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【摘 要】艾滋病被誉为传染病的“头号杀手”，从发现至今，人们一直在探索艾滋病的预防控制措施，HIV的实验室检测在艾滋病诊断、防治等有着极为重要的作用。随着分子生物学技术的飞速发展，HIV的实验室检测技术也在不断发展进步。为此，本文对艾滋病实验室检测技术及进展进行综述。
【关键词】HIV；检测；进展
艾滋病即获得性免疫缺陷综合征（AIDS），是由人类免疫缺陷病毒（HIV）感染机体所引起的免疫功能缺陷损伤的一类综合病患。自1981年在美国首先发现艾滋病病例至今，艾滋病在全球范围内迅速传播。艾滋病是一种目前尚无有效治愈办法、病死率极高的传染病，它在全世界的广泛流行已成为严重的公共卫生问题和社会问题。20多年来，实验室免疫学检测是诊断HIV/AIDS的主要依据[1]。HIV感染的早期发现、早期诊断是艾滋病预防控制工作的重要组成部分，只有发现传染源才能更有效地控制艾滋病传播。随着分子生物学技术的飞速发展，HIV的实验室检测技术也在不断发展。本文从HIV抗体、抗原、核酸及免疫功能等方面对艾滋病实验室检测技术及进展进行综述。
1、常用HIV抗体检测技术
常用的HIV抗体检测技术包括初筛试验（包括初筛和复检）和确证实验。
1.1 HIV抗体筛查试验
1.1.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）：适用于大批量标本的检测，可使用血液、唾液、尿液样品。ELISA的基本原理是将待测抗原或抗体先
固定于固相载体表面，再用酶标记的抗原或抗体与已被固定的相应抗
体或抗原发生特异性反应，加底物显色，用酶标仪测定结果。
该方法是筛查实验最常用的和最主要的筛查检测HIV抗体的方法。ELISA是国际上应用最广、HIV抗体初筛最常用的HIV血液筛查检测技术[2]。1985年美国FDA批准使用第1代ELISA检测试剂至今，几乎不用第二代试剂。目前国内外主要使用第三代双抗原夹心试剂，窗口期由10周缩短至3-4周。第四代ELISA试剂是最近几年发展起来的HIV抗原抗体联合测定试剂，可同时检测P24抗原和抗HIV-1/2抗体。其优点在于能同时检测抗原抗体，降低血液筛查的残余危险度[3]。国外文献[4]报道第4代HIV检测试剂可进一步将“窗口期”缩短4-5天。国产第4代HIV检测试剂比第3代HIV检测试剂灵敏度高，国产第4代HIV检测试剂在血液筛查过程中可发现HIV感染窗口期标本[5]。但由于抗原抗体均包被在微粒上，使灵敏度提高，同时也使特异性降低，引起假阳性。如生物梅里埃HIV第4代ELISA检测试剂，假阳性显著升高[6、7]。第3代HIV试剂敏感性较第4代试剂存在漏检现象[8]。郑晓红等[9]研究显示，在检测早期感染的样本时，第4代HIV试剂的反应性更强，而降低了部分特异性的第4代试剂仍不失为一种较好的筛查高危人群样本的检测试剂。
1.1.2 化学发光或色度荧光试验
这类试剂采用发光或荧光底物，既可检测抗体，也可联合检测抗原抗体。HIV抗原或抗体包被于固相载体，加入待检样品和酶或荧光标记的HIV抗原或抗体，加发光或荧光底物，用发光或荧光仪测定结果。有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定。具有灵敏度高、准确、重复性好、线性范围宽、安全无毒、无放射性污染等优点，尤其是该方法反应快速，每个测试仅需28min，非常适合夜间急诊，但同时也有一些不足，比如假阳性率较高，要慎重对待[10、11]。
2.1.2 快速检测（RT）试验
这类试验简便快速，适合于急检测、门诊急诊检测，一般可在10-30分钟内可得出结果。
2.1.2.1 明胶颗粒凝集试验（PA）
将HIV抗原致敏明胶颗粒作为载体，与待检样品作用，混匀后保温。当待检样品含有HIV抗体时，明胶颗粒与抗体发生凝集反应，根据明胶颗粒凝集情况判定结果。该方法是一种简便快速筛选的方法，但灵敏度和特异性较低，且不如ELISA试验，故在献血及大型医院不作为常规检测方法。乔恩发等[12]报道，微量明胶颗粒凝集试验检测滤纸片干血斑HIV-1抗体的方法，可信度高、操作简便成本低，为大规模开展HIV-1流行病学调查提供了另一种良好的实验方法。
2.1.2.2 免疫渗滤试验
斑点ELISA和斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验：均以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原点状固定在膜上，加待检样品。阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。反应时间在10分钟以内。有效试验的质控点必须显色。此试验完成操作需要数个步骤，检测时间较长，试剂价格高，使用者较少。
2.1.2.3 免疫层析试验
以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原线状固定在膜上，待检样品（血液或唾液）沿着固相载体迁移，阳性结果在膜上抗原部位显示出有色条带。有效试验的质控带必须显色。快速免疫层析法试验具有试剂无需冷藏、步骤简洁、无需任何仪器设备等特点，适合用于临床侵入性检查前、紧急输血、现场调查等需即刻报告的情况及缺乏仪器设备的边远地区使用[13]。
2.1.2.4 艾滋病唾液检测
2011年5月，国内首个“HIV（1+2型）”口腔黏膜渗出液抗体检测试剂盒（DotELISA法）获准上市，该检测试剂采用先进的免疫渗滤法，经国内多家权威临床单位的临床考核表明，该试剂与进口的HIV抗体酶联免疫试剂阳性符合率达99.09%、阴性符合率达99.79%和总符合率99.61%，其灵敏度要比国外同类产品高出10至100倍[14]。另，王倩等[15]报道，DotELISA法检测唾液HIV与法国生物梅里埃公司生产的HIV诊断试剂盒检测结果比较阳性符合率达98.78%、阴性符合率达100%和总符合率99.50%。与传统ELISA法相比，操作简便、快速，30分钟内即可观察结果，且不需酶标仪，无创伤，极大降低了被检测者和医护人员受感染的风险。适合于适合基层医院及大规模人群初筛使用，尤其适合于个体检测，末来，它也有望进入家庭，成为人们自我检测艾滋病的一种方式。当前，利用人体的唾液、尿液标本进行艾滋病检测排查，再结合常规的血液标本检测，已成为全球HIV监测的发展趋势。
2.2 确证试验
HIV抗体筛查呈阳性反应的标本由于存在假阳性的可能，必须作确认试验。其方法包括：免疫印迹试验（WB）、条带免疫试验（LIA）、放射免疫沉淀试验（RTPA）及免疫荧光试验（IFA）等。
2.2.1免疫印迹试验：WB是目前最特异、国内最常用的证实HIV感染的方法，也是《全国艾滋病检测技术规范》中首选确认方法，是确证HIV感染的金标准。WB试验基本原理是将提纯的HIV颗粒裂解为不同的组分处理后，经聚丙烯酸胺凝胶使病毒蛋白质按分子量大小分开，然后在电场力作用下转移到硝酸纤维膜上，加入待测标本进行测定。待测标本中存在的HIV抗体在纤维膜上的相应抗原结合，洗去游离的抗体，然后加入抗人IgG酶结合物并温育，洗涤后加入酶作用底物进行显色，若在相应的蛋白质部位出现肉眼可见的有色条带，根据是否出现色带及色带出现的位置判断结果。
WB实验方法比ELISA复杂，要求高，且必须在有资质的HIV抗体确证实验室进行。该方法的准确率大于99%，假阳性率约为0.0006%，，其判断为假阳性的可能性几乎为零[16、17]。但WB仍有一定的局限性，张亚兰等[18]报道，对ELISA和（或）胶体法筛查阳性，WB实验确证阴性的标本，进行抗体追踪复检，存在漏检；存在漏检可能是标本处于窗口期感染或试剂反应膜问题。WB试验作为HIV抗体确证方法，在不确定的标本判定上存在一定缺陷，对确定结果为不确定的标本，引起足够的重视[19、20]。朱厚宏等[21]报道，国内外研究表示，所有标本HIV初筛复检阳性后，会有4%－20%的标本确认结果为“HIV抗体不确定”，而且很大一部分的“不确定”标本都与WB条带型为P24的条带有关。黄良光[22]报道，比较条带免疫印迹法（LIA）及病毒载量法（VL）能有效鉴别WB检测HIV抗体不确定结果。因此，对于不确定的结果除应按规范要求结合流行病学资料进行随访外，同时可用LIA及VL法进行鉴别。
2.2.2 条带免疫试验：条带免疫试验的原理与WB试验基本相同，区别仅在于条带免疫试验条膜上的抗原用重组抗原或合成肽抗原替代WB的裂解物抗原。该实验的优点是检测时抗干扰强，特异性高，克服了WB实验中使用病毒裂解产物可能产生的同相载体上某些重要抗原不足；缺点是合成抗原不能糖基化，在某种程度上影响了HIV抗原检测抗体的能力。
2.2.3 放射免疫沉淀试验（RIPA）
RIPA试验是将放射性同位素标记的氨基酸加到感染HIV的细胞培养基中，若待检标本中有HIV抗体，则同位素标记的HIV蛋白与之结合产生沉淀，沉淀物用配套的缓冲液和十二烷基硫酸（SDS）洗脱，即可将病毒抗原分离，最后病毒蛋白用放射自显影鉴定，同时用已知的分子标记物比较。此方法敏感性和特异性比WB实验方法高，但费时、成本高、技术难度大，且需使用放射性同位素，难以普及推广。
2.2.4 免疫荧光试验（IFA）
该方法是将感染了HIV的淋巴细胞固定在玻片上作为HIV抗原，将被检测者血清加入玻片，如被检测者血清中含有HIV抗体，则可以与固定在玻片上的HIV抗原结合形成抗原抗体复合物。进一步加入荧光标记的抗人IgG，荧光标记的抗体IgG使抗原抗体复合物着色，通过荧光显微镜可观察到着色的细胞，此时即可断定被检测者血中是否存在HIV抗体，进而诊断是否感染了HIV。IFA法成本低、操作简单，曾被FDA推荐用于WB不确定样品的诊断。但检测需要昂贵的高倍荧光显微镜，结果判断易受主观因素影响，不宜普及推广。
3、HIV P24抗原检测
机体感染HIV后，P24抗原是最早能从血清中检出的病原学标志，一般在HIV感染后2-3周就可检测出，1-2月左右进入抗原高峰期，然后随着HIV抗体的产生形成抗原抗体复合物。由于抗体的中和作用，P24抗原浓度不断下降直至无法测出时，标志着HIV感染者进入无症状期，当P24抗原再度在血液中增长，意味着病毒的大量繁殖和免疫系统的破坏，提示感染者将或已经进入艾滋病期[17]。随着P24抗原检测灵敏度的不断提高，P24抗原的检测逐渐从主要用于HIV抗体在窗口期辅助早期诊断，发展到用于病毒裁量的测定。
HIV P24抗原检测主要有酶联免疫吸附试验（ELISA）、放射免疫分析（RIA）、免疫荧光分析技术（IFA）等检测技术，其中以ELISA为基础的测定P24技术是HIV感染最为敏感的常规方法。目前，商品化的P24抗原检测试剂盒都是依据夹心ELISA原理。首先以P24单克隆抗体包被酶联检测板，加入待检标本孵育，待检标本中若存在P24抗原与包被抗体形成抗原抗体复合物，再依次加入生物素化的抗HIV多克隆抗体、化的辣根过氧化物酶和反应底物显色，最后用酶标仪上读结果。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆此法简便易行，但灵敏度较低，使用第4代ELISA试剂检测P24抗原，其灵敏度只有20-100pg/ml[23、24]。正是因为ELISA本身的局限性以及P24抗原检测在HIV-1诊断中的重要性，近几年来国内外一直在研究建立高灵敏度检测P24抗原方法；先后研发了如下新的P24抗原检测方法[23]：（1）免疫复合物解离P24抗原测定法（ICD）：常用的方法是用热处理将血清中免疫复合物解离后，再进行测定，从而提高检测血清中P2中抗原的敏感性和阳性检出率。（2）信号放大增强ELISA法：该方法是利用生物素标记的Tyram ide扩增信号，然后使用偶合有荧光素的亲和素进行检测，其灵敏度远远高于普通ELISA。（3）超敏感酶免测定法（VEI）：该方法基本原理是利用高亲和力抗体浓缩富集P24抗原，然后进行检测。该法灵敏度高、特异性强、操作简单、成本低廉，检测阈值为0.24pg/ml，比HIV抗体的ELISA检测可提前12-20d检测到P24抗原。（4）免疫吸附电镜法（ISEM）：该法是将抗原抗体的特异性与电子显微镜的高分辨相结合，对病毒颗粒直接特异性检测的1种方法，灵敏度高，但需昂贵的仪器，且操作复杂，应用前景仍有一定距离。（5）纳米粒子生物条形码检测技术（BCA）：该法是根据免疫学原理，应用特异性抗P24单克隆抗体，特异性结合样本中的P24蛋白抗原，通过生物条形码DNA准确而特异性放大，间接检测HIV-1 P24抗原。该法比ELISA法敏感150倍，提前3d检出P24抗原。BCA法不失为一种早期检出P24的较为敏感方法。另据董华凰等[25]报道，采用金纳米探针结合PCR凝胶电泳法对HIV-1 P24抗原进行检测，方法的最低检测限为1pg/ml，技术流程与ELISA法相同，但降低了实验的复杂性，缩短了检测时间，敏感性比ELISA法提高了3个数量级，提高了在基层实验室检测的可能性。
4、HIV核酸检测
HIV核酸检测包括定性检测及定量检测，可用于HIV感染的辅助诊断、病程监控、指导治疗方案及疗效判定、预测疾病进展等。定性检测通常使用PCR或RT-PCR技术。定量检测常用HIV病毒载量检测，目前常用的方法有：反转录PCR实验（RT-PCR）、核酸序列扩增实验（NASBA）、分支DNA杂交实验（bDNA），这三种技术均由核酸提取、扩增或信号放大、定量检测三部分组成[3]。但目前进口病毒载量试剂成本较高、仪器昂贵、难于运用到常规检验工作中。随着分子生物学的发展而发展起来的荧光实时定量PCR技术（FQ-PCR），从诞生起，就得到广泛应用；该方法可以检测血浆病毒载量，也可以检测血液中单个核细胞的前病毒载量。2002年4月我国批准了第1个HIV荧光PCR检测试剂盒。马鹏飞等[26]报道，NASBA和国产FQ-PCR两种检测方法在103-105拷R/ml范围内有着高度的相关性，使用国产实时荧光定量核酸检测试剂可以初略定量血浆中HIV RNA含量，且国产试剂廉价，适合推广应用。
5、CD4+和CD8+T淋巴细胞检测
目前，CD4+和CD8+T淋巴细胞计数的方法分为两大类，一类是应用流式细胞仪测定法，另一类是非流式细胞仪测定法。常用的淋巴细胞计数检测方法为自动检测方法，包括流式细胞仪（主要有多平台法和单平台法）和专门的细胞计数仪。流式细胞仪检测方法：（1）双平台方法是一种细胞群体的绝对计数方法。这种方法最大的缺点在于操作步骤复杂，操作人员多、费时，不同实验室差异很大，因此，很难将变异水平减小到最低。（2）单平台方法即应用三色、四色流式试剂配以内参绝对计数微球，加上流式细胞仪淋巴细胞亚群获取和分析软件，一步即可获得T细胞亚群的相对数（百分比）和绝对数。单平台法最大程度地减少了多个仪器检测带来的检测误差，细胞绝对计数结果的重复性和准确性都得到了良好的保证。文献[27]报道，在室温（18-25℃）条件下，抗凝全血存放24、48、72小时与存放6小时相比，CD4、CD8细胞绝对数变化均无差异（P>0.05），但血样处理后存放48小时，CD4细胞数无变化，其CD8细胞数变化有显著差异（P<0.05）；其CD4/CD8 细胞比例会发生变化，提示，一般情况下，样品应按《全国艾滋病检测技术规范》要求需在48小时内完成检测，如遇特殊原因时，样品采集后室温可延长至72小时。HIV病毒侵入体内主要侵犯CD4T淋巴细胞，通过CD4T淋巴细胞的技术对于诊断HIV感染状态至关重要。CD8T淋巴细胞检测主要与CD4T淋巴细胞联合来评价患者免疫状态，当CD4T/CD8T<1时（正常比值>2）则提示免疫状态不佳，比值越低说明患者免疫缺陷越严重[28]。
6、HIV-1耐药检测
HIV-1耐药检测的方法可分为两大类，一类是基因型检测法，另一类是表型检测法。HIV-1耐药基因型检测法基于对耐药相关基因突变的检测，利用耐药基因型解释系统判断是否耐药以及耐药的程度；HIV-1耐药表型检测法基于体外培养技术，通过检测抑制病毒生长所需的药物浓度（IC50或IC90），并与参考株进行比较，判断病毒对药物的敏感程度。常用的HIV-1耐药检测方法为基因型检测法，通常使用逆转录PCR（RT-PCR）和测序方法，其优势在于周期短、操作简便、重复性好，且检测成本较低。
艾滋病在我国发现、流行已有三十年，随着感染者不断增加、感染人群的变化和临床病人的日益增多，艾滋病检测工作量逐渐加大，新的监测和检测需求也不断增加，研发灵敏度高、特异性高、操作简便、检测快速、成本低廉的HIV实验室检测技术是今后持续发展的主要方向，使其能满足目前艾滋病检测的实际需要，缩短检测的窗口期，避免漏检、错检，有助于HIV感染的早期诊断、疾病进展监测、抗病毒疗效观察、耐药监测及科研工作，更有效地预防与控制艾滋病，保护广大人民群众的身体健康。
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论文作者:邓睿荣
论文发表刊物:《航空军医》2015年5期供稿
论文发表时间:2015/12/9
标签：抗原论文; 抗体论文; 试剂论文; 免疫论文; 方法论文; 艾滋病论文; 标本论文; 《航空军医》2015年5期供稿论文;