为关注的热点是因为其是工艺研究中重要的媒介材料。二氧化硅材料功能化的提升促进了人们重新认识其性质的兴趣。丰富了我们对其基本性质地理解,提升了当前存在应用特性。通过化学修饰方法使单分散的二氧化硅凝胶纳米粒子作为表面纳米印记结构的印记模板分子的支撑体,因为二氧化硅纳米粒子支撑体同有机材料的支撑体相比拥有明显的优点:(a)二氧化硅表面可以修饰从而导致形成不同的硅烷化试剂,在这种无机物的结构中带有许多的功能基团;(b在二氧化硅支撑体的表面被修饰上功能基团是相对容易的反应,这点是不同于有机材料的支撑体;(c)在有机溶剂里二氧化硅支撑体并不溶胀;(d)对有机溶剂的化学惰性。(e)二氧化硅拥有很高的热稳定性;(f)粒径和分散性可控。拥有一致粒径和形状的二氧化硅不仅在处理动态行为和粒子体系稳定性的物理化学领域得到的广泛的应用,而且在分离、催化、陶瓷、涂料和照相的感光乳液等工业上的应用。单分散二氧化硅粒子是在混合了醇、水和氨水的条件下通过硅烷化试剂的水解和缩合反应制备。实验结果显示在以氨水为催化剂、乙醇为溶剂正硅酸乙酯、水为反应物料通过水解和缩合反应可以制的粒径和单分散的二氧化硅纳米粒子,有许多关于这个反应体系的机理研究。然而,这里通过对影响因素的研究,如反应物TEOS、氨水和水的量以及反应温度的变化来获得合适粒径和单分散的印记模板分子的支撑体二氧化硅纳米粒子。随后,用两步化学修饰过程得到丙烯酰胺覆盖的二氧化硅粒子。首先,在氮气气氛中惰性溶剂里APTS通过共价耦联到二氧化硅纳米粒子的表面。然后,富含氨丙基的二氧化硅粒子表面通过与丙烯酰氯的酰化反应,得到表面富含丙烯酰胺功能单体的二氧化硅粒子。修饰的粒子性质和形貌分别用SEM、TEM和FT-IR进行表征。以TNT分子为目标分析物,一种在二氧化硅纳米颗粒表面修饰功能单体诱导策略对TNT分子高密印记。结果进一步证明了二氧化硅表面乙烯基单体层不仅能够在二氧化硅表面通过乙烯基单体和功能单体的引导印记聚合,而且通过TNT分子与功能单体层电荷转移形成复合物驱使TNT模板分子形成聚合物壳层。这两种基本过程导致形成核-壳厚度一致的TNT印记的纳米颗粒,所得的芯-壳型分子印记聚合物的壳厚可调且拥有高密度的有效识别位点。一种渐进式聚合反应被设计用来在二氧化硅表面制备可调控高质量TNT印记的聚合物。同传统的印记聚合物粒子相比,拥有高密度表面印记的聚合物壳层能够明显地提高结合量,加速结合动力学和识别的选择性。通过壳厚的变化与最大饱和结合量的关系,得到分子印记聚合物对最大TNT结合量的壳厚临界值。这些将提供进一步的洞察分子印记有效壳的厚度和印记材料的形式。这一结果不仅能够在分子印记技术方面的应用而且可以成为一种的新的在二氧化硅纳米粒子支撑体上制备聚合物涂层方法。以TNT分子为目标分析物,在液相和气相环境中发现一种用荧光发射能量转移策略对2,4,6-叁硝基甲苯(TNT)超痕量探测。这种基于荧光发射能量转移的纳米粒子传感器是在二氧化硅纳米粒子表面通过用硅烷化耦联反应使氨基和荧光染料分子共价反应合成的。实验结果已经证实了富电子的氨基配合物(3-aminopropyltriethoxysilane,APTS)能够通过形成电荷转移复合物作用特定的结合缺电子芳香苯环硝基化合物TNT,在二氧化硅粒子表面所得到的APTS-TNT复合物能够强烈的吸收染料荧光分子的发射光。这两个在二氧化硅表面上发生的基本过程是通过荧光发射能量转移淬灭机理导致对TNT分子快速地、选择性响应。二氧化硅纳米粒子自组装荧光阵列是通过在刻蚀阵列阱的硅片上自组装形成,这种纳米粒子荧光阵列在超痕量的TNT溶液中能够很敏感的探测到大约皮克级的TNT,同样在汽相中能够探测到数个ppb的TNT蒸气。同时,通过高效的荧光淬灭可以选择性的区分TNT与其他几种硝基化合物。这里报道的结果将为其他目标分析物如金属离子、生物分子检测提供一种新颖的、基本的纳米传感器设计方法。
郑爱萍[9]2003年在《微生物来源的防病、杀虫相关因子的分离与功能解析研究》文中进行了进一步梳理微生物可作为研究生物学的理想材料,同时由于具有代谢能力强、功能各具特色、产物多种多样,在农业、医学、食品以及许多工业中的应用也历来受到人们的关注。特别是农用微生物资源,可进行微生物农药、微生物肥料的产业化。随着经济的发展,人们对绿色无公害食品的需求越来越大,化学农药的一些高残留、高毒性、破坏生态环境的特点被认识到,基于此种状况,所以有必要探求新型的生物农药,以期能为保持生态平衡,保护人类的健康,为农业可持续发展打下基础。 本研究在四川生态条件下,针对特有的农用微生物资源,进行了防病、杀虫因子的分离以及结构解析研究,希望能为四川生态条件下微生物源农药的产业化提供条件和理论基础。主要结果如下: 一、农用抗生素的研究 1.从土壤中筛选土壤链霉菌,通过反复纯化,以水稻稻瘟病、水稻纹枯病病原菌作为指示菌,在PDA平板上与病原菌进行对峙培养,共获得150株对病原菌有不同程度抑制作用的链霉菌株。根据对病原菌的抑制效果,共获得4株链霉菌菌株,分别编号为S-21、S-25、S-26、S-34。 2.通过生理、生化检测和形态鉴定,S-21、S-25、S34、S-26菌株分别被确定为Streptomyces flavescens、Streptomyces luteogriseus、Streptomyces lavendularectus、Streptomyces fradiae var.Sichuan。 3.抑菌谱、杀虫谱测定结果表明,菌株对14种病原菌具有不同程度的抑制作用,综合抑制效果,S-26对水稻病害和蔬菜病害病原菌具有比较明显的抑制优势,具有广泛的抑菌谱带,发酵菌液的上清液,饲喂害虫,利用发酵原液作为对照,S2-26、S2-25对于供试害虫具有较好的杀虫效果,特别是S-26处理后,草地蝗虫、十八星瓢虫、螨虫的校正死亡率均在82%以上,最高可达98.2%。 4.发酵液有效成分稳定性的检测结果表明,利用S2-26菌株在普通发酵培养基,收集发酵液,经过120℃30min,分别在PH8、PH6的作用,紫外线照射30min,发酵液与水稻纹枯病原菌拮抗作用,仍然具有强拮抗活性,抑菌圈直径为6.0-5.5cm,与对照差异不明显,表明S2-26的有效次生代谢产物具有稳定的特性。 5.发酵配方和发酵条件实验表明,菌株在碳源为10%淀粉、氮源为2%的花生饼粉,培养条件在28℃条件、转速为250r/min、5%接种量、起始PH为5时、加入优化培养基150ml、一级种子的培养时间为72h、发酵时间为144h的条件下,可以获得最好的抑菌效果,且整个发酵过程中以一次性加入各培养基成分为效果最好。 6.田间试验表明,应用上述优化配方进行发酵,收集发酵菌液,进行大田防治水稻纹枯病,田间防效达到50.2%,高出井冈霉素和清水对照,对茄十八星瓢虫试验表明,对瓢虫的防效达到78.5%。高于清水对照,并对平均结实个数和结实率具有促进作用,高于其它对照。针对编号为S一26的菌株并进行了发酵生物学特性的研究,并经过发酵产物的分离、纯化,通过IH一NMR、1 3C一MR、红外、紫外、质谱、H一HCOSY、H一CCOSY、HMBC等测定了asperufoside、pinoresino、eseuletin、magnolioside、52、536种化合物的结构,通过功能测定,52、S3化合物为功能性化合物,结构解析表明,是一类杀虫、防病的大环内醋类抗生素。经过叁维结构模拟和功能预测,该类化合物可能通过阻断虫体神经信号传导而达到杀虫效果的。二、芽抱类杀虫基因的研究1.本研究在四力}生态条件下,对芽抱杆菌进行分离筛选,共获得279株,经过特异引物 对基因型进行分析,结果表明107株菌株具有明显的多态性2.多态性分析表明,所分析的资源含有4种复合基因型的比例高,对鞘翅目有特异作用 的芽抱杆菌资源最多,聚类分析表明,具有十分多样的基因分布特点。3.通过生理生化检测和形态指标的测定,确定了其中为非Bt芽抱杆菌2、4一14、39、D3 菌株分别为刀acizzusfasrs成osus、刀aeszzus刀rmus、刀aeillus cereos、Baeillus me卯terium菌 类,确定了s、sL、不SS菌株分别为Bacillus thringglensis var tolworthi、Bacillus thringiensis var刀nitimus、Baeillus thringiensis var entomocidus、Bacillus rhingiensis var galleriae4类苏云金芽抱杆菌的分类地位。4.对2种D3、39芽饱杆菌基因进行测序分析、比较,结果表明,cry1Ab类基因与报道 的基因一致,cry1Ac、cry1C类基因与报道的基因核昔酸具有一定的同源性,分别为 87%、89%和78%,氨基酸序列比较:同源性分别为76.5%、79.8%、51%,不同菌株 种类之间cry IA。类之间核昔酸同源性为90%,氨基酸的同源性为85%。5.通过PcR克隆方法获得cry1Ab基因的全长序列。6.通过饲喂、小区实验,测定了菌株的杀虫谱和毒力方程。大田防效测定表明,该类与 所报道的cry基因具有一定同源性的菌株具有比很好的防治效果,最高防虫效果可达 到98%,显着高于对照和Bt悬浮制剂,并显示对鳞翅目、鞘翅目害虫较宽的杀虫谱。7.对cry类基因进行了定位和毒性蛋白质的分离、纯化,同时,还进行生物学特性等方 面的研究。叁、抑菌肤研究1.从黄瓜植株的根围土壤中分离到有拮抗性的细菌100多株。通过对峙法?
王志华[10]2007年在《基于分子印迹聚合膜的电化学传感器和生物传感器的研制》文中研究指明分子印迹聚合物(MIPs)以其具有模拟天然受体的分子识别能力,越来越成为一类重要的人工合成材料。在MIPs的研究中,分子印迹聚合物膜(MIP膜)的开发应用是最具吸引力的课题之一。MIP膜可以提供高选择性和稳定性的人工合成敏感膜,而电化学传感器具有设计制造简单、灵敏度高、价格低廉、容易实现微型化自动化等优点,尽管MIP膜的主要应用目前仍然是在分离领域,但将MIP膜用作识别元件构建新一代的电化学传感器和生物传感器已经有了初步的研究,并具有可观的应用前景。传统印迹方法所得的印迹膜,模板分子洗脱困难,膜厚难控制,传质和电子传递速度慢,再生和可逆性差,这都给分子印迹膜在电化学传感器和生物传感器中的应用带来困难。因此寻找新的印迹基质和印迹方法以满足电化学传感器和生物传感器对敏感元件的要求具有重要的研究意义。而目前,有关结合位点的作用机理,聚合物的形态和传质机理仍然不够清楚,如何从分子水平上更好地理解分子印迹过程和识别过程仍需要进一步研究。另外,天然分子识别系统都是在水相中进行的,而以前的研究中,分子印迹和识别过程大多只能在有机相进行,如何利用特殊的分子间作用在水溶液或极性溶剂中进行印迹和识别,仍是一个难题。据此,本论文研究了叁类新基质在分子印迹技术中的应用,克服了传统印迹基质存在的困难,将分子印迹技术和电化学传感较好地结合起来,成功地构建了一系列以此印迹基质为敏感元件的电化学传感器和生物传感器,并对印迹和识别过程机理进行了初步的探讨,对水溶液中的印迹和识别进行了研究,主要内容如下:1.用邻苯二胺和间苯二酚的混合溶液作为单体,采用电聚合方式,首次利用电聚合膜在不同介质中的导电性能,构建了对杀虫剂2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)有选择性响应的分子印迹电化学传感器。用循环伏安法和交流阻抗技术研究了聚合膜的性质。除去印迹分子后,将印迹电极放在含有2,4-D的0.1mol/L的硫酸溶液中,2,4-D可以重新被选择性的吸附在电极表面,键合的量可以通过差示脉冲伏安法进行测定,响应在10min内达到稳定,线性范围为:1.8×10~(-4)-2.0×10~(-3)mol/L。该传感器具有长的使用寿命,良好的重现性(RSD=1.03)和可逆性。与传统电聚合膜相比,不再以铁氰化钾为探针分子,直接利用敏感膜本身的性质,操作简单,制备容易。模板分子和聚合物膜之间主要是氢键作用。2.采用苯酚作为电聚合单体,在金电极表面制备了检测茶碱的电容型化学传感器,并详细研究了其最佳制备条件,结合交流阻抗技术进行测量。这种传感器的基本原理是:传感器表面覆盖一层用电聚合法制备的分子印迹聚合物膜作为受体层,当加入分析物(模板分子)时,电容值会减小。该法可检测到的茶碱最大浓度为1.5×10~(-5)mol/L,且检测下限1.0×10~(-6)mol/L。与早期报道的电容型传感器不同,电聚合膜表面未用十二烷基硫醇处理也得到了满意的绝缘结果。一些结构类似物没有明显的干扰。传感器制备容易,检测快速。电极重现性很好,放置10天后,电极响应值可以达到原来的90%以上(RSD=10%)。3.以丙烯酰胺为功能性单体,N,N'-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂,次黄嘌呤为模板分子,在pH=13.5的强碱性溶液中采用循环伏安法合成了聚丙烯酰胺膜,以此为识别元件制备了次黄嘌呤电容型生物传感器,并用电化学阻抗技术表征了电聚合分子印迹膜的性能。在2~15μmol/L的范围之内,次黄嘌呤浓度的变化与电容的变化成线性关系。每次加入次黄嘌呤后响应约在5min后达到稳定,传感器制备容易,检测快速。与传统的聚丙烯酰胺膜不同,该膜在碱性溶液中制备,稳定性好,不易溶胀。4.席夫碱及其金属配合物,长期以来成为研究热点,主要源自它们所含C=N基团的功能性、与中心离子的配位作用以及电子效应等因素。它们可用作鳌合剂、稳定剂、催化剂和生物活性剂。酰胺化合物在结构上类似低肽化合物,可作为生物体的蛋白酶和氧化酶的模型化合物,在模拟研究生命过程的机制等方面起到重要作用。我们合成了水杨醛-半胱氨酸席夫碱,第一次利用席夫碱和金属离子之间强烈的的配位作用,在水溶液中制备了对重金属镉、铅离子选择性响应的印迹电化学传感器。印迹单层膜是由两种不同的成分组成,一种是水杨醛-半胱氨酸席夫碱,用于提供配体,形成识别位点,另一种是十二烷基硫醇,用于封闭未组装的金表面。将席夫碱用作分子印迹单体来测定金属离子,是一种新的尝试。模板金属离子可以被0.10mol/L的高氯酸/硝酸溶液完全洗脱,形成可逆的识别位点,响应在3min内达到稳定。将印迹膜保存在稀的金属离子溶液中,能够在某种程度上克服二维印迹中巯基单体在金表面横向扩散的普遍性问题,提高了印迹膜和识别位点的稳定性,响应更为灵敏,该印迹膜能够反复使用100次以上。(1)研究了水杨醛-半胱氨酸席夫碱与金属镉离子在乙醇水溶液中的电化学性质,计算了配合物的稳定常数.镉离子在印迹电极上的氧化还原反应是一个扩散控制的过程。印迹电极上,镉离子在两个浓度区间,5.00×10~(-7)~6.00×10~(-6)mol/L,6.00×10~(-6)~6.00×10~(-5)mol/L范围内与峰电流变化成正比,水杨醛.半胱氨酸(CSA)/Cd~(2+)的最佳比是2∶1。印迹自组装单层膜能够在Zn~(2+),Co~(2+),Mg~(2+),Ni~(2+),pb~(2+),Ca~(2+),Fe~(3+)等干扰离子存在的情况下对Cd~(2+)选择性响应。利用镉离子和氨基、羧基、羟基间可逆的配位键在单层膜中形成识别位点,是一种较为理想的印迹方法。(2)研究了水杨醛-半胱氨酸席夫碱与金属铅离子在乙醇水溶液中的电化学性质,计算了配合物的稳定常数。铅离子在印迹电极上的氧化还原反应是一个表面控制的过程。在印迹电极上铅离子在浓度区间3.00×10~(-7)~5.00×10~(-5)mol/L范围内与峰电流变化成正比,水杨醛-半胱氨酸(CSA)/Pb~(2+)的最佳比是2∶1。印迹自组装单层膜能够在Zn~(2+),Co~(2+),Mg~(2+),Ni~(2+),Cu~(2+),Fe~(3+)等干扰离子存在的情况下对pb~(2+)选择性响应。对印迹膜的性质,离子响应的电极过程机理,选择性,重现性,可逆性及寿命都进行了研究。5.采用紫外光引发原位聚合的方法制备了以聚偏氟乙烯管状微孔滤膜为支撑膜的锌离子配位分子印迹聚合物膜。该法制得的分子印迹聚合物膜有许多优点:由于它能形成金属配合物(特别是叁元配合物),空间结构更具特殊性,所以对模板分子选择性比较高;既克服了棒状或块状分子印迹聚合物聚合时间长和需要筛分的缺点,又缩短了洗脱时间,对结构类似物芦丁的选择性也进行了初步的研究。通过膜渗透实验表明,在一定浓度锌离子存在下,印迹膜对模板分子槲皮素表现出良好的渗透选择性。分别考察了阳离子和阴离子对印迹膜渗透模板分子的影响。本工作对分子印迹技术应用于实际样品中槲皮素的分离与富集具有重要意义。
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